JPS62181793A - バリエナミンおよびバリダミンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バリエナミンおよび（または）バリダミンの
製造法に関する。

バリエナミン、バリダミンおよびバリエナミンから誘導
されろパリオールアミンは、それぞれα−グルコシダー
ゼ阻害活性を有しており、肥満、脂肪過多、糖尿病など
の予防、治療薬として有用である。そしてこれらのＮ−
置換体にはさらに強力なα−グルコシダーゼ阻害活性を
有するものが知られている（特開昭５７−６４６４８．
特開昭５７−１１４５５４゜特開昭５７−２００３３６
）。したがってバリエナミンやバリダミンはそれら置換
体の原料化合物としても重要なものである。

良朱Δ遺直 本発明者らは先にバリダマイシンＡまたはバリドキシル
アミンＡにシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏａｏｎａｓ　　ｄｅｎｉｔｒＨｉｃａｎｓ）の
菌体を作用させることにより、バリエナミン （ｖａｌｉｅｎａａ＋ｉｎｅ　；ｌ　Ｌ−（１，３，４
／２）−４−アミノ−６−ヒドロキシメチル−５−シク
ロヘキセン−１，２，３−トリオール〕およびバリダミ
ン（ｖａｌｉｄａｍｉｎｅ　：１Ｌ−（１，３，４／２
．６）−４−アミノ−Ｇ−ヒドロキシメチル−１，２，
３−シクロヘキザントリオール〕が得られること〔ジャ
ーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアテイ・ケミカル
・コミュニケーション（Ｊ、　Ｃｈｅｎ＋、　Ｓｏｃ、
　ＣｈｅＩｌ。

Ｃｏｖ＋＋ｕｎ、）　１９７２年、　７４６〜７４７頁
〕、フラボバクテリウム・サツカロフィルム（Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｍ）
　Ｉ　Ｆ　０　１３９８４がバリダマイシンをバリダミ
ンおよびバリエナミンに分解しうろこと（特開昭５’？
　−５４５９３）、またサイトファーガ・ヘパリナ（Ｃ
ｙｔｏｐｈａｇａ　　ｂｅｐａｒｉｎａ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ
１２０１？。

Ａ　Ｔ　ＣＣ１３１２５が同様にバリダマイシンをバリ
ダミンおよびバリエナミンに分解しうろこと（特開昭５
８−１５２４９６）を見いだした。

発明が解決しようとする問題へ 本発明者らは、前述の属に属する微生物以外にもバリダ
マイシンやバリドキシルアミンを分解して効率よくバリ
ダミンおよび（または）バリエナミンを生成しうろもの
が存在しないかと鋭意研究を川ねできた。

問題を解決するための手段 その結果、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属およびアエロモナス（Ａｅｒｏａ＋ｏｎａｓ
）属に属する微生物またはその処理物がバリダマイシン
またはバリドキシルアミンに作用して効率よくバリエナ
ミンおよび（または）バリダミンを生成しうろことを見
出し、本発明を完成するに至った。

即し、本発明は、アグロバクテリウム属またはアエロモ
ナス属に属し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミ
ンに作用してバリエナミンおよび（または）バリダミン
を生成しうる酵素を産生ずる微生物またはその処理物を
バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用させろ
ことを特徴とするバリエナミンおよび（または）バリダ
ミンの製造法である。

本発明の方法において原料として用いられろバリダマイ
シンの化学構造は、バリドキシルアミンとＤ−グルコー
スとから成り立っている。パリドキシルアミンは現在Ａ
、ＢおよびＧが知られており、そのバリドキシルアミン
Ａ、Ｉ３およびＧとＤ−グルコースとの組み合わせによ
りバリダマイシンは、Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ’、Ｇと
して存在することが知られている〔ザ・ジャーナル・オ
ブ・アンティバイオティクス（Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｓ）第２５巻、４８〜５３頁（１９７２年）および
昭和６１年特許願第９５９４０号参照〕。

本発明方法においては、このようなバリダマイシン、バ
リドキシルアミンあるいはその混合物を原料として用い
ることができ、たとえばバリダマイシン生産閑の培養物
あるいはその処理物がを利に用いられる。

本発明の方法で用いられる微生物は、バリダマイシンま
たはパリドキシルアミンをバリエナミンおよび（または
）バリダミンに変換する能力を有するアグロバクテリウ
ム属またはアエロモナス属に属する微生物およびその変
異株であればいずれでもよく、アグロバクテリウム属に
属する微生物としては、例えば、アグロバクテリウム・
ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｒａ
ｄｉｏｂａｃｔｃｒ）　Ｉ　Ｆ　０１２６６４（Ａ　’
ｒ　ＣＣ４７１ｇ）株、　Ｉ　Ｉ”　０　１３２５８（
Ａ　Ｔ　ＣＣＨ３３２）株、Ｉ　ＦＯ１３２５９（ＡＴ
ＣＣ１３３３３）株、ＩＦｏ　　１３５３２（Ａ’ｒＣ
Ｃ１９３５８）株。

Ｉ　Ｆ　Ｏ１３５３３（Ａ　’ｌ”　ＣＣ２５２３５）
株、およびアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ
ｇｒｏｂａｃｒｅ　−ｒｉｕｍ　　ｔｕｍｃｒａｃｉｅ
ｎｓ）　ｌ　Ｆ　０　３０５８株等が、アエロモナス属
に属する微生物としては、例えば、アエロモナス・ハイ
ドロフィラ・サブスピーシス・アエロモナス（Ａｃｒｏ
ｍｏｎａｓ　　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ　　５ｕｂｓｐ。

ａｎａａｒｏｇｅｎｅｓ）　Ｉ　Ｐ　０　１３２８２．
同すブスピーシス会ハイドロフィラ（ｓｕｂｓｐ、　　
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）　Ｉ　Ｆ　０Ｈ２８６，同サブ
スピーシス・プロテオリティカ（ｓｕｂｓｐ、　　ｐｒ
ｏＬｅｏｌｙｔｉｃａ）、アエロモナス・バンクタータ
・サブスピーシス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｐｕ
ｎｃｔａｔａ　　５ｕｂｓｐ、　　ｃａｖｉａｅ）　Ｉ
　Ｆ　Ｏ１３２８８，およびアエロモナス・サルモニシ
グ・サブスピーシス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｓｏｎａ
ｓ　　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ　　５ｕｂｓｐ。

５ａｌｓｏｎｉｃｉｄａ）　Ｉ　Ｐ　０　１２６５９等
が挙げられる。

上記の微生物の培養に用いられる培地は上記の菌株が利
用し得ろ栄養源を含むものなら、液体でも固状で６よい
が、大ｍを処理するときには液体培地を用いるのがより
適当である。培地には上記の微生物が利用し得る炭素源
、消化し得る窒素源。

無機物質、微量栄養素等が配合される。炭素源としては
、たとえばぶどう糖、乳糖、しょ糖、麦芽糖。

デキストリン、でん粉、グリセリン、マンニトール。

ソルビトール等の炭水化物類や油脂類（例えば、大豆油
、ラード油、ヂキン油等）その他が、窒素源としては、
例えば肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母。

大豆粉、コーン・スチープ・リカー、ペプトン、綿実粉
、糖蜜、尿素、アンモニウム塩類（例えば、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム等）その他が用いられる。さらにナトリウム
、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン
、亜鉛、コバルト、ニッケルなどの金属塩類、りん酸、
硫酸、硝酸、炭酸、塩酸などの塩類や酢酸、プロピオン
酸、酪酸、酒石酸、くえん酸。

フマル酸、グルコン酸などの有機酸の塩類が適宜用いら
れる。その他、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アス
パラギン酸、グリシン、アラニン、バリン、リジン、メ
チオニン、プロリン等）、ペプチド（例えば、ジペプチ
ド、トリペプチド等）、ビタミン類（例えば、Ｂ、、１
３．、ニコチン酸、Ｉ３．ｔ、ｃ等）、核酸ｍ（例えば
、プリン、ピリミジンおよびその誘導体等）等を含有さ
せてもよい。もちろん培地のｐ■を調節する目的で無機
または有機の酸、アルカリ類、緩衝剤等を加え、あるい
は消泡の目的で油脂類１表面活性剤等の適量を添加して
もよい。

微生物を培養オろ手段としては静置培養、振盪培養、通
気培養あるいは攪拌培養法等の手段が単独または組み合
わＵ・て用いられる。大ｍ培畏には、いわゆる深部通気
攪拌培養が望ましい。培養の条件は培地の状態８組成、
菌株の種類、培養の手段等によっても異なるが、通常、
１５℃〜４０℃の温度で初発ｐＨを中性附近に選択する
のがよい。培養中期の温度は２０℃〜３０℃、また初発
ｐＨは６．５〜８．５の条件が望ましい。培養時間は６
〜１００時間程度で良いが、とくに１６〜６０時間が良
好である。

本発明では、上記の微生物あるいはその処理物を用いる
ことができる。該微生物はどのような存在状態にあるも
のでもよく、例えば、培養物中に存在ずろままの状態の
ものであっても、また培養物に公知の手段を施すことに
より含まれる微生物の菌体濃度を変化させたものであっ
ても、菌体のみを取り出した状態のものであってもよい
。ここに「処理物」とは、該微生物の菌体に、例えば、
超音波処理、フレンチプレス処理、アルミナ磨砕、溶菌
酵素処理、界面活性剤処理、有機溶媒処理等の物理、化
学的処理を単独または組み合わすで行なうことによって
得られる、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに
作用してバリエナミンおよび（または）バリダミンを生
成しうる酵素を含有する菌体破砕物、あるいは、上記の
微生物の培養物、菌体または菌体破砕物に、微生物酵素
の単離精製法として公知の処理を施して得られろ、バリ
ダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用してバリエ
ナミンおよび（または）バリダミンを生成しつる酵素お
よび酵素含有物をいう。微生物またはその処理物は、公
知の方法で固定化したものであってもよい。

本発明方法は、原料化合物と上記の微生物またはその処
理物とを接触させろことにより行なわれる。反応液中の
原料化合物の濃度は１〜５％が適当である。反応温度は
１５〜４５℃、初発ｐＩｔは５〜８が適当であるが、特
に温度は２４〜３０℃、初発ｐＨは６．５〜７．５が良
好である。反応時間は反応液に加えろ上記の微生物の発
育状態および菌体量によってし異なるが、２４〜２００
時間、さらに好ましくは４８〜１ＧＧ時間が適当である
。また反応は静止、振盪。

通気または攪拌の条件下でもよいが、振盪１通気または
攪拌する方が良好な結果が得られる。反応液中には、所
望により反応促進剤、酵素安定化剤。

防腐剤などを添加してもよい。

反応液中から目的物を採取するには、通常微生物代謝物
を採取するのに用いられる手段が単独あるいは組み合わ
せて、または反復して用いられろ。

ずなわら、たとえば、濾過、遠心分離、ａ縮、乾燥。

凍結乾燥、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を
利用する方法（たとえば、沈澱、結晶化、再結晶）、ク
ロマトグラフィーなどか用いられろ。またバリエナミン
およびバリダミンが水に可溶で、一般の有機溶媒に難溶
な塩基性物質であることを利用して、いわゆる水溶性塩
基性物質の単離精製に用いられろ方法、たとえばイオン
交換樹脂、活性炭、ハイポーラスポリマー、セファデッ
クス、セファデックスイオン交換体、セルローズ、イオ
ン交換セルローズ、シリカゲル、アルミナ等を用いるク
ロマトグラフィーや吸脱着法が有利に用いられる。

発明の効果 上記のように、アグロバクテリウム属またはアエロモナ
ス属に属する微生物またはその処理物をバリダマイシン
やバリドキシルアミンに作用させることによって、α−
グルコシダーゼ阻害剤の製造原料として有用な化合物で
あるパリエナミンおよび（または）バリダミンを効率よ
く製造することができる。本特許の方法は、更に発酵工
学の分野で一般に行なわれている菌株の育種改良、培養
条件や反応条件の改良を行なうことによって、工業的規
模でのバリエナミンおよび（または）バリダミンの製造
法の一つとして用いろことが可能である。

また工業的規模での発酵生産においてバクテリオファー
ジの汚染により大きな被害を受けることがある。この様
な汚染があった場合、先願の方法で用いろフラボバクテ
リウム属やサイトファーガ属菌種と本出願の方法で用い
るアグロバクテリウム属やアエロモナス属菌種とは系統
的に全く異なるので、互いにファージ汚染を回避するこ
とが可能であり、使用する菌種を互いに変えることによ
りて生産を継続することができる。

また、アグロバクテリウム属またはアエロモナス属に属
し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用し
てバリエナミンおよび（または）バリダミンを生成しう
ろ酵素を産成ずろ微生物またはその処理物をバリダマイ
シンＧ（バリダマイシンへのバリダミン部分がパリオー
ルアミンで置き換わった構造の化合物）およびバリドキ
シルアミンＧ（バリドキシルアミンへのバリダミン部分
がパリオールアミンで置き換わった構造の化合物）（昭
和６１年特許願第９５９４０号参照）に作用させた場合
にはパリオールアミンおよび（または）バリエナミンが
生成する。

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１゜ ａ）２Ｌ坂ロフラスコ中、トリブチカーゼ（Ｔｒｉｐｔ
ｉｃａｓｅ■、ＢＢＩ、社製）１５ｇを水５００ｅＬに
溶解し、滅菌後アグロバジテリウム・ラジオバクター（
Ｉ　Ｆ　Ｏ１２６６４，Ａ　Ｔ　ＣＣ４７１ｇ）を接種
し、２８℃で２４時間振盪培養した。一方、５０Ｌ発酵
槽中にポリペプトンａｏｏｇ、酵母エキス２１０ｇおよ
び塩化ナトリウム９０ｇを水３０Ｌに溶解し、消泡剤（
アクトコール、Ａｃｔｏｃｏｌｏ、成田薬品工業製）１
５ｇを加え、ｐＨ７゜１に調整して、滅菌した。この前
培養培地に前記微生物の培養液を加え、２８℃で、通気
、攪拌下に２４時間培養した。この培養液のうち５Ｌを
、２ＧＯＬ発酵槽中で硫酸アンモニウム１．０ｋｇ、り
ん酸−水素カリウム０．７ｋｇ、りん酸二水素カリウム
０．３ｋｇ、硫酸マグネシウム０．０１ｋｇ、およびバ
リダマイシンＡの粗製液（バリダマイシンＡ含有率：約
２０％）ＩＯＬを水１００Ｌに溶解し、消泡剤０．０５
ｋｇを加え、Ｉ）１１７．１に調整し、滅菌した主発酵
培地に移植した。反応は２８℃で、通気、攪拌下に９６
時間培養して行なった。

ｂ）　　ａ）で得られた反応液を遠心分離し、上澄液を
アンバーライトＩｎ　ｃ　−５０（Ｎｌｌｒ型、ローム
・アンド・ハース社製）のカラム３０Ｌに通過吸着させ
、カラムを水９０Ｌで洗浄後、０．５Ｎアンモニア水で
溶出した。溶出画分（フラクションＮｏ、５〜１０；各
フラグ、ジョンｌ０Ｌ）を集め、約３．８Ｌにまで減圧
濃縮した。

上記ノ濃縮液のうちｆ）　１　／　ｌＯｆｌｏｆｆｌ（
３８０をダウエックスｌｘ　２　（Ｏｌｌ−型、ダウ・
ケミカル社製）のカラムクロマトグラフィー（１，８Ｌ
）に付し、カラムを水で溶出した。各溶出画分は薄届ク
ロマトグラフィー〔シリカゲル６０Ｆ□４（メルク社製
）；展開溶媒、ｎ−プロピルアルコール・酢酸・水（４
：　ｌ　：り：呈色試薬、ニンヒドリン；バリエナミン
Ｒｒ＝０．４２．バリダミン１ｆ＝０．３５）で調べた
。先に溶出してくるバリダミンの溶出画分を集め減圧濃
縮後、凍結乾燥するとバリダミンの白色粉末（７，１ｇ
）が得られた。結晶化はメタノール−エタノールで行な
った。後に溶出してくるバリエナミンの溶出画分を　。

集め減圧濃縮し、得られたシロップ状物質にエタノール
を加えるとバリエナミンの結晶（１３，４ｇ）が得られ
た。

実施例２゜ ハリタマイシンＡ１％、硫酸アンモニウム１％。

りん酸−水素カリウム０．７％、りん酸二水素カリウム
０．３％、硫酸マグネシウム０．０１％の水溶液（２Ｌ
）を１）１１７．１に調整し、滅菌した培地に、アグロ
バクテリウム・ラジオバクター（Ｉ　Ｆ’　０　１２６
６４゜Ａ　Ｔ　ＣＣ４７１８）を接種し、２７℃で４日
間振盪培養した。培養液を遠心分離して菌体を除き、上
澄をアンバーライトＩ　ＲＣ−５０（Ｎｌｌ：型、ロー
ム・アンド・ハース社製）のカラム（５０ｈＬ）に吸着
させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出した。溶出
液を減圧濃縮し、濃縮液をダウエックス１　ｘ　２　（
Ｏｌｌ−型、ダウ・ケミカル社製０５００ｍＬ）のカラ
ムクロマトに付し、水で溶出した。各溶出画分は実施例
１−ｂ）と同様の方法で薄層クロマトで調べた。先に溶
出してくるバリダミンの溶出画分を集め、減圧濃縮後、
凍結乾燥するとバリダミンの白色粉末（０，９６ｇ）が
得られた。ついで溶出してくるバリエナミンの溶出画分
を集め、減圧濃縮乾固し、８０％エタノール水より結晶
化するとバリエナミンの結晶（２，２ｇ）が得られた。

実施例３゜ ２Ｌ坂ロフラスコ中、トリブチカーゼ１５ｇを水５００
ｍＬに溶解し、滅菌後、アグロバクテリウム・ツメファ
ンエンス（Ｉ　Ｆｏ　　３０５ｇ）を接種し、２７°Ｃ
で２４時間振盪培養した。培養液を遠心分離して菌体を
集め、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）で−回洗浄
して湿菌体的５．３ｇを得た。この菌体バリドキシルア
ミンΔ（３，０ｇ）の０，１Ｍりん酸緩衝液溶液（ｐＨ
７，０，２Ｌ）に加え、振盪下２７℃で７２時間反応を
行なった。反応液を遠心分離して菌体を除去し、上澄液
をアンバーライトｒ　ｎ　ｃ　−５０（Ｎｌｌ：型、　
１００ｍＬ）に吸着させ、以下実施例２と同様の方法で
処理して、バリダミン（１８０ｍｇ）およびバリエナミ
ン（２３０ｍｇ）を得た。

実施例４゜ 硫酸アンモニウム１％、りん酸−水素カリウム０．７％
、りん酸二水素カリウム０．３％、硫酸マグネシウムＱ
、Ｑ１％を含む水溶液（５０ｉＬ）にバリダマイシンＥ
およびＦの混合物（約３＝２の混合物）０．５０ｇを溶
解し、ｐＨ７に調整し、滅菌後、アグロバクテリウム・
ラジオバクター（ｌ　ＦＯ１２６６４，ＡＴｃｃ４７１
８）を接種し、２７℃で４日間振盪培養を行なった。培
養ろ液を実施例１と同様の方法で処理して、バリダミン
（３１ｍｇ）およびバリエナミン（３５ｍｇ）を得た。

実施例５゜ ２Ｌ坂ロフラスコ中、トリブチカーゼ５ｇを水１２５ｍ
Ｌと海水ａ７５ａ＋Ｌの混合液に溶解し、滅菌後、アエ
ロモナス・ハイドロフィラーサブスピーシス・プロテオ
リティカ（Ｉ　Ｆ　０　１３２８７）を接種し、２７℃
で４０時間振盪培養した。培養液を遠心分離して菌体を
集め、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄して
湿菌体的５．３ｇを得た。この菌体をバリダマイシンＡ
　（５，０ｇ）のＯ，１Ｍりん酸緩衝液（ｐｌｌ　７．
０．２　Ｌ、　”）に加え、振盪下に２７℃で７２時間
反応を行なった。

反応液を遠心分離して菌体を除去し、上０液をアンバー
ライトＩ　ＲＣ，−５０（ＮＨ，、１ｏｏｎＬ）に吸着
させ、以下実施例２と同様の方法で処理して、バリダミ
ン（１７ｔ）ｎｇ）およびバリエナミン（２２０ｏ＋ｇ
）を得た。

実施例６゜ 実施例５と同様の方法でアエロモナス・ハイドロフィラ
の代わりにアエロモナス・パンクタータ・サブスピーシ
ス・キャビエ（Ｉ　Ｆ　ＯＨ２８ｇ）およびアエロモナ
ス・ザルモニンダ・サブスピーシス・サルモニシダ（Ｅ
　Ｆ　０　１２６５９）を用いてバリダマイシンへの分
解反応を行いバリダミンおよびバリエナミンを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アグロバクテリウム属またはアエロモナス属に属し、バ
   リダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用してバリ
   エナミンおよび（または）バリダミンを生成しうる酵素
   を産生する微生物またはその処理物を、バリダマイシン
   またはバリドキシルアミンに作用させることを特徴とす
   るバリエナミンおよび（または）バリダミンの製造法。