JPS6034190A - アルフアメニンの高収率製造法 - Google Patents
アルフアメニンの高収率製造法Info
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- JPS6034190A JPS6034190A JP58142527A JP14252783A JPS6034190A JP S6034190 A JPS6034190 A JP S6034190A JP 58142527 A JP58142527 A JP 58142527A JP 14252783 A JP14252783 A JP 14252783A JP S6034190 A JPS6034190 A JP S6034190A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Optical Head (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明紘醗酵によるアルファメニンの改ｘｉ造法に関す
るものである。
るものである。
アルファメニンは、本発明者の一人である梅沢らＫｆつ
てクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｒｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ） ＢＭＧ
３６１− ＣＦ４株によシ生産されることが発見され
た酵素阻害剤で、その化学構造は次の如き一般式で表わ
される。
てクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｒｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ） ＢＭＧ
３６１− ＣＦ４株によシ生産されることが発見され
た酵素阻害剤で、その化学構造は次の如き一般式で表わ
される。
Ｈ２Ｎ−ＣＩ（−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃｏｏ）Ｉ（式
中ＲはＨまた紘−ＯＨである）。
中ＲはＨまた紘−ＯＨである）。
これらのアルファメニン化合物は毒性が低く抗アミノ硬
′ブチダーゼＢ作用を有し−また免疫増強作用その他極
々な薬理作用゛を有す不有用な物質である（本出願人の
特願昭５７−９６２７６号明細書参照）。
′ブチダーゼＢ作用を有し−また免疫増強作用その他極
々な薬理作用゛を有す不有用な物質である（本出願人の
特願昭５７−９６２７６号明細書参照）。
アルファメニンはアルファメニンＡおよびＢの総称であ
り、前記一般式でＲが水素の場合はアルファメニンＡを
示し、Ｒが水酸基の場合はアルファメニンＢを示す。
り、前記一般式でＲが水素の場合はアルファメニンＡを
示し、Ｒが水酸基の場合はアルファメニンＢを示す。
前述の特許出願明細書には、アルファメニンの生産に好
適な醗酵用培地として、グリセリン１．５チ、可溶性デ
ンプン１．５俤、プロリッチ０．５チ。
適な醗酵用培地として、グリセリン１．５チ、可溶性デ
ンプン１．５俤、プロリッチ０．５チ。
魚粉１．５ｍ、炭酸カルシウム０．２チ（重量／容量）
を含む組成の培地、あるいは可溶性デンプン３修。
を含む組成の培地、あるいは可溶性デンプン３修。
クロリッチ０．５％、コーングルテンミール１．２ ％
。
。
炭酸カルシウム０．２％（重量／容量）を含む培地など
が記載されている。しかしながら、これらの培地を使用
した場合、アルファメニンの生産性は工業的生産のだめ
には決して満足すべきものではないＯ そこで木兄・切者らは、アルファメニンの培養収量を増
大すべく、培地組成について種々検討した結果、培地に
Ｌ−アルギニン（塩酸塩として）、Ｌ−フェニルアラニ
ン及び単一チロジンをソｈソｔ’ｔＯ，２〜２．０％（
重量）の範囲で添加するときは全く予期せざることにア
ルファメニンの生産性が上記アミノ酸を含まない前述の
培地を利用する方法に比して、約２倍から８倍と格段に
上昇することを見い出した・本発明は以上の知見に基づ
いて完成されたものである。従って、本発明の要旨とす
るところはクロモバクテリウム属ににするアルファメニ
ン生産菌を培養してアルファメニンヲ製造する方法にお
いて、培地にＬ−フェニルアラニン。
が記載されている。しかしながら、これらの培地を使用
した場合、アルファメニンの生産性は工業的生産のだめ
には決して満足すべきものではないＯ そこで木兄・切者らは、アルファメニンの培養収量を増
大すべく、培地組成について種々検討した結果、培地に
Ｌ−アルギニン（塩酸塩として）、Ｌ−フェニルアラニ
ン及び単一チロジンをソｈソｔ’ｔＯ，２〜２．０％（
重量）の範囲で添加するときは全く予期せざることにア
ルファメニンの生産性が上記アミノ酸を含まない前述の
培地を利用する方法に比して、約２倍から８倍と格段に
上昇することを見い出した・本発明は以上の知見に基づ
いて完成されたものである。従って、本発明の要旨とす
るところはクロモバクテリウム属ににするアルファメニ
ン生産菌を培養してアルファメニンヲ製造する方法にお
いて、培地にＬ−フェニルアラニン。
Ｌ −ｆ ｏシン及びＬ−アルギニノを単独に又は２種
以上の組み合せで添加することを特徴とするアルファメ
ニンの高収率製造法にある。
以上の組み合せで添加することを特徴とするアルファメ
ニンの高収率製造法にある。
なお、本発明のアルファメニン生産用培地における栄養
源としては、細菌の栄養源として公知のものを適宜使用
できる。例えにグリセリン、グルコース、ラクトース、
シュクロース、デンプン。
源としては、細菌の栄養源として公知のものを適宜使用
できる。例えにグリセリン、グルコース、ラクトース、
シュクロース、デンプン。
マルトース、糖蜜などの炭水化物、脂肪など金炭素源と
して、ペプトン、肉エキス、コーンステイーグリカー、
綿実粉、落花生粉、大豆粉、コーングルテンミール、魚
粉、酵母工牛ス、ＮＺ−アミン、カゼイン、硝酸ナトリ
ウム、硝酸アン毫二りム、硫ｅアンそニウム、リン酸７
ン％ニウムナトを窒素源として使用でき、また食塩、
リン吹型。
して、ペプトン、肉エキス、コーンステイーグリカー、
綿実粉、落花生粉、大豆粉、コーングルテンミール、魚
粉、酵母工牛ス、ＮＺ−アミン、カゼイン、硝酸ナトリ
ウム、硝酸アン毫二りム、硫ｅアンそニウム、リン酸７
ン％ニウムナトを窒素源として使用でき、また食塩、
リン吹型。
炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどを無機の栄養源
として使用できる。
として使用できる。
以下に本発明の効果を実験例によって示す。。
なお本発明におけるアルファメニンの力価の測定はホッ
プス（ｖ、に、■ｔｏｐｐＵｓｎ、 ｐｃ、ｐｃ、ＭＡ
ＫｒＮＥｗ、 ａ、、ａ。
プス（ｖ、に、■ｔｏｐｐＵｓｎ、 ｐｃ、ｐｃ、ＭＡ
ＫｒＮＥｗ、 ａ、、ａ。
ＧＬＥｔｌＴｉＪＬ、 Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ 、Ｂｉｏｐ−ｈｙｓ＋
ｃｓ １１４．５５７．１９６６ ）記載の方法の改良
法で行った。すなわち、０．００２ Ｍ ７ ＃ ４
＝ ノーβ−ナフチルアミド０．２５＊Ｊ！にＯ，１Ｍ
）リスー廖酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．５ ｔｄ、検
体を含む溶液０．２５−を加えた混合溶液を３７°ｃ、
３分間加温した後、ホップスらの方法による酵素の精製
法で、Ｄｇ７１： −セルロースで精製したアミンイデ
チダーゼＢ溶液を５μを加えて３７°Ｃで３０分間反応
したのち、し’＋５１ ／ Ｊｄの濃度にファーストガ
ーネツ） Ｇ’Ｂ Ｃ（オルトアミノアゾトルエンゾア
ゾニクム塩）を含み１０％の濃度に界面活性剤ツイーン
２０ （Ｔｗｅｅｎ２０）ヲ含ｔｒ１．ＯＭｒｊｐ、ｆ
ｉ緩衝液（’ｐＨ４，２） Ｉ ｔｕｆヲ加え、室温に
１５分間放置後、ｓ２５ｎｍ における吸光度（ａｌを
測定した。同時にアルファメニンを含まない緩衝液のみ
を用いた盲検の吸光度０））を測定し、アミン（グチダ
ーゼＢ阻害率を［’（’ｂ−ａ）／ｂＩＸ１００ によ
り計算した。純品のアルファメニンへの本測定によるア
ミノペプチダーゼＢ５Ｑ慢阻害濃度（■Ｃ３ｏ）は０．
００５１ｎａｇ ／ ｔｎｌ！であシ、 ゛純品のアル
ファメニンＢのそれは帆００２ ｍｃｇ ／ ｍｌであ
る。これらの物質を標準とし、アルファメニンの単位を
ｎａｇ（力価）、り（力価）の如＜ｉｆ力価で表わす。
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ 、Ｂｉｏｐ−ｈｙｓ＋
ｃｓ １１４．５５７．１９６６ ）記載の方法の改良
法で行った。すなわち、０．００２ Ｍ ７ ＃ ４
＝ ノーβ−ナフチルアミド０．２５＊Ｊ！にＯ，１Ｍ
）リスー廖酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．５ ｔｄ、検
体を含む溶液０．２５−を加えた混合溶液を３７°ｃ、
３分間加温した後、ホップスらの方法による酵素の精製
法で、Ｄｇ７１： −セルロースで精製したアミンイデ
チダーゼＢ溶液を５μを加えて３７°Ｃで３０分間反応
したのち、し’＋５１ ／ Ｊｄの濃度にファーストガ
ーネツ） Ｇ’Ｂ Ｃ（オルトアミノアゾトルエンゾア
ゾニクム塩）を含み１０％の濃度に界面活性剤ツイーン
２０ （Ｔｗｅｅｎ２０）ヲ含ｔｒ１．ＯＭｒｊｐ、ｆ
ｉ緩衝液（’ｐＨ４，２） Ｉ ｔｕｆヲ加え、室温に
１５分間放置後、ｓ２５ｎｍ における吸光度（ａｌを
測定した。同時にアルファメニンを含まない緩衝液のみ
を用いた盲検の吸光度０））を測定し、アミン（グチダ
ーゼＢ阻害率を［’（’ｂ−ａ）／ｂＩＸ１００ によ
り計算した。純品のアルファメニンへの本測定によるア
ミノペプチダーゼＢ５Ｑ慢阻害濃度（■Ｃ３ｏ）は０．
００５１ｎａｇ ／ ｔｎｌ！であシ、 ゛純品のアル
ファメニンＢのそれは帆００２ ｍｃｇ ／ ｍｌであ
る。これらの物質を標準とし、アルファメニンの単位を
ｎａｇ（力価）、り（力価）の如＜ｉｆ力価で表わす。
なお、培地組成及びアミノ酸添加量を示すチは（重ｆ／
容饋）係による。
容饋）係による。
実験例１
本発明培地と既存の培地とのアルファメニン生産能の比
較を次のようにして行った。
較を次のようにして行った。
１・ 培地条件
（１） 本発明の培地Ａ
可溶性デンプン３ｑ６．プロリツチ０．５ ｑ６． コ
ーングルテンミール１．２ｔＩｋ、炭酸カルシウム０．
２係、Ｌ−フェニルアラニ／１．０１及び残部、水 （２） 本発明の培地Ｂ 可溶性デンプン３チ、プロリッチ０．５％、コーングル
テンミール１．２＊、炭酸カルシウム０．２優、Ｌ−フ
ェニルアラニン１．０チ、Ｌ−アルギニン（１塩酸塩）
０．５チ及び残部、水（３）本発明の培地Ｃ 可溶性デンプン３チ、プロリッチ０．５１ コーングル
テンミール１．２１．炭酸カルシウム０．２％、Ｌ−チ
ロシン０．５１及び残部、水（４） 既存の生産用培地
（対照） 可溶性ｒンプ：’ ３ ％＃ ７’ Ｃ” リツｆ ０
．５ ％ｔ ：ｆｆ−ングルテンミール１．２’％、炭
酸力ルシクム０．２悌及び残部、水 ２・ 使用菌株 クロモバクテリウム・ビオラヒウムＢＭＧ３６１− Ｃ
Ｆ’ ４株（微工研菌寄第６５２１号）８・ 培養条件 ５００−のロータリーフラスコに培地１ ｌ 。
ーングルテンミール１．２ｔＩｋ、炭酸カルシウム０．
２係、Ｌ−フェニルアラニ／１．０１及び残部、水 （２） 本発明の培地Ｂ 可溶性デンプン３チ、プロリッチ０．５％、コーングル
テンミール１．２＊、炭酸カルシウム０．２優、Ｌ−フ
ェニルアラニン１．０チ、Ｌ−アルギニン（１塩酸塩）
０．５チ及び残部、水（３）本発明の培地Ｃ 可溶性デンプン３チ、プロリッチ０．５１ コーングル
テンミール１．２１．炭酸カルシウム０．２％、Ｌ−チ
ロシン０．５１及び残部、水（４） 既存の生産用培地
（対照） 可溶性ｒンプ：’ ３ ％＃ ７’ Ｃ” リツｆ ０
．５ ％ｔ ：ｆｆ−ングルテンミール１．２’％、炭
酸力ルシクム０．２悌及び残部、水 ２・ 使用菌株 クロモバクテリウム・ビオラヒウムＢＭＧ３６１− Ｃ
Ｆ’ ４株（微工研菌寄第６５２１号）８・ 培養条件 ５００−のロータリーフラスコに培地１ ｌ 。
−を仕込み、それに前培養した菌液０．５−を接種して
２６〜２８°Ｃの温度で毎分１８０回転で培養し経時的
にアルファメニンの力価を測定したＯ ここで使用した菌液は次のようにして作成した・すなわ
ち可溶性デンプン３蝿、プロリッチ０．５ｆｉ、コーン
グルテンミール１．２％、炭酸カルシウム０．２％（ｐ
Ｈ７，４）からなる種培地１１０ｍｇヲ５００ｍ７！の
ロータリーフラスコに分注し、これを１２０００．２０
分間、波菌した後、クロモバクテリウム・ビオラセウム
Ｂ ＭＧ ３６１− ＣＦ４株の斜面培養から１白金耳
量を採取接種し、２７０Ｃで２０時間振盪培養したもの
である。
２６〜２８°Ｃの温度で毎分１８０回転で培養し経時的
にアルファメニンの力価を測定したＯ ここで使用した菌液は次のようにして作成した・すなわ
ち可溶性デンプン３蝿、プロリッチ０．５ｆｉ、コーン
グルテンミール１．２％、炭酸カルシウム０．２％（ｐ
Ｈ７，４）からなる種培地１１０ｍｇヲ５００ｍ７！の
ロータリーフラスコに分注し、これを１２０００．２０
分間、波菌した後、クロモバクテリウム・ビオラセウム
Ｂ ＭＧ ３６１− ＣＦ４株の斜面培養から１白金耳
量を採取接種し、２７０Ｃで２０時間振盪培養したもの
である。
小、結果
結果は第１表に示した通りである。
上表から明らかなように、本発明の培地Ａ（主生産物ア
ルファメニンＡ）１本発明の培地Ｂ（主生産物アルファ
メニンＡ）および本発明の培地Ｃ（主生産物アルファメ
ニンＢ）Ｕ対照として用いた既存の生産用培地に比して
４〜１２倍のアルファメニン生産性を示した。
ルファメニンＡ）１本発明の培地Ｂ（主生産物アルファ
メニンＡ）および本発明の培地Ｃ（主生産物アルファメ
ニンＢ）Ｕ対照として用いた既存の生産用培地に比して
４〜１２倍のアルファメニン生産性を示した。
又、前記特願昭５７−９６２７６号の実＆亀例の中で得
られている最高力価７０ ｍｃｇ ／ｍｌ （ｒｃ、ｏ
Ｏ，０５μｔ ／ ｍｅ よシアルファメニンＡ：Ｂ；
１：１として算出）に比べると、２〜７倍の生産性向上
であるが、本発明の場合にはアルファメニンＡ又はＢを
選択的に何れかを主体として生産することができるとい
う点に太き外特長がある。
られている最高力価７０ ｍｃｇ ／ｍｌ （ｒｃ、ｏ
Ｏ，０５μｔ ／ ｍｅ よシアルファメニンＡ：Ｂ；
１：１として算出）に比べると、２〜７倍の生産性向上
であるが、本発明の場合にはアルファメニンＡ又はＢを
選択的に何れかを主体として生産することができるとい
う点に太き外特長がある。
実験例２
Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェニルアラニン及ヒＬ−チロシ
ンの適切な添加量の範囲を測定するため実願例１と同様
に培養した・但し、培地条件は下記の如く少し変更した
。
ンの適切な添加量の範囲を測定するため実願例１と同様
に培養した・但し、培地条件は下記の如く少し変更した
。
■、培地条件
基礎培地として公知の生産用培地、すなわち可酸性ｒン
プン３−．プロリッチ０．５１ コーンダルテ／ミーｋ
１．２チ、炭酸カルシ１７ Ａ Ｏ，２チ（残部、水）
を使用し、これに次表に示した如く、Ｌ−アルギニン（
塩酸塩）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンの容量
を添加した培地を用いた。
プン３−．プロリッチ０．５１ コーンダルテ／ミーｋ
１．２チ、炭酸カルシ１７ Ａ Ｏ，２チ（残部、水）
を使用し、これに次表に示した如く、Ｌ−アルギニン（
塩酸塩）Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンの容量
を添加した培地を用いた。
２、使用菌１朱
実験例１に同じ０
）３．培養条件
笑験１１ＨＪ ｌに同じ。
４・結果
結果はＭ２表及び第３表の通りである。
第３表 丁、−チロシンの添加囚の影響（最大力価）注
＋ （ａｌ ： アルファメニンＡ：Ｂ＝ド１とし、て
算出（ｂ）＝ アルファメニンＢのみと【７て算出カッ
コ内は■Ｃ６ｏ（μＬ／−）を示す。
＋ （ａｌ ： アルファメニンＡ：Ｂ＝ド１とし、て
算出（ｂ）＝ アルファメニンＢのみと【７て算出カッ
コ内は■Ｃ６ｏ（μＬ／−）を示す。
第２表におけるアルファメニン生産ｔをみると、Ｌ−フ
ェニルアラニン及ヒＬ −”’ｒルキ＝ン無瀞加の場合
の４ （ｌ ｍｃｇ ／ ｍｌ （力価）に対し、Ｌ−
フェニルアラニン単独４シ＜ Ｉｒ、Ｌ Ｌ −フ：ｒ
、 ＝ルアラニンとＬ−アルギニン（−塩！［）を同時
に０．２〜２−添加し、た場合には、アルファメニンＡ
の生産力価１６０〜５６０ｍｃｇ／ｒＪと極めて優れた
生産性向上を示した・これは無添加の場合に比べ４〜１
４倍のアルファメニン４ｆ［基を示し７ている。又、前
記特許出願の実紬例に見られる最高力価（７０ｍｃｇ／
ｄ ）に比較しても２〜８倍の生産性向上を示している
。
ェニルアラニン及ヒＬ −”’ｒルキ＝ン無瀞加の場合
の４ （ｌ ｍｃｇ ／ ｍｌ （力価）に対し、Ｌ−
フェニルアラニン単独４シ＜ Ｉｒ、Ｌ Ｌ −フ：ｒ
、 ＝ルアラニンとＬ−アルギニン（−塩！［）を同時
に０．２〜２−添加し、た場合には、アルファメニンＡ
の生産力価１６０〜５６０ｍｃｇ／ｒＪと極めて優れた
生産性向上を示した・これは無添加の場合に比べ４〜１
４倍のアルファメニン４ｆ［基を示し７ている。又、前
記特許出願の実紬例に見られる最高力価（７０ｍｃｇ／
ｄ ）に比較しても２〜８倍の生産性向上を示している
。
又、第３表におけるアルファメニン生産量ヲ見ると、Ｌ
−チロシンを帆２〜１．０チ添加した場合、無添加の場
合に比べて優れた生産性向上を示した。
−チロシンを帆２〜１．０チ添加した場合、無添加の場
合に比べて優れた生産性向上を示した。
コレらのことがらＬ−フェニルアラニアｆ−４Ｏ９２〜
２．０％添加するとき、Ｌ−チロシンは０．２〜１．０
％添加するとき、Ｌ−アルギニン（−塩酸塩）は０．５
〜１．０−をＬ−フェニルアラ二／と同時に添加すると
き、特異的にアルファメニンの生産量を増大できること
が確認できた。
２．０％添加するとき、Ｌ−チロシンは０．２〜１．０
％添加するとき、Ｌ−アルギニン（−塩酸塩）は０．５
〜１．０−をＬ−フェニルアラ二／と同時に添加すると
き、特異的にアルファメニンの生産量を増大できること
が確認できた。
以上に述べたように本発明はクロモバクテリウム弯に属
しアルファメニンを生産する微生物を培養してアルファ
メニンを製造する際、培地ＫＬ−フェニルアラニン、Ｌ
−チロシン及ヒＬ−アルギニンを単独又は組み合わせて
０．２−〜２、〇−添加することによシ従来の代表的な
培地に比べ大巾にアルファメニンの生産量を増大させる
ものである。この際Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−フェ
ニルアラニン及びＬ′−アルギニン塩酸塩の添加の場合
はアルファメニンＡを、Ｌ−チロシン添加の場合はアル
ファメニンＢを特異的に主体として生産させることがで
きる。
しアルファメニンを生産する微生物を培養してアルファ
メニンを製造する際、培地ＫＬ−フェニルアラニン、Ｌ
−チロシン及ヒＬ−アルギニンを単独又は組み合わせて
０．２−〜２、〇−添加することによシ従来の代表的な
培地に比べ大巾にアルファメニンの生産量を増大させる
ものである。この際Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−フェ
ニルアラニン及びＬ′−アルギニン塩酸塩の添加の場合
はアルファメニンＡを、Ｌ−チロシン添加の場合はアル
ファメニンＢを特異的に主体として生産させることがで
きる。
実６１例１
可溶性澱粉３．０優、ノａリッチ０．５％、炭酸カル７
クム０．２１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン０．５％。
クム０．２１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン０．５％。
グルテンミール１．２％、燐酸−ナトリウム０．３％。
消泡剤（ＫＭ−７２）ｏ、ｏ ５ 優及び水からなる培
地５ｏｏｔを２ｏｏｏｔステンレス製タンクに仕込み１
２０°ＣＩ ２０分間截菌後、クロモバクテリタム・ビ
オラセウム・Ｂ Ｍ Ｇ ’３６１− ＣＦ’４ 株（
微工研菌寄第６５２１号）の種培養液（通気攪拌培養１
日）＋６ｔを植菌し、攪拌は毎分１５０回転、通気量は
毎分５ｏｏｔで、２８°Ｇ４５時間培養を行なった。こ
の培養Ｐ液は、アルファメニンＡとして１’７０ｍｃｇ
／−の力価を示１−た・この培養液を塩酸でｐＨ２に調
整した彼、菌体及び不治物をｐ遇した。得られたＰ液は
、苛性ソーダで閾１６に調整［７た彼再び濾過しＳＦ液
５９０ｔを得た。
地５ｏｏｔを２ｏｏｏｔステンレス製タンクに仕込み１
２０°ＣＩ ２０分間截菌後、クロモバクテリタム・ビ
オラセウム・Ｂ Ｍ Ｇ ’３６１− ＣＦ’４ 株（
微工研菌寄第６５２１号）の種培養液（通気攪拌培養１
日）＋６ｔを植菌し、攪拌は毎分１５０回転、通気量は
毎分５ｏｏｔで、２８°Ｇ４５時間培養を行なった。こ
の培養Ｐ液は、アルファメニンＡとして１’７０ｍｃｇ
／−の力価を示１−た・この培養液を塩酸でｐＨ２に調
整した彼、菌体及び不治物をｐ遇した。得られたＰ液は
、苛性ソーダで閾１６に調整［７た彼再び濾過しＳＦ液
５９０ｔを得た。
このｐ液に活性炭（和光紬薬；クロマト用）５ゆを加え
１時間攪拌した。アルファメニンを吸着した活性炭をＦ
取し、水５０４で洗浄後、５０ｑ６ア七ト／水４０ ｔ
（ＰＴＩ ２に塩酸でＰＩ整）で３回抽出した。抽出
後１０８Ｌを苛性ソーダでｐｌ（５，０に調整後、波圧
下に濃縮し濃縮液２１．４ｔｆ：得た。
１時間攪拌した。アルファメニンを吸着した活性炭をＦ
取し、水５０４で洗浄後、５０ｑ６ア七ト／水４０ ｔ
（ＰＴＩ ２に塩酸でＰＩ整）で３回抽出した。抽出
後１０８Ｌを苛性ソーダでｐｌ（５，０に調整後、波圧
下に濃縮し濃縮液２１．４ｔｆ：得た。
との濃縮液をアンバーライトＸＡＤ −４のカラム（５
ｔ）にかけ水６ｔで洗浄後、５０ｑ６ア七トン水６ ｔ
、 ｐ）（２，０（ＨＣ／ ） −ｓ ｏφア七トン水
４ｔで順次鯵出した。アルファメニ／ハ水洗の後半から
溶出され始める。
ｔ）にかけ水６ｔで洗浄後、５０ｑ６ア七トン水６ ｔ
、 ｐ）（２，０（ＨＣ／ ） −ｓ ｏφア七トン水
４ｔで順次鯵出した。アルファメニ／ハ水洗の後半から
溶出され始める。
ＴＬＣ，ＨＰＬＣ分析によりアルファメ二ンヲ含む分画
を集め減圧下に濃縮し３．１５ｔの濃縮液を得九〇 この濃縮液を塩酸で−１４，５に調整しｐＨ４，５の０
．０５Ｍクエン酸−クエン酸ナトリクム緩衝液（０，０
５Ｒ（ＮａＣｌ 含有）で平衡化したＣ Ｍセファデッ
クス（Ｃ−２５）のカラム（８１）にかけ上記緩衝液１
６ｔで予洗した。次いでｐｔｉ ４．５の０．０５Ｍク
エ／酸緩衝液の？ＪａＣ１含有量で０．０５Ｍから０．
６λ檀（２ｏｚ−２ｏｚ）のグラジェント溶出を行々う
た。
を集め減圧下に濃縮し３．１５ｔの濃縮液を得九〇 この濃縮液を塩酸で−１４，５に調整しｐＨ４，５の０
．０５Ｍクエン酸−クエン酸ナトリクム緩衝液（０，０
５Ｒ（ＮａＣｌ 含有）で平衡化したＣ Ｍセファデッ
クス（Ｃ−２５）のカラム（８１）にかけ上記緩衝液１
６ｔで予洗した。次いでｐｔｉ ４．５の０．０５Ｍク
エ／酸緩衝液の？ＪａＣ１含有量で０．０５Ｍから０．
６λ檀（２ｏｚ−２ｏｚ）のグラジェント溶出を行々う
た。
アルファメニンを含む分画を集め減圧下に濃縮し、析出
する沈澱を戸去した後、再度上記と同じ緩衝液で平衡化
したＣＭ−セファデックス（Ｃ−２５）のカラム（４ｔ
）にかけ０．０５ Ｍ −ＮａＣｌ８ｔｃ予洗した。次
いで０．０５ Ｍ ＮａＣｌ から０．５ＭＮａＣ／
（１ｏｚ−１ｏｔ）のグラジェント溶出を行左っだ。
する沈澱を戸去した後、再度上記と同じ緩衝液で平衡化
したＣＭ−セファデックス（Ｃ−２５）のカラム（４ｔ
）にかけ０．０５ Ｍ −ＮａＣｌ８ｔｃ予洗した。次
いで０．０５ Ｍ ＮａＣｌ から０．５ＭＮａＣ／
（１ｏｚ−１ｏｔ）のグラジェント溶出を行左っだ。
アルファメニンを含む分画を集め減圧下に濃縮し析出す
るＮａ（？／ を枦去した後セファデックスＬＴ（２０
０カラム（４ｔ）にかけ水で展開した。ここでＴＬＣ的
に単一のスＩットを与えるアルファメニン分画が得られ
た。アルファメニン分画を少量の活性炭で脱着後、凍結
乾燥すると４１．ｓｒのアルファメニンＡ塩酸塩の粉末
が得られり＠コノ粉末はアミノペプチダーゼＢに対し０
．００５ ｍｃｇ ／＋＋＋／の■Ｃ５ｏ を示し九〇 実ｉ例２ ＷｍｆｆｌＪｌの培地の中でＬ−フェニルアラニンの代
りにＬ−チロシンを用い、その他は全く同様に培養を行
ない、２９時間後に培養終了した。その培参ろ液はアＡ
ファメニ／Ｂとして１７９ｍｃｇ／−の力価を示した〇 その後のｐ過Ｓｆ＃製は実砲例１と全く同様に処理し、
最終的にアルファメニンＢ塩叡塩の粉末２２、Ｏｒを得
た。この粉末はアミノペプチダーゼＢに対し０・００２
ｍｅｇ ／ ｍｅのＩＣ，。を示した。
るＮａ（？／ を枦去した後セファデックスＬＴ（２０
０カラム（４ｔ）にかけ水で展開した。ここでＴＬＣ的
に単一のスＩットを与えるアルファメニン分画が得られ
た。アルファメニン分画を少量の活性炭で脱着後、凍結
乾燥すると４１．ｓｒのアルファメニンＡ塩酸塩の粉末
が得られり＠コノ粉末はアミノペプチダーゼＢに対し０
．００５ ｍｃｇ ／＋＋＋／の■Ｃ５ｏ を示し九〇 実ｉ例２ ＷｍｆｆｌＪｌの培地の中でＬ−フェニルアラニンの代
りにＬ−チロシンを用い、その他は全く同様に培養を行
ない、２９時間後に培養終了した。その培参ろ液はアＡ
ファメニ／Ｂとして１７９ｍｃｇ／−の力価を示した〇 その後のｐ過Ｓｆ＃製は実砲例１と全く同様に処理し、
最終的にアルファメニンＢ塩叡塩の粉末２２、Ｏｒを得
た。この粉末はアミノペプチダーゼＢに対し０・００２
ｍｅｇ ／ ｍｅのＩＣ，。を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １６ クロモノ導クテリクム属に属するアルファメニン
生産菌を培養してアルファメニンを製造する方法におい
て、培地にＬ−フェニルアラニア、 Ｌ−チロシン及び
Ｌ−アルギニンを単独に又は、２種以上の組み合せで添
加することを特徴とするアルファメニンの高収率製造法
。 ２、培地にＬ−フェニルアラニ／またはＬ−フェニルア
ラニンとＬ−アルギニ７を添加して培！し、アルファメ
ニンＡを主体に生産する特許請求範囲第１項記載の方法
・ − ８・ 培地に”Ｌ−チロシンを添加して培養し、アルフ
ァメニンＢを主体に生産する特許請求範囲第：項記載の
方法。 ４、Ｌ−フェニルアラニ／又はＬ−アルギニンを培地に
０．２〜２．〇−添加する特許請求範囲第１項又は鶴２
項記載の方法。 ５、Ｌ−チロシンを培地に０．２〜１．０チ添加する特
許請求範囲第１項ないし第３項の何れかに記載の方法・
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58142527A JPS6034190A (ja) | 1983-08-05 | 1983-08-05 | アルフアメニンの高収率製造法 |
| DE8484109151T DE3480216D1 (en) | 1983-08-05 | 1984-08-02 | Process for producing arphamenine in high yield |
| EP84109151A EP0133550B1 (en) | 1983-08-05 | 1984-08-02 | Process for producing arphamenine in high yield |
| AT84109151T ATE47427T1 (de) | 1983-08-05 | 1984-08-02 | Verfahren zur herstellung von arphamenin mit hoher ausbeute. |
| DK378984A DK378984A (da) | 1983-08-05 | 1984-08-03 | Fremgangsmaade til fremstilling af arphamenin i hoejt udbytte |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58142527A JPS6034190A (ja) | 1983-08-05 | 1983-08-05 | アルフアメニンの高収率製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6034190A true JPS6034190A (ja) | 1985-02-21 |
Family
ID=15317427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58142527A Pending JPS6034190A (ja) | 1983-08-05 | 1983-08-05 | アルフアメニンの高収率製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0133550B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6034190A (ja) |
| AT (1) | ATE47427T1 (ja) |
| DE (1) | DE3480216D1 (ja) |
| DK (1) | DK378984A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06247964A (ja) * | 1993-02-22 | 1994-09-06 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規生理活性物質ｈｓ−１及びその製造方法 |
| EA003101B1 (ru) | 1998-03-19 | 2002-12-26 | Бристол-Майерз Сквибб Компани | Двухфазная система доставки с регулируемым высвобождением для фармацевтических средств с высокой растворимостью и способ лечения диабета с помощью этой системы |
| MX342120B (es) | 2010-07-09 | 2016-09-14 | William Owen Wilkison | Combinación de sistema de liberación prolongada/inmediata para productos farmacéuticos de vida media corta como el remogliflozin. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58212791A (ja) * | 1982-06-07 | 1983-12-10 | Microbial Chem Res Found | 新生理活性物質アルフアメニン及びその製造法 |
-
1983
- 1983-08-05 JP JP58142527A patent/JPS6034190A/ja active Pending
-
1984
- 1984-08-02 DE DE8484109151T patent/DE3480216D1/de not_active Expired
- 1984-08-02 EP EP84109151A patent/EP0133550B1/en not_active Expired
- 1984-08-02 AT AT84109151T patent/ATE47427T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-08-03 DK DK378984A patent/DK378984A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0133550A2 (en) | 1985-02-27 |
| DE3480216D1 (en) | 1989-11-23 |
| DK378984D0 (da) | 1984-08-03 |
| DK378984A (da) | 1985-02-06 |
| EP0133550B1 (en) | 1989-10-18 |
| EP0133550A3 (en) | 1987-04-01 |
| ATE47427T1 (de) | 1989-11-15 |
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