JPS5832592B2 - 新抗生物質バクトロポンおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクロモバクテリウム属に属する微生成を培養し
て、その培養物からえられる新抗生物質バクトロポン（
Ｂａｃｔｒｏｐｏｎｅ ）に関し、また、バクトロポン
の製造法に関するものである。

本発明者らは、新潟県五泉市の土壌試料より分離された
細菌でＢＭＦ３４−ＥＧ２の番号が付された菌株を培養
してバクトロポンを蓄積せしめ、その培養物から新規物
質バクトロポンを採取することができることを発見した
。

本発明のバクトロポンは諸種の細菌、特にダラム陰性菌
の発育を強く阻止し、毒性の低い物質であることから、
化学療法剤として諸種の感染症の治療に用いられる新抗
生物質である。

第１の本発明にかかる新抗生物質バクトロポンの性状は
次に示すとおりである。

バクトロポンは無色結晶で、分解点は２４８−２５０℃
である。

光学活性を示さず、元素分析値はＣ５５，７１％、Ｂ３
．４０％、 Ｎ９．０７％、０３２．１９％を示し、Ｃ
７Ｈ３ＮＯ３の理論値（Ｃ５５，６３％、Ｂ３．３４％
Ｎ９．２７％、０３１．７６％）によく一致する。

この分子式は高分解能マススペクトル（実測値ｍ／ｅ
１５１．０２５４、理論値ｍ ／ ｅ １５１．０２６
９）によっても証明された。

臭化カリ錠で測定した赤外部吸収曲線は第１図に示すご
とくであり、３４５０．３２５０，２８００，１６６０
゜１６２０．１４８０，１４６５，１４００゜１３４０
．１２８０，１１７５，１１４５゜１０９５．１０１５
，９４０，８４０，８２０゜７９５．７６０．７０５．
６７０ｃＩｒＬ−’ に主なる吸収極大を有する。

紫外部吸収曲線は第２図に示すごとくであり、メタノー
ル溶液中で２１９（Ｅ１％１２２０） 、 ２５２（４
６０） 、 ２６０（肩）、２８０（肩）、２８３（４
３０）。

２９０ｎｍ（４００）に、０．ＩＮＨＣＡ含有９０％メ
タノール溶液中で２０６（８１％１４００）。

１ｃｒｒＩ。

２５２（５４５）、２６０（肩）、２８０（肩）、２８
３（４２０）、２９０ｎｍ（４２０）に、また０、ＩＮ
ＮａＯＨ含有９０％メタノール溶液中で２２０（肩）
、２３７（Ｅ１％１２００）、２６４ｃｒｒＬ （２９０）、２７３（肩）、２９６ ｎｍ （３７０）
に吸収極大を有する。

重ジオキサン溶液中で測定したプロトンの核磁気共鳴（
６０ＭＨｚ）はδ６．７２ （ＩＨ、ｄｄ、Ｊ＝２ 、
９Ｈｚ ） 、 ６゜７４（ＩＨ，ｄ 、Ｊ＝２Ｈｚ
）、７．４６（ＩＨ，ｄ 。

Ｊ＝９Ｈｚ）および６．５−８ｐｐ５−８ｐｐ巾広い）
にシグナルを示す。

バクトロポンはメタノール、エタノール、アセトン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド
、アルカリ性の水などによくとけ、酢酸エチル、酢酸ブ
チルなどにとけるが、水には殆んどとけない。

ファスト・ブルーＢ１ペンタシアノアクオフエリエート
、ペンタシアノアンミンフェロアート、塩化第二鉄（橙
色）、塩化第二銅（暗緑色）などの諸反応に陽性で、ニ
ンヒドリン、レッド・テトラゾリウム、ブラデイなどの
反応には陰性である。

バクトロポンはシリカゲルの薄層クロマトグラフィー（
薄層板：メルク社製） Ａｒｔ５７２１、展開溶媒：ク
ロロホルム−メタノール、４：１容）でＲｆＯ，４０を
示す。

以上の結果から、バクトロポンは既知抗生物質とは明ら
かに区別され、下記の構造を有する新抗生物質であるこ
とが確認された。

新抗生物質バクトロポンの栄養寒天培地上での各種細菌
に対する最低発育阻止濃度は第１表に示すとおりである
。

バクトロポンは、苛性ソーダで中和した水溶液をマウス
の静脈内に投与して、２００■／ｋｇで全く毒性を示さ
ない。

第２の本発明は、クロモバクテリウム属に属するバクト
ロポン生産菌を、栄養源を含有する培地中で培養してそ
の培養物中にバクトロポンを生産せしめ、培養物からバ
クトロポンを採取することを特徴とする新規抗生物質バ
クトロポンの製造法を要旨とするものである。

本発明において用いるバクトロポン生産菌の一例である
細菌ＢＭＦ３４−ＥＧ２株を工業技術院微生物工業技術
研究所に、昭和５３年１２月２６日保管委託申請し、寄
託番号は微工研菌寄第４７６９号である。

この菌株の菌学的性状は次に示すとおりである。

ＢＭＦ３４−ＥＧＺ株の菌学的性状 （ａ）形 態 （１）細胞は桿菌で、大きさは１．０〜１．２Ｘ２．０
〜４．０ミクロン （２）細胞の多形性は、特にみとめられない。

（３）運動性を有する。

鞭毛の着生状態はおおむね極鞭毛であるが、まれに側鞭
毛様のものもみとめられる。

（４）胞子はみとめられない。

（５）ダラム染色は陰性である。

（６）抗酸性を有しない。

（ｂ） 各培地における生育状態（肉汁ゼラチン穿刺
培養のみ２０℃、及び３０℃培養。

他は、すべて３０℃培養。

）（１）肉汁寒天平板培養 コロニーは円形で半球形に隆起しており、辺縁は平滑で
ある。

表面は平滑で光沢を有する。

培養後２４時間ぐらいまでは半透明のコロニーもみられ
るが、培養が進むにつれてすべて不透明にたり、粘稠を
有するようにはる。

コロニーの色は紫色を呈するが、拡散性色素はみとめら
れはい。

（２）肉汁寒天斜面培養 接種線にそって、一様に良く生育する。

表面は平滑で光沢を有し、辺縁は平滑である。

紫色を呈す□□□Ｓ、溶解性色素はみとめられない。

（３）肉汁液体培養 菌は培地全体に一様に生育し、培養後２日目から培地表
面に、試験管壁にそって紫色のリングを形成する。

又無色の沈澱が培養後２日目にみとめられ、培養後５日
目頃から紫色となる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０℃培養では、菌は穿刺線にそって同心円状に生育し
、液化は培養後３日目頃から始まり、その型は管状であ
る。

３０℃培養の場合液化は培養後７日目に陽性であった。

（５）リドマス・ミルク 培養後３日〜５白目頃から凝固が始まる。

凝固は非常に弱く、ペプトン化はこれと平行して培養後
３日目頃から始まり、６日目にはほぼ完了する。

（ｃ）生理学的性質（（ＩＯＬ（１４）を除きすべて３
０℃培養） （１）硝酸塩の還元：硝酸塩より亜硝酸塩を生成する。

（２）脱窒反応（駒形らの方法１）によった）：陽性。

ガスの発生はなし。注１） Ｋｏｍａｇａｔａ、に、
、Ｈ，ｌ１ｚｕｋａ、ａｎｄＭ。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ ： Ｊ 、Ｇｅｎ 、Ａｐｐｌ
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、 。

１１．１９１（１９６５） （３）ＭＲテスト：陰性。

（４）ＶＰテスト：陰性。

（５）インドールの生成：陰性。

（６）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天培地による）：陰性
。

（７）デンプンの加水分解：陰性０ （８） クエン酸の利用： Ｋｏｓｅｒの培地、Ｃｈ
ｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地ともに生育する。

（９）無機窒素源の利用（硝酸ナトリウム及び硫酸アン
モニウムを用いた。

）：前者の利用はみとめられなかった。

後者についてはこれを利用し、生育した。

（１０） 色素の生成（ＫｉｎｇＡ及びＢ培地を用い
た）いずれの培地上でも、菌体は紫色を呈する。

溶解性色素は、Ｋｉｎｇ Ａ培地で極くわずかｆＬ黄色
味〜黄茶色味をおび、ＫｉｎｇＢ培地では黄色味〜黄茶
色味をおびる。

１υ ウレアーゼ（Ｃｈｒ １ｓｔｅｎｓｅｎの尿素培
地を用いた）：陽性と考えられるが非常に弱い。

（１２１オキシダーゼ：陽性 （１３）カタラーゼ：陽性。

ａ→ 生育の範囲：生育温度範囲は１２乃至１３〜４０
℃、最適温度は２７〜３０℃附近である。

生育ｐＨ範囲はおおむね５．０〜９．０１最適ｐＨは５
．０〜８．０である。

ａ■ 酸素に対する態度：好気性（通性嫌気性）である
。

（ＩＥ９０−Ｆテスト（Ｈｉ ｇｈ Ｌｅｉｆｓｏｎ法
による）：発酵型である。

卸 糖類からの酸およびガスの生成（培地はペフトン水
ヲ用１．＊） ： Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、
Ｄ−フラクトース、トレハロースから酸の生成がみとめ
られた。

グリセリンの場合は、培養後１０日白目に酸の生成がみ
とめられた。

ガスの発生は、いずれの糖からもみとめられなかった。

以上の性状を要約すると、ＢＭＦ３４−ＥＧＺ株はダラ
ム陰性の通性嫌気性桿菌で極鞭毛を有し、又、コロニー
は紫色を呈する。

これらの性状を、バーシーズ・マニュアル・オブ・デタ
ー□ネーテイブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第８版を参照して検討する
と、ＢＭＦ３４−ＥＧ２株はクロモバクテリウム（Ｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属すると考えられる
。

又、種を検索すると、３７℃ですみやかに生育すること
、あるいは糖からの酸の生成パターン等から、クロモバ
クテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ；ＢｅｒｇｅｙｓＭａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ、第８版、３５５頁）があげられる。

最適ｐＨが記載よりやや酸性側に寄っている点を除くと
、ＢＭＦ３４−ＥＧ２株はクロモバクテリウム・ビオラ
セウムとよく一致した性状を示した。

よって、ＢＭＦ３４−ＥＧ２株をクロモバクテリウム・
ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉ
ｏｌａｃｅｕｍ）ＢＭＦ３４−ＥＧ２と同定した。

細菌は人工的に、また自然界で変異をおこしやすいが、
本発明にいうクロモバクテリウム・ビオラセウムＢＭＦ
−３４−ＥＧ２はそれらの変異菌のすべてを包括する。

本発明にいうこれらの菌種は、バクトロポンを生産して
本菌種およびその変異菌と明確に区別されたい菌はすべ
てこれを包含する。

本発明のバクトロポンの製造法を実施するに当っては、
ＢＭＦ３４−ＥＧ２株の胞子または菌糸を栄養源含有培
地に接種して発育させることによってバクトロポンを含
む培養物かえられる。

好気的に条件が好ましい。

栄養源としては細菌の栄養源として公知のものを使用で
きる。

例えば市販されているペプトン、肉エキス、コーン・ス
チープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキ
スＮＺ−アミン、カゼインの氷解物、硝酸ソーダ、硝酸
アンモニア、硫酸アンモニアなどの窒素源、および市販
されているグリセリン、蔗糖、澱粉、グリコース、マル
トース、糖蜜などの炭水化物、あるいは脂肪ｆＬとの炭
素源と食塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウ
ムなどの無機塩を使用できる。

その他必要に応じて微量の金属塩を添加することもでき
る。

これらのものは生産菌が利用し、バクトロポンの生産に
役立つものであればよく、公知の細菌の培養材料はすべ
て用いることができる。

バクトロポンの大量生産には液体培養が好ましく、培養
温度は生産菌が発育し、バクトロポンを生産する範囲で
適用しうるが、殊に好ましいのは２０〜３５℃である。

培養は普通バクトロポンが充分蓄積するまで続けられる
。

例えばグリセリン２％、クルコース１％、肉エキス０．
５％、ペプトン０．５％、食塩０．５％の液体培地（ｐ
Ｈ７，０）にＢＭＦ３．４−ＥＧ２株の斜面培養から胞
子および菌糸を接種し、２７℃で好気的に振盪培養を行
なうと、培養１日日から目的とする抗生物質の蓄積が見
られた。

バクトロポンの定量法は、試験菌として大腸菌（エシェ
リヒア・コリに−１２）を使用する通常の円筒平板法に
よって行たう。

バクトロポンの結晶１０μｇ／縦の水溶液は通常径２０
朋程度の阻止円を示す。

バクトロポンの生産のためのクロモバクテリウム・ビオ
ラセウムＢＭＦ３４−ＥＧ２株の培養に当っては、上記
の振盪培養のほかに、一般に微生物の通気攪拌培養に用
いられるジャー培養器、または大型のステンレス・スチ
ール製タンク培養槽はとも大量生産のために使用される
。

大量培養の場合には、上記液体培地中で、２０〜４０時
間振盪培養した培養液を種培養とし、これを１〜２％容
接種するのが好ましい。

バクトロポンの生産菌の培養液からバクトロポンを抽出
するには、ｐＨ５以下の酸性で酢酸エチル、酢酸ブチル
、ブタノールなどを使用する溶剤抽出法、または活性炭
はとを吸着剤として使用する吸着法、または沈澱法はと
によって行はわれる。

目的とするバクトロポンは通常培養物の沢過残渣にも存
在するので、培養物から涙過することりく碑軒上記の溶
剤で抽出する方法が最も有効である。

濾過する際には、好ましくは微アルカリ性で行えば殆ん
どの抗生物質の済液に移行する。

バクトロポンの酢酸エチルと水における分配は次表に示
すとおりである。

従って、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノールはどの溶
剤で培養物中より抗生物質を抽出するにはｐＨ５以下の
微酸性で行ｆ、にわれ、好ましくはｐＨ２〜４である。

さらに溶剤に抽出された抗生物質はｐＨ７以上の微アル
カリ性の水によく転溶される。

そこでこの転溶法を繰り返すことにより高純度の抗生物
質をうろことができる。

この溶剤転溶法によるバクトロポンの抽出は最も効率の
よい方法で、水抽出の際、その容量を減少することがで
きるのでバクトロポンの濃縮液をうるにも便利である。

活性炭に吸着した抗生物質は微アルカリ性のメタノール
、アセトンまたはそれらの含水溶液によって抽出するこ
とができる。

また、培養物中の抗生物質をｐＨ１〜４の酸性で沈澱せ
しめ、沖過してえられる残渣より活性炭の場合と同様の
溶剤で抽出することができる。

培養物中のバクトロポンはこれらの抽出方法を繰返し、
または適宜組合せて抽出することができ、その抽出液を
適当た方法で濃縮または乾燥することによってその粗粉
末または粗結晶をうろことができる。

この抗生物質の粗粉末または粗結晶は必要ならば通常の
シリカゲルを用いる塔クロマトグラフィーまたは酢酸エ
チルｆ、ｒどの溶剤と水を用いる向流分配法によってさ
らに精製することができる。

シリカゲルの塔クロマトグラフィーでは展開溶媒として
、例えばクロロホルムとメタノールの混液（２０：１容
）を使用することにより収率よく精製され、向流分配法
では溶剤として、例えば酢酸エチルとｐＨ６の燐酸緩衝
液を使用することによりきわめて高純度のバクトロポン
かえられる。

また、バクトロポンは種々の溶剤を用いて結晶化が容易
たので、上記の抽出精製法で得られた粗粉末や粗結晶か
ら結晶として単離することができるが、粗粉末の純度は
４０％以上が好ましく、また溶剤中で少量の活性炭を使
用して脱色することも可能である。

結晶化は、例えば温酢酸エチルに溶解して濃縮する方法
、濃厚メタノール溶液に水またはクロロホルムを添加す
る方法、濃厚アルカリ性水溶液を酸性にする方法ｆＫと
によって行なわれる。

以下に実施例を示すが、バクトロポンの性状が本発明に
よって明らかにされたので、この性状にもとすいてバク
トロポンの製造法を種々考案することができる。

従って、その製造法は実施例に限定されるものでははく
、実施例の修飾手段は勿論本発明によって明らかにされ
たバクトロポンの性状にもとすいて公知の手段を施して
バクトロポンを生産、濃縮、抽出、精製、結晶化する方
法をすべて包括する。

実施例 １ 寒天斜面培地に培養したＢＭＦ３４−ＥＧ２株（微工研
菌寄第４７６９号）を、グリセリン２％、グルコース１
％、肉エキス（極東製薬製）０．５％、ポリペプトン（
大玉栄養製）０．５％、食塩０．５％の液体培地（苛性
ソーダでｐＨ７，０）に接種し、２７℃で２２時間振盪
培養して種培養液をえた。

次に上記培地１２５ｍ１ずつを分注調整した坂ロフラス
コ１８２本に、種培養液を接種（２％容）し、往復振盪
機（毎分１８０回転）上で２７℃２３時間培養した。

この培養液（ｐＨ７，２、２０，９１１バクトロポン２
８４■含有）に酢酸ブチル２０．９／を加え、塩酸で水
層のｐＨを２．０とし室温で３０分攪拌した。

静置後酢酸ブチル層を分離採取し、水１０．３７を加え
、苛性ソーダで水層のｐＨを８．０とし、よく攪拌して
バクトロポンを転溶せしめた。

水層を分離し、酢酸エチル４．６１を加え、水層のｐＨ
を３．０として抽出した。

酢酸エチル層を減圧濃縮乾燥して１．５５ｇ（バクトロ
ポン２４９■含有）の褐色粗粉末をえた。

収率８８％。実施例 ２ 実施例１でえられた褐色粗粉末１．５５ｇをメタノール
１．５ｍｌに溶解し、クロロホルム３０ｍ１とシリカゲ
ル（マリンクロット社製、ＡＲ）３ｇを加え懸濁液をつ
くった。

これを、シリカゲル１３０ｇをクロロホルム−メタノー
ル（２０：１容）混液で充填した塔（内径２７扉０に注
入し、続いて同一溶媒で展開し、１４１ｒＬｌずつ分画
した。

各分画の大腸菌に一１２株に対する抗菌力をしらべると
、分画４２−７０が活性を示した。

さらに、シリカゲルの薄層クロマトグラフィー（展開溶
媒：クロロホルム−メタノール、４：］［）でしらべて
、爽雑物の少ない分画４３−６１を集めて減圧濃縮乾燥
し、淡褐色の粗結晶２６０ｍ９（バクトロポン２３６７
７９含有）をえた。

収率９５％。この粗結晶に酢酸エチル３０ＴＩｌｌを加
え、加湿（５０℃）して溶解し、約１００■の活性炭を
加えて脱色、濾過し、温酢酸エチル５７７１１で洗浄し
た。

炉液と洗液を合して、約２５Ｒ１まで減圧濃縮し、冷却
して結晶を析出せしめた。

結晶を戸別し、冷酢酸エチル０．５ ｍｌで洗浄し、バ
クトロポンの無色結晶１５７Ｔｖ（収率６７％）をえた
。

結晶母液と洗液を合して減圧濃縮乾燥し、淡黄色の粗粉
末５１■（バクトロポン１７■含有）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はバクトロポンの臭化カリ錠で測定した赤外部吸
収曲線を示す。 第２図はメタノール溶液中、０．１ＮＨＣｌ含有９０％
メタノール溶液中および０．ＩＮ ＮａＯＨ含有９０％
メタノール溶液中で測定したバクトロポンの紫外部吸収
曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分解点２４８−２５０℃を示し、光学活性を示さな
   い無色結晶で、Ｃ７Ｈ５ＮＯ３の分子式を有し、この物
   質の赤外部吸収曲線および紫外部吸収曲線は添付図面の
   第１図および第２図にそれぞれ示す吸収極大を有し、メ
   タノール、エタノール、アセトン、ジオキサン、テトラ
   ヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、アルカリ性の水
   によくとけ、酢酸エチル、酢酸ブチルにとけるが水には
   とけ難く、ファスト・ブルーＢ１ペンタシアノアクオフ
   エリエート、ヘンタシアノアン□ンフエロアート、塩化
   第二鉄、塩化第二銅の諸反応に陽性で、ニンヒドリン、
   レッド・テトラゾリウム、ブラディなどの反応には陰性
   であることを特徴とする抗生物質バクトロポン。 ２ クロモバクテリウム属に属するバクトロポン生産菌
   を、栄養源を含有する培地中で培養してその培養物中に
   バクトロポンを生産せしめ、培養物からバクトロポンを
   採取することを特徴とする新規抗生物質バクトロポンの
   製造法。