JPH022593B2 - - Google Patents

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JPH022593B2
JPH022593B2 JP57096276A JP9627682A JPH022593B2 JP H022593 B2 JPH022593 B2 JP H022593B2 JP 57096276 A JP57096276 A JP 57096276A JP 9627682 A JP9627682 A JP 9627682A JP H022593 B2 JPH022593 B2 JP H022593B2
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alphamenine
culture
aminopeptidase
day
saline
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Hamao Umezawa
Takaaki Aoyanagi
Tomio Takeuchi
Masa Hamada
Masaaki Ishizuka
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Microbial Chemistry Research Foundation
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアミノペプチターゼＢに対して酵素阻
害活性を示す新規生理活性物質アルフアメニン
（Arphamenine）Ａ又はＢに関し、またその製造
法ならびにそれを有効成分として含有する薬剤、
特に免疫増強剤に関するものである。 本発明者らは北海道の土壌より分離したバクテ
リアであつてBMG361−CF4株と名付けた菌を培
養し、得られる培養物中にアミノペプチダーゼＢ
阻害活性を有する物質が存在することを見出し
た。その酵素阻害物質の採取方法について検討
し、その物質の単離に成功し、また本物質が新規
物質であることを確認して本発明を完成した。 本阻害物質は新規な物質であり、アルフアメニ
ン（Arphamenine）と命名されたが、このアル
フアメニンは後記のごとく２種類の物質、即ち、
アルフアメニンＡとＢから構成されておりそれら
の物性値と構造式はそれぞれ後式の通りである。 本明細書において、本物質又はアルフアメニン
とは、アルフアメニンＡ又はＢ又はこれらの両者
あるいは混合物を意味するものとする。 本発明者らはさらに医薬としてのアルフアメニ
ンの有用性について検討して本物質が細胞性免疫
に対して増強作用を有すること及びさらに制癌作
用をも有することを見出した。 本物質は、アルギニン−β−ナフチルアミドの
アミノペプチダーゼＢによる分解を阻止する効力
について調べた結果、後述の実施例に示されるご
とく、抗アミノペプチダーゼＢ活性を有すること
が確認された。 従つて、第１の本発明の要旨とするところは次
の一般式： （式中、ＲはアルフアメニンＡの場合には水素を
示し、アルフアメニンＢの場合には水酸基を示
す）で表わされる抗アミノペプチターゼＢ活性を
有する新生理活性物質アルフアメニンＡ及びＢ又
はその塩にある。 本発明のアルフアメニンＡならびにＢは夫々に
次の構造を有する。 アルフアメニンＡ及びＢは、後記の実施例に示
すごとく、アルフアメニン生産菌の培養液を
CM−セフアデツクス クロマトグラフイー等で
分画することにより、いずれも無色の粉末として
取得できる。その物性は次の通りである。 即ち、アルフアメニンＡは融点117〜119℃、質
量分析法で得られる分子量320である。元素分析
値はC53.45％、H7.11％、N14.91％、O14.20％、
Cl10.49％であり、C16H24N4O3・HClの分子式を
得る。アルフアメニンＡの100γ／mlを含む水溶
液におけるアルフアメニンＡの紫外線吸収スペク
トルは添付図面の第１図に示す通りであり、
λmax250nｍ（ε180）に吸収を示す。アルフアメ
ニンＡの赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム
錠）は第２図に示す通りであり、3370、3170、
2950、1730、1670、1560、1460、1410、1320、
1190、1110、760、710cm-1に特異吸収帯を示す。
アルフアメニンＡの核磁気共鳴吸収スペクトル
（ 1H−NMR）（重水溶液 〓ppm、100MHz）は第
３図に示す通りであり、2.04〜2.33（CH2）、2.35
〜2.72（CH2）、3.34〜3.69（CH2×２）、3.69〜3.84
（CH、CH2）、4.83（CH）、7.82〜8.00（C6H5）に
吸収を示す。 アルフアメニンＢは融点118〜120℃、質量分析
法で得られる分子量336である。元素分析値は
C49.30％、H6.88％、N13.77％、O20.82％、
Cl8.73％であり、C16H24N4O4・HCl・H2Oの分
子式を得る。 アルフアメニンＢの100γ／mlを含む水溶液中
のアルフアメニンＢの紫外線吸収スペクトルは添
付図面の第４図に示す通りであり、λmax275nｍ
（ε1040）及びλmax222nｍ（ε5500）に吸収を示
す。アルフアメニンＢの赤外部吸収スペクトル
（臭化カリウム錠）は第５図に示す通りであり、
3370、3180、2960、1730、1670、1560、1520、
1460、1420、1330、1250、1180、1110、840cm-1
に特異吸収帯を有する。アルフアメニンＢの核磁
気共鳴吸収スペクトル（重水溶液、 〓ppm、
100MHz）は第６図に示す通りであり、1.87〜
2.30（CH2）、2.30〜2.62（CH2）、3.14〜3.54（CH2
×２）、3.54〜3.78（CH、CH2）、4.75（CH）、7.30
〜7.67（C6H4）に吸収を示す。 また、第２の本発明の要旨は、クロモバクテリ
ウム属に属するアルフアメニン生産菌を培養して
本物質を培養液中に生産、蓄積させ、さらにそれ
より本物質を採取することを特徴とする新規生理
活性物質アルフアメニンＡ又は／及びＢの製造法
にある。 本発明の方法において、アルフアメニン生産菌
とはアルフアメニンＡ又はＢ又はこれら両者を生
産する菌を意味する。本発明のアルフアメニンの
生産に使用される生産菌の一例には、本発明者ら
によつて北海道、支笏湖ポロピナイで採取した土
壌より分離された細菌クロモバクテリウム・ピオ
ラセウムBMG361−CF4（Chromobacter−ium
violaceum）株がある。本菌株は工業技術院微生
物工業技術研究所に昭和57年５月４日保管委託
し、微工研菌寄第6521号（FERM Ｐ−6521）の
受託番号が付されて保管されている。 以下にこの菌株の菌学的性状について記述す
る。 BMG361−CF4株の菌学的性状 (a) 形態 (1) 本菌株の細胞は桿状で、大きさが0.8〜1.0
×2.0〜4.0ミクロン位である。 (2) 細胞の多形性は特にみとめられない。 (3) 運動性を有し、極鞭毛及び側鞭毛を認め
る。 (4) 胞子は認められない。 (5) グラム染色は陰性である。 (6) 抗酸性を有しない。 (b) 各培地における生育状態（27℃培養、肉汁ゼ
ラチン穿刺培養のみ20℃及び30℃培養） (1) 肉汁寒天培養 生育コロニーは、半球形状にやや隆起し、
辺縁は平滑、円形であり、また、その表面は
滑らかで光沢を有する。培養後17時間頃は半
透明のコロニーであるが、次第に不透明にな
り、ゴム状を呈するようになる。培養後２日
目頃からコロニーは紫色になるが、拡散性色
素は認められない。 (2) 肉汁寒天斜面培養 接種線にそつて一様に生育し、表面は滑ら
かで光沢が有り、辺縁は平滑である。培養後
２日目頃より、寒天斜面の底部から紫色を呈
するようになるが、溶解性色素は認められな
い。 (3) 肉汁液体培養 培養後２日目頃から、培地表面に紫色のリ
ング状の発育をする。培養後40時間頃より、
試験管底部の菌体の増加が認められ、その菌
体は３日目頃から紫色を呈するようになる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 30℃培養では、穿刺線にそつて菌の生育が
認められ、培養後３日目頃から液化が始ま
り、その型は管状である。20℃培養の場合、
培養後４日目で液化が認められた。 (5) BCPミルク培養 培養後３日目からBCPが青変し、凝固が
認められた。次いで５日目には凝固が完了
し、直ちにペプトン化が始まり、約２週間で
完了した。 (c) 生理学的性質（特に記さない限り、培養温度
はすべて27℃） (1) 硝酸塩の還元：硝酸塩から亜硝酸塩を生成
する。 (2) 脱窒反応（駒形らの方法：長谷川武治編
著：微生物の分類と同定、223頁、東京大学
出版会、1975年）：陽性、ガスの発生はみと
められない。 (3) MRテスト：陽性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成（TSI寒天培地；栄研）：
陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地、
Christensenの培地ともに生育する。 (9) 無機窒素源（硝酸ナトリウム、硫酸アンモ
ニウム、グルタミン酸ソーダの利用）：いずれ
の無機窒素源も利用し、生育が認められた。 (10) 色素の生成（キングＡ及びＢ培地；栄
研）：両培地共に、ほんのわずかな黄色の溶
解性色素を認めた。 (11) ウレアーゼ（尿素培地；栄研）：陰性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育温度、PHの範囲：生育温度範囲は12
〜37℃、最適温度は27〜30℃付近である。生
育PH範囲は、5.0〜8.6、最適PHは6.0〜7.8で
ある。 (15) 酸素に対する態度：好気性（通性嫌気
性） (16) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法による）
発酵型である (17) 糖類からの酸及びガスの生成（Hugh
Leifsonの培地を使用）：Ｄ−グルコース、Ｄ
−フラクトース、トレハロースから酸の生成
が認められた。但し、下記の19種類の糖から
は酸の生成が認められなかつた。 Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
マンノース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、シ
ヨ糖、乳糖、Ｄ−ソルビツト、Ｄ−マンニツ
ト、イノシツト、グリセリン、デンプン、ア
ドニトール、セロビオース、ズルシツト、イ
ヌリン、メリビオース、メレジトース、ラフ
イノース。 さらに、ガスの生成は、いずれの糖からも
認められなかつた。 (18) カゼインの加水分解： カゼイン寒天平板（肉汁寒天に別に滅菌し
た脱脂粉乳を５％濃度に加え、固化した。PH
7.4）に画線培養し、培養後24時間でカゼイ
ンの消化が認められ、８日目には加水分解が
完了した。 (19) 紫色色素の可視部吸収測定： 肉汁寒天斜面培地に生育した紫色の菌体
を、エタノールで抽出し、可視部吸収測定を
おこなつた結果、最大吸収573nｍ、最小吸
収430nｍを示した。又、10％硫酸エタノー
ル中では最大吸収693nｍの緑色溶液となつ
た。これは、この紫色色素がビオラセイン
（violacein）色素であることを示している
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology、8thedition、p.354参照）。 以上の性状を要約すると、BMG361−CF4株は
グラム陰性の通気嫌気性桿菌で極鞭毛及び側鞭毛
を有する。又、コロニーは紫色で、この色素は、
可視部吸収測定よりビオラセインであることが証
明された。これらの性状をBergey′s Manual of
Determinative Bacteriology、8theditionで検索
すると、BMG361−CF4株は、クロモバクテリウ
ム（Chromobacterium）属に属すると考えられ
る。クロモバクテリウム属には、クロモバクテリ
ウム・ピオラセウム及びクロモバクテリウム・リ
ビダムの２種があるが、BMG361−CF4株は前者
に極めて近い性質を示す。すなわちBMG361−
CF4株は、37℃で生育すること、糖からの酸生成
パターンでトレハロースから酸を生成し、アラビ
ノース、キシロースからは酸をつくらない点、ま
たカゼインの加水分解が認められること等から、
クロモバクテリウム・リビダムと明らかに区別さ
れた。よつてBMG361−CF4株をクロモバクテリ
ウム・ピオラセウム（Chromobacterium
violaceum）BMG361−CF4と同定する。 次に本発明の方法を具体的に説明する。 本発明の方法を実施するに当つて、アルフアメ
ニン生産菌を培養するに用いる栄養源としては、
細菌の栄養源として公知のものを適宜使用でき
る。例えば、市販されているグリセリン、グルコ
ース、ラクトース、シユクロース、デンプン、マ
ルトース、糖蜜などの炭水化物、脂肪などを炭素
源として、市販されているペプトン、肉エキス、
コーンステイープリカー、綿実粉、落花生粉、大
豆粉、コーングルテンミール、魚粉、酵母エキ
ス、Ｎ−Ｚアミン、カゼイン、硫酸ナトリウム、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを窒素
源として、食塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、硫酸
マグネシウムなどを無機の栄養源としてそれぞれ
使用できる。その他必要に応じて微量の金属塩を
添加する。これらのものは、アルフアメニン生産
菌が利用し、また本物質の生産を妨害しないもの
であればよい。公知の細菌の培養材料はすべて使
用できる。特に好ましい培地成分としては、炭素
源としてグリセリン、可溶性デンプンなど、窒素
源として、大豆粉、魚粉、コーングルテンミール
などがある。グリセリン1.5％、可溶性デンプン
1.5％、プロリツチ0.5％、魚粉1.5％、炭酸カルシ
ウム0.2％を含む組成の培地、可溶性デンプン３
％、プロリツチ0.5％、コーングルテンミール1.2
％、炭酸カルシウム0.2％を含む培地などを用い
るのが好ましい。 アルフアメニンの大量生産には液体培養が好ま
しい。培養温度としては、アルフアメニン生産菌
が発育し、アルフアメニンを生産する範囲の温度
も適用し得るが、特に好ましい培養温度は25℃〜
35℃である。培養は普通は本物質が培養物中に生
産され、充分に蓄積するまで継続される。 例えば、可溶性デンプン３％、プロリツチ0.5
％、コーングルテンミール1.2％、炭酸カルシウ
ム0.2％を含む培地を滅菌したのち、これにアル
フアメニン生産菌の斜面培養物の一白金耳量を接
種し、27℃で好気的に振盪培養を行なつたとこ
ろ、培養８時間目から52時間目にアルフアメニン
の蓄積が認められた。アルフアメニンはタンク培
養法でも振盪培養法と同様によく生産される。例
えば、570の醗酵槽に300の培地を入れて滅菌
し、毎分300の無菌空気を通気し、毎分190回転
で撹拌した。この条件で本物質の生産は23時間で
最高に達した。 アルフアメニンの培養工程ならびに精製工程中
での追跡は、次の方法による抗アミノペプチダー
ゼＢ活性の測定に基づいて行つた。 抗アミノペプチダーゼＢ活性の測定はポツプス
（V.K.HOPPUSU、K.K.MAKINEN、G.G.
GLENNER、Archives of Biochemistry and
Biophysics114、557、1966）記載の改良法で行
つた。即ち、0.002Mアルギニン−β−ナフチル
アミド0.25mlに0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.0）
0.5ml、検体を含む溶液0.25mlを加えた混合溶液
を37℃、３分間加温した後、ホツプスらの方法に
よる酵素の精製法で、DEAE−セルロースで精製
したアミノペプチダーゼＢ溶液を5μ加え37℃
で30分間反応したのち、１mg／mlの濃度にフアス
トガーネツトGBC（オルトアミノアゾトルエン、
ジアゾニウム塩）を含み、10％の濃度に界面活性
剤ツイーン20（Tween20）を含む1.0M酢酸緩衝剤
（PH4.2）１mlを加え、室温に15分間放置後525nｍ
における吸光度(a)を測定した。同時にアルフアメ
ニンを含まない緩衝剤のみを用いた盲検の吸光度
(b)を測定し、アミノペプチダーゼＢ阻害率を
〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×100により計算した。この定量
方法で0.005μｇ／mlのアルフアメニンＡ及び
0.002μｇ／mlのアルフアメニンＢはアミノペプチ
ダーゼＢ活性を50％阻害（IC50）した。 アルフアメニンはアルフアメニン生産菌の培養
液中及び菌体中に存在する。アルフアメニンを培
養物から採取するに当つては、培養液から吸着
剤に吸着および脱離させる方法で好収率に採取で
きる。吸着剤としては活性炭、アンバーライト
XAD−４、ダイヤイオンHP−20等の有機吸着
剤、イオン交換樹脂、アルミナ、シリカゲルなど
が使用できる。例えば、アルフアメニンはアンバ
ーライトXAD−４で吸着され、アセトン水で溶
出される。例えば培養液の1/10量のアンバーラ
イトXAD−４を適当なカラムに詰め、アルフア
メニンを含む培養液を通過吸着せしめ、アンバ
ーライトXAD−４を水洗したのち、アンバーラ
イトXAD−４量の２〜４倍量の50％アセトン水
で溶出される。培養液中のアルフアメニンは、
50％アセトン水溶液中に70％以上溶出される。こ
の50％アセトン水溶液を減圧濃縮乾固することに
より粗粉末を得ることができる。 イオン交換体のクロマトグラフイーも精製に用
いられる。特に、CM−セフアデツクスのクロマ
トグラフイーが有効であり、食塩水の濃度こう配
溶出によりアルフアメニンＡとＢとを相互に分離
することができる。例えば、アンバーライト
XAD−４に吸着、アセトン水溶出によつて得ら
れた粗粉末をCM−セフアデツクス クロマトグ
ラフイーにかけ、食塩などの塩類の水溶液を用い
て溶出し、アルフアメニンＡを含有するフラクシ
ヨンとアルフアメニンＢを含むフラクシヨンを
別々に採取し、それからアルフアメニンＡとＢを
それぞれ単離する。 本物質の最終的な精製はセフアデツクスLH−
20で脱塩することにより実施できる。 本発明のアルフアメニンについてその薬理作用
を検討した。その結果、本物質が細胞性免疫に対
する増強効果と制癌作用を有していることが見出
された。 本発明のアルフアメニンＡ、Ｂ両物質の生物活
性について試験例を挙げて説明する。 試験例 １ 本例は正常マウスにおける細胞性免疫に及ぼす
効果を示す。 細胞性免疫に及ぼすアルフアメニンＡ及びＢの
作用を、羊赤血球（SRBCと略）を抗原としてマ
ウス足蹠に接種して得られる遅延性過敏症（D.
T.Hと略）を指標（参考文献J.Exp.Med.139、
1529〜1539、1974）として検討した。 即ち、SRBC108個を0.05mlの生理食塩水に浮遊
させた懸濁液をCDF1（雌性８週令）マウスの足蹠
皮下に注射し、これと同時に、アルフアメニンＡ
又はＢの５mg／Kg、0.5mg／Kg、0.05mg／Kg又は
0.005mg／Kgを含有する水溶液を１回経口投与し
た。投与４日後、他の一方の足蹠に、SRBC108
個を0.05mlの生理食塩水に浮遊させた懸濁液を皮
下投与して二次感作させた。その24時間後、その
足蹠にみられる腫張度（足蹠の厚さの増加）をキ
ヤリパスで測定した。供試化合物を投与しないで
SRBC及び生理食塩水の皮下注射を受けた対照動
物の足蹠肥厚度を100％と評価し、これと処理し
た供試動物の足蹠皮厚度を比較することにより供
試化合物の細胞性免疫増強効果を判定した。試験
結果を次表に示す。 【表】 【表】 【表】 試験例 ２ 本例は担癌マウスにおける細胞性免疫に及ぼす
効果を示す。 (1) 抗原としてSRBCを用いる方法 試験法は前記の試験例１に準ずる方法で足蹠
の腫張度を測定して検討したが、但し腹水性
Sarcoma180腫瘍の細胞106個をip接種した
CDF1マウスを用いたこと及びアルフアメニン
Ａの投与を抗原としてのSRBCの感作日から１
回／日、４日間連日ip投与し、その２日後に
SRBCの二次感作を行つた点が異る。試験結果
を次表に示す。 【表】 (2) 抗原として塩化ピクリルを用いる方法 腹水性Sarcoma180腫瘍の担癌マウスにおけ
る塩化ピクリルを抗原としたD.T.H反応による
細胞性免疫に及ぼすアルフアメニンＡの効果を
下記の試験法で検討した。 腹水性Sarcoma180腫瘍の細胞の106個を
CDF1（雌性12週令）マウス（６匹／群）の腹腔
内に移植（０日）し、１日後に25mm×15mmに剃
毛した腹部へ６％塩化ピクリルエタノール液を
20mm×20mm×２mmのカツト脱脂綿に0.6ml含ま
せて感作する。８日後に両耳をダイアル式厚さ
計で測定し、その値を前値(a)とする。その後10
mm×４mm×１mmのカツト脱脂綿に１％塩化ピク
リルオリーブ液を含ませて両耳を感作し、９日
後にその両耳の腫張度をダイアル式厚さ計で測
定し、この測定値(b)から前値(a)を差し引いてこ
の耳厚増加度（ｂ−ａ）を算定して、これを対
照群(C)とする。他方、生理食塩水にとかした供
試化合物を0.5mg／Kg、0.05mg／Kg又は0.005
mg／Kgの量で、Sarcoma接種１日後から８日
後までに連日６回／日経口投与し且つ対照群と
同様に塩化ピクリルで感作をして耳厚増加度
（b′−a′）を測定して、これを処置群（Ｔ）と
する。対照に対する耳厚増加率（Ｔ／Ｃ×100）
を算出し、細胞免疫賦活性の程度とした。試験
結果を次表に示す。 【表】 上表の結果から、0.05mg／Kgのアルフアメニン
Ａ投与群に有意な細胞免疫賦活性が得られたこと
が認められた。 試験例 ３ 本例はエールリツヒ固形腫瘍に対するアルフア
メニンの抗腫瘍活性を示す。 腹水性Ehrlich carcinoma腫瘍の細胞３×106
個をddY（雌性８週令）マウス（５匹／群）の側
腹部皮下に移植（０日）し、生理食塩水に溶解し
た供試化合物を１日後から15日後までに隔日に７
回0.5mg／Kg、0.05mg／Kg又は0.005mg／Kgの量で
経口投与した。腫瘍移植より30日後に腫瘍サイズ
（短径2×長径／２）および腫瘍重量を測定した。
それぞれから対照群との比較により腫瘍成長抑制
率（TIR％）を次式Ｃ−Ｔ／Ｃ×100〔但しＣ：対
照群の腫瘍サイズあるいは腫瘍重量、Ｔ：処置群
の腫瘍サイズあるいは腫瘍重量である〕により算
出し、TIR％を抗腫瘍効果の評価のため次表に示
した。 【表】 上表の結果、腫瘍サイズおよび腫瘍重量におい
て、0.05mg／Kg、0.005mg／Kgアルフアメニン投
与群に、宿主介在的抗腫瘍効果が得られたことが
認められる。 以上の結果より、アルフアメニンＡ、Ｂの両物
質は正常動物の細胞性免疫能を増強し、かつ担癌
により低下した細胞性免疫能を賦活し、さらに宿
主介在的抗腫瘍効果を奏する物質であると認めら
れる。 また、アルフアメニンＡ及びＢは実験的アレル
ギー性脳背髄炎の治療薬としても効果があると認
められた。 マウスに対する急性毒性試験では、アルフアメ
ニンＡの250mg／Kgのiv投与で、またアルフアメ
ニンＢの150mg／Kgのiv投与で死亡例は認められ
ない。従つて、アルフアメニンは安全な物質であ
ると認められる。 このように本発明のアルフアメニンＡおよびＢ
は単独で免疫効果を増強し、また制癌効果を宿主
介在的に奏することが認められる。従つて本発明
化合物は免疫増強剤および抗腫瘍免疫賦活剤とし
て有用であり、あるいは各種癌化学療法剤の補助
剤として有用である。 アルフアメニンＡ、Ｂを有効成分とする上記薬
剤としては、アルフアメニンＡまたはＢまたは両
者、あるいはその薬学的に許容される塩のいづれ
かを、常用の担体と配合して製剤でき、更には、
各種の化学療法剤を混合したものでもよい。アル
フアメニンの塩の例としては、アルフアメニンの
カルボキシル基における薬学的に許容できる陽イ
オン、例えばナトリウム、カリウムの如きアルカ
リ金属カルシウム、マグネシウムの如きアルカリ
土類金属の陽イオン、アンモニウムイオンとの塩
（カルボキシレート）がある。アルフアメニンの
グアニジル基、アミノ基における薬学的に許容で
きる無機酸、例えば塩酸など又は有機酸例えば酢
酸などとの酸付加塩も包含される。 本発明の化合物乃至薬剤の投与形態は経口、注
射、直腸坐剤のいずれでもよい。注射剤を調製す
る場合は上記有効成分化合物にPH調整剤、緩衝
剤、安定化剤、賦形剤を添加し常法により、凍結
乾燥を行い、凍結乾燥注射剤を作ることができ、
また有効成分化合物にPH調整剤、緩衝剤、安定化
剤等張剤、局麻剤等を添加し、常法により皮下、
筋肉内、静脈内用注射剤を作ることもできる。 経口用固形製剤を調製する場合は有効成分化合
物に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤を加えた
後、常法により、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散
剤、カプセル剤等を作ることができる。 経口液状製剤を調製する場合には有効成分化合
物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加え
て、常法によりシロツプ剤、およびドライシロツ
プ剤を作ることができる。 直腸坐薬製剤を調製する場合には有効成分化合
物に賦形剤、更に必要に応じて、界面活性剤を加
えた後、常法により坐剤とすることができる。 アルフアメニンの投与量は症状により異なる
が、成人では１回アルフアメニンとして0.02〜
200mgを１日１回投与するのがよい。又他の癌化
学療法剤または免疫増強剤と併用するときは癌化
学療法剤または免疫増強剤の通常の使用量に上記
の範囲内の量のアルフアメニンを併用すればよ
い。 次に本発明のアルフアメニンの製造に関して実
施例を示すが、本物質の理化学的性状ならびに生
産方法、その精製法が本発明者らによつて明らか
にされたので、本明細書に示された方法を修飾す
ることは容易であり、本発明は以下に記載する実
施例のみに限定されるものではない。 実施例 １ アルフアメニン生産菌としてクロモバクテリウ
ム・ピオラセウムBMG361−CF4（微工研菌寄第
6521号）の斜面培養から一白金耳量をとり、あら
かじめ120℃、20分間の条件で滅菌した500ml容量
のロータリーフラスコに、110mlづつ分注した可
溶性デンプン３％、プロリツチ0.5％、コーング
ルテンミール1.2％、炭酸カルシウム0.2％からな
る組成を有する培地に接種した。27℃において毎
分180回転の培養条件を用い、経時的にアルフア
メニン産生量を検討したところ、培養32時間目に
アルフアメニン産生量はピークに達した。培養６
時間目から、抗アミノペプチダーゼＢ活性の測定
で評価したアルフアメニン濃度は徐々に減少し
た。培養中の培地のPH変化は、始発7.4、８時間
目7.8、16時間目7.6、24時間目7.85、32時間目
8.1、36時間目8.1、52時間目8.45であつた。 実施例 ２ 実施例１と同様の培地と培養条件でクロモバク
テリウム・ピオラセウムBMG361−CF4株を培養
して得られた培養液9.5を塩酸でPH２とし、
過助剤（ハイフロスーパーセル）を用いて吸引
過し９の培養液を得た。この液のアミノペ
プチダーゼＢ阻害活性（IC50）は0.05μ／mlで
あつた。 実施例 ３ 実施例２において得られた培養液９を水酸
化ナトリウムでPH５に調整後、アンバーライト
XAD−４ １のカラムに吸着させ、水洗後50
％アセトン水で溶出し、活性区分2.3を減圧下
で濃縮乾固し、19.6ｇの粗粉末を得た。この粗粉
末のアミノペプチダーゼＢ阻害活性（IC50）は
0.2μｇ／mlであつた。 次に、この粗粉末を適当量の0.05M食塩水に溶
かし、500mlのCM−セフアデツクスＣ−25に吸
着させ、0.05M食塩水1.5及び0.05Mクエン酸緩
衝液（PH4.5）で洗つたのち、同緩衝液2.5と
0.55M食塩を含む同緩衝液2.5のグラジエント
溶出を行つた。この操作により溶出液を18mlづつ
のフラクシヨンで集めてアルフアメニンＡはフラ
クシヨン39から59番に、アルフアメニンＢはフラ
クシヨン60から89番に溶出された。それぞれの分
画はアンバーライトXAD−４によつて脱塩後、
凍結乾燥して、アルフアメニンＡ分画から188mg
（アミノペプチダーゼＢ阻害活性IC50＝0.0065μ
ｇ／ml）のアルフアメニンＡ粗粉末を、またアル
フアメニンＢ分画から79mg（アミノペプチダーゼ
Ｂ阻害活性IC50＝0.0023μｇ／ml）のアルフアメ
ニンＢ粗粉末を得た。 実施例 ４ 実施例３で得られたアルフアメニンＡ粗粉末
188mgを適当量の0.05M食塩水に溶かし、1N塩酸
でPH2.3に調整し、80mlのCM−セフアデツクスＣ
−25のカラムに吸着させ、0.07M食塩水100mlで
洗つたのち、0.07M食塩水300ml及び0.5M食塩水
300mlのグラジエント溶出を行つた。この精製操
作により溶出液を８mlずつのフラクシヨンで集め
てアルフアメニンＡはフラクシヨン11から34番に
溶出された。この溶出されたフラクシヨン11から
30番を濃縮後、PHを2.3に1N塩酸で調整し、500
mlのセフアデツクスLH−20のカラムから水で溶
出することにより脱塩した。脱塩されたアルフア
メニンＡ溶液をダウエツクスWGRでPH５に調整
後、凍結乾燥することによりアルフアメニンＡの
白色粉末94mg（アミノペプチダーゼＢ阻界活性
（IC50＝0.0054μｇ／ml）を得た。 実施例 ５ 実施例３で得られたアルフアメニンＢ分画79mg
を適当量の0.05M食塩水に溶かし、1N塩酸でPH
2.3に調整し、100mlのCM−セフアデツクスＣ−
25のカラムに吸着させ、0.15M食塩水100mlで洗
つたのち、0.15M食塩水350ml及び0.6M食塩水
350mlのグラジエント溶出を行つた。この精製操
作により、溶出液11mlづつのフラクシヨンで集め
てアルフアメニンＢはフラクシヨン17から30番に
溶出された。この分画を濃縮後500mlのセフアデ
ツクスLH−20のカラムから0.01N塩酸で溶出し
て脱塩した。アルフアメニンＢの脱塩分画をダウ
エツクスWGRを用いてPH５に調整後、凍結乾燥
することによりアルフアメニンＢの白色粉末32mg
（アミノペプチダーゼＢ阻害活性IC50）＝0.0020μ
ｇ／ml）を得た。 実施例 ６ 500ml容の坂口フラスコにグリセリン1.5％、可
溶性デンプン1.5％、プロリツチ0.5％、魚粉1.5
％、炭酸カルシウム0.2％及び消泡剤（KM−72）
0.05％からなる培地80mlを注入し、120℃、15分
間滅菌し、冷後クロモバクテリウム・ピオラセウ
ムBMG361−CF4株（微工研菌寄第6521号）を斜
面培地に培養したものを一白金耳量接種した。28
℃で24時間、毎分135往復の振盪培養を行ない、
これを一次種母とした。 次に100容のタンクにグリセリン1.5％、可溶
性デンプン1.5％、プロリツチ0.5％、カツオエキ
ス1.74％、炭酸カルシウム0.2％及び消泡剤（KM
−72）0.05％から成る培地50を入れ120℃、30
分間滅菌し、冷後、一次種菌80mlを接種した。毎
分50の滅菌空気を通気しながら、毎分200回転
の撹拌で28℃、24時間培養を行ない、これを二次
種母とした。 次に、570容のタンクに可溶性デンプン3.0
％、プロリツチ0.5％、グルテンミール1.2％、炭
酸カルシウム0.2％及び消泡剤（KM−72）0.05％
からなる培地300を入れ、120℃30分間滅菌し、
冷後、二次種母を６加えた。通気量毎分300、
撹拌毎分190回転で28℃、24時間培養を行つた。
培養液を硫酸でPH２とし、過助剤（ハイフロス
ーパーセル）を用いて吸引過した。液を水酸
化ナトリウムでPH６に調整後、再度吸引過して
液185を得た。この液のアミノペプチダー
ゼＢ阻害活性はIC50＝0.17μｇ／mlであつた。 上記の液185にクロマト用カーボン10を
加え２時間撹拌した。次に200メツシユの篩でカ
ーボンを分離した。カーボンを50の水で洗つた
後塩酸でPH２に調整した50％アセトン水80中に
入れ、２時間撹拌し抽出した。これをバスケツト
型遠心分離機によりカーボンを除き、抽出液を濃
縮し、3.54の濃縮液を得た。この濃縮液のアミ
ノペプチダーゼＢ阻害活性はIC50＝0.0063μｇ／
mlであつた。 実施例 ７ 実施例６で得られた濃縮液3.54を２規定の水
酸化ナトリウムで中和した。この時液量は5.35
となつた。これをアンバーライトXAD−４ 1.7
のカラムに吸着させ、水洗後50％アセトン水12
で溶出し、活性分画７を減圧下で濃縮し、
280mlの濃縮液を得た。この濃縮液のアミノペプ
チダーゼＢ阻界活性はIC50＝0.01μ／mlであつ
た。次に、この液も1.7のCM−セフアデツクス
のカラムに吸着し、0.05M食塩水６及び0.05M
クエン酸緩衝液（PH4.5）２で洗つたのち、同
緩衝液６と0.6Mの食塩を含む同緩衝液６の
グラジエント溶出を行つた。この操作により溶出
液を200mlずつのフラクシヨンで集めてアルフア
メニンＡはフラクシヨン30から39番に、アルフア
メニンＢはフラクシヨン42から52番に溶出され
た。それぞれの分画は濃縮後アンバーライト
XAD−４によつて脱塩し、アルフアメニンＡ分
画の85ml（IC50＝0.00058μ／ml）、アルフアメ
ニンＢ分画の43ml（IC50＝0.00031μ／ml）を得
た。 実施例 ８ 実施例７で得られたアルフアメニンＡ分画の85
mlをバイオゲルＰ−２（バイオラツド社）240mlの
カラムに吸着させ、2.5の水及び20％メタノー
ル水１でカラムを洗つた後、0.001M食塩水で
溶出した。溶出液を18mlづつのフラクシヨンで集
め、フラクシヨン７から81番にアルフアメニンＡ
が認められた。この分画を濃縮し、アンバーライ
トXAD−４で脱塩後、凍結乾燥した。これによ
り、アルフアメニンＡの淡黄色の粉末1.48mgを得
た。この粉末のアミノペプチダーゼＢ阻害活性は
IC50＝0.030μｇ／mlであつた。 実施例 ９ 実施例７で得られたアルフアメニンＢ分画の43
mlを、バイオゲルＰ−２（バイオラツド社）240ml
のカラムに吸着させ、２の水及び20％メタノー
ル水１でカラムを洗つた後0.005Mの食塩水で
溶出した。溶出液を18mlづつのフラクシヨンで集
め、フラクシヨン６から25番にアルフアメニンＢ
が認められた。この分画を濃縮後アンバーライト
XAD−４で脱塩後、凍結乾燥した。これにより、
アルフアメニンＢの淡黄色の粉末1.89ｇを得た。
この粉末のアミノペプチダーゼＢ阻害活性はIC50
＝0.019μｇ／mlであつた。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のアルフアメニンＡの紫外部吸
収スペクトル、第２図はアルフアメニンＡの赤外
部吸収スペクトル、第３図はアルフアメニンＡの
核磁気共鳴吸収スペクトルを示す。第４図は本発
明のアルフアメニンＢの紫外部吸収スペクトル、
第５図はアルフアメニンＢの赤外部吸収スペクト
ル、第６図はアルフアメニンＢの核磁気共鳴吸収
スペクトルを示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 次の一般式： （式中、ＲはアルフアメニンＡの場合には水素を
    示し、アルフアメニンＢの場合には水酸基を示
    す）で表わされる抗アミノペプチダーゼＢ活性を
    有する新生理活性物質アルフアメニンＡ及びＢ又
    はその塩。 ２ クロモバクテリウム属に属するアルフアメニ
    ン生産菌を培養してアルフアメニンＡ又はＢ又は
    その両者を培養液中に生産、蓄積させ、それによ
    りアルフアメニンＡ又はＢ又はその両者を採取す
    ることを特徴とする新生理活性物質アルフアメニ
    ンＡ又は／及びＢの製造法。 ３ アルフアメニン生産菌株としてクロモバクテ
    リウム・ビオラセウムBMG361−CF4（微工研菌
    寄第6521号）を使用する特許請求の範囲第２項に
    記載の方法。 ４ 新生理活性物質アルフアメニンＡ又はＢ又は
    これら両者又はこれらの塩を有効成分として含有
    することを特徴とする免疫増強剤。
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