JPH0339092A - 微生物が生産する物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物が生産する物質の製造法、更に詳しくは
２種以上の微生物の混合培養により培養物中の夾雑物含
量を低減せしめ、目的物質を収率よく製造する方法に関
する。

〔従来の技術〕

従来、微生物を培養することによって該微生物が生産す
る物質（以下、「培養生産物」という）を製造する方法
が数多く報告され、実用化されている。ところで、当該
培養物中には、目的とする物質以外にも多くの夾雑物が
含まれている。これらの夾雑物は通常使用菌体のほかに
、核酸、タンパク質などからなり、これらは使用菌体か
ら副産物として生産されたり、溶菌によって生じたりす
る。培養生産物を培養物から採取する場合、通常これら
の夾雑物を除去する必要があり、かかる夾雑物除去工程
は＝般に後処理工程と呼ばれている。

後処理工程は、通常予備分画（粗分画）と精密分画の２
つの単位操作よりなっている〔バイオ分離工学ハンドブ
ック、ｐ３０．サイエンスフォーラム、　１９８８年〕
。このうち予備分画は、後に行なわれる精密分画に大き
な影響を与えるため極めて重要である。すなわち、予備
分画による夾雑物の除去率が大きいほど、精密分画（膜
分離、クロマトグラフィーなど）の負担が軽減され、収
率が向上する。

この予備分画としては主に遠心分離や濾過が用いられて
いるが、特に製品の純度を低下させ、あるいは分離精製
効率を下げる核酸、タンパク質等については、次のよう
な方法の組み合わせにより除去率を高める試みがなされ
ている。例えば、ストレプトマイシン硫酸塩や塩化マン
ガンなどによる核酸沈澱法、ヌクレアーゼによる核酸分
解法、硫安やリン酸塩などの用いたタンパク質や菌体の
沈澱法などである〔生物化学工学第２版、　ｐ　３７６
゜学会出版センター、　　１９７３年〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらの予備分画に組み合わされる上記
の処理法は工業化の上で次のような問題点を含んでいる
。例えば、硫安などを用いた場合には排水処理の負荷が
増す、ストレプトマイシン硫酸塩などのｉ！Ｉ！集剤や
ヌクレアーゼの場合には、工業的生産におけるコストが
増加する等である。

一般に後処理工程にかけるコストは製品全体の中でおお
きな比重を占め、特に市場価格が低い製品の場合、コス
トの問題が重要である〔ノイイオ分離工学ハンドブック
、ｐ２８．　サイエンスフォーラム、　　１９８８年〕
。

従って、培養物の後処理工程で排水処理などの負荷を増
大させず、後処理を効率よく、低費用で行なうというこ
とが、当該技術分野において大きなりＡ題となっていた
。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情において本発明者らは上記課題を解決すべく
鋭意研究をしてきたところ、培養工程において夾雑物を
分解又は低減する酵素を生産する微生物を、目的物質を
生産する微生物と一緒に混合培養すれば、培養工程に続
く後処理工程で目的物質が高収率で取得できることを見
出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は微生物を培養することによって該微
生物が生産する物質を製造する方法において、目的物質
を生産する微生物（以下、「主微生物」という）と夾雑
物を分解又は低減する酵素を生産する微生物〈以下、「
冨す微生物」という）とを混合培養することを特徴とす
る微生物が生産する物質の製造法を提供するものである
。

本発明に用いる副機生物は、培養工程において核酸、タ
ンパク質等の夾雑物を分解又は低減させる酵素を生産す
る微生物であって、好ましくは主微生物の生育とその培
養生産物の生産を阻害せず、また主微生物によって生育
阻害をうけず、核酸分解酵素、タンパク分解酵素などの
夾雑物を分解する酵素を生産する微生物である。代表的
な例としては、核酸分解酵素、タンパク質分解酵素を生
産しているバチルス・セレウス（ＩＦＯ３００３）　、
バチルス・セレウス・サブスピーシズ・マイコイデス（
ＩＦＯ３０１５）　、バチルス・マイコイデス（八）１
１１３６０）、バチルス・ズブチルス（ＡｔｌＵ　１０
３３）などを示すことができる。

主微生物としては、各種有用物質、例えば酵素類、抗生
物質、生理活性物質などを生産する微生物が挙げられる
。代表的な例としてセルラーゼ生産菌のバチルス・エス
ピー・に５Ｍ６３５　（微工研菌寄第５３３号）、アミ
ラーゼ生産菌のバチルス・アルカロフィラス（＾ＴＣＣ
２１５９１）を示すことができる。

本発明を実施するには、上記主微生物と副機生物とを混
合培養し、該培養物より通常の手段により培養生産物を
採取することにより行なわれる。

混合培養は、主微生物と副機生物の両者が増殖し得る方
法であれば特に制限されないが、■適当な培地に主微生
物と副機生物の両者を添加して培養する方法、■主微生
物を培養している培地中に、副機生物又は予め培養した
副機生物培養液を添加して培養する方法、および■副機
生物を培養している培地中に、主微生物又は予め培養し
た主微生物培養液を添加して培養する方法が挙げられる
。

就中、■の混合培養方法が好ましい。主微生物と副機生
物との混合割合は、主微生物及び副機生物の組み合せに
よって異なるが、培養終了時において主微生物が充分に
増殖して培養生産物を生産し、かつ副機生物が夾雑物を
分解する酵素を充分に生産し得る量に調整することが望
ましく、一般には培養終了時において副機生物の菌数が
主微生物のそれより少なく、特に１／１００以下である
ことが好ましい。

主微生物又は副機生物を単独で培養する場合の培養条件
は、それぞれの微生物の増殖に合致した条件を選択すれ
ばよい。また両微生物混２合後の培養条件は、培養生産
物の生産性だけでなく、別命生物の増殖速度、分解酵素
の生産速度等を考慮して決定される。

培養終了後は、通常の方法により培養生産物を採取する
ことができる。本発明方法においては、主微生物単独で
培養したときに比べ、タンパク質核酸等の夾雑物の含量
が少ないため、特殊な夾雑物除去手段は必要ない。

〔発明の効果〕

本発明によれば、培養物中の夾雑物含量が少ないため、
後処理が容易であり、相対的に培養生産物の収率が向上
し、結果として培養生産物の製造コストの低減化が可能
となった。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが本発明は
これらにより何ら制限されるものではない。

（１３以下に実施例において、用いた副機生物から核酸
分解酵素、タンパク買分解酵素が生産されていることは
、それぞれの検出用プレートを用いて確認を行なった。

検出用プレートの組成を以下に示す。

■核酸分解酵Ｓ検出用プレート （重量％） ト　リ　ブ　ト　ン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１．５ンイペブトン　　　　　　　　　０．
５塩化ナトリウム　　　　　　　　０．５デオキシリボ
核酸　　　　　　　０．２トルイジンブルー　　　　　
　　０．０１寒　　　　天　　　　　　　　　　　　　
　　１．５■タンパク質分解酵素検出用プレート （重量％） ニコートリエントブロス スキムミルク　　　　　　　　　２．０（２）以下の実
施例において、主微生物、副機生物を保存しているスラ
ントは、それぞれ以下に示す培地Ａ〜Ｃに寒天を添加し
て作ったものである。

（３）以下の実施例において、％は重量％を示す。

実施例１ （１）主微生物としてセルラーゼ生産菌バチルス・エス
ピーＫＳＭ６３５　Ｃ＠工研菌寄第５３３号〉を用いた
。スラントから１白金耳を下記（培地式）に示すシード
培地５０ｍ１（坂ロフラスコ〉に植菌し、３４℃で２４
時時間上ぅ培養を行なった。得られた培養液５−をメイ
ン培地５ｏｒｎ！、（坂ロフラスコンに植菌し、３４℃
で振とぅ培養を行なった。

培地式 ポリペプトン　　　　　　　　　　　２．０％イースト
エキストラクト　　　　　　０，１％リン酸酸水素ナナ
トリウム　　　　　０．１％ＣＭＣ１，０％ 炭酸ナトリウム−＋　　　　　　　　　　０．７５％０
）炭酸ナトリウムは別滅菌 （２）副機生物として核酸分解酵素とタンパク質分解酵
素を生産するバチルス・ズブチルス（ＡＩＩＵ１０３３
）を用いた。スラントより次に示す培地８゜３０−（坂
ロフラスコ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。

培地口 ニュートリエントブロス グルコース　　　　　　　　　　　　１．０％イースト
エキストラクト　　　　　　１．０％（３）得られた副
機生物の培養液を前記で得たセルラーゼ生産菌の培養液
（培養開始後ＩＯ時間目）に、０．００５　ｍｌ（０，
０１％）と０．５ｍｆ（１％）を各々植菌し、３４℃で
さらに３８時間振とう培養を行なった。

培養終了後、培養液のセルラーゼ活性、夾雑物含量およ
び分画難易の判定のためメンブランフィルタ−を用い該
透過流束を測定した。

（ａ）セルラーゼ活性 セルラーゼ生産菌から生産されたアルカリセルラーゼに
のＣＭＣアーゼ活性は以下のように測定した。ＣＭＣ（
２，５％）０．２ｍｉ！、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）　０．１　ｍＡ’、及び脱イオン水０．１−
からなる基質溶液に酵素液０．１ｍｌ！を加え、４０℃
、２０分間反応した。反応後、３．５−ジニトロサリチ
ル酸（３、５−ｄｉｎｉｔｒａ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　
Ａｃ１ｄ　（ＤＮＳ））法にて還元糖の定量を行なった
。すなわち、反応液０．５−にＤＮＳ試薬１−を加え、
５分間１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．５−の脱
イオン水を加えて希釈した。

これを波長５３５ｎｍで比色定量し、相対活性として示
した。

（ｂ）夾雑物含量 夾雑物は培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０ｍ１
ｎ、）に付し、得られた上清画分を高速液体クロマトグ
ラフィーにて調べた。高分子！（Ｍ、Ｗ。

１００万以上）の画分を夾雑物画分とした。その際、使
用したカラムはＴＳＫｇｅｌ　ＧＷ４０００ＳＷＸＬ　
。

溶出緩衝液は０．２Ｍ！Ｉン酸緩衝波緩衝液７．２を用
い、検出はＵＶ（２６０ｎｍ）で行なった。夾雑物はＯ
Ｎ八を標準物質として用い、相対量によって表した。

（ｃ）透過流束 夾雑物が後処理工程に負荷をかける事例として０．２μ
ｍの精密濾過膜（オレフィン系ポリマー、ＩＪ３ｃｍ”
）を用いて透過流束を調べ（２，０ｋｇ　／　ｃｍ″　
１０ｒｎ！、）、相対値によって表した。

得られた結果を表１に示す。

実施例２ 実施例１において副機生物として核酸分解酵素、タンパ
ク質分解酵素を生産するバチルス・セレウス（ＩＦＯ３
００３）を用い、他は全て実施例１と同じ条件で培養を
行なった。得られた結果を表２に示す。

以下余白 実施例３ 実施例１において副機生物として核酸分解酵素、タンパ
ク質分解酵素を生産するバチルス・セレウス・サブスピ
ーシズ・マイコイデス（ＩＦＯ３０１５）を用い、他は
全の実施例１と同じ条件で培養を行なった。得られた結
果を表３に示す。

以下余白 実施例４ 実施例１において副機生物として核酸分解酵素、タンパ
ク質分解酵素を生産するバチルス・マイコイデス（ＡＨ
［Ｉ　１３６０）を用い、他は全の実施例１と同じ条件
で培養を行なった。得られた結果を表４に示す。。

以下余白 実施例５ （１）主微生物としてアミラーゼ生＆菌として、バチル
ス・アルカロフィラス（＾ＴＣＣ２１５９１）を用いた
。

スラントから１白金耳を下記に示す培地（Ｃ）、３０ｒ
ｎｆ！（坂ロフラスコ）に植菌し、３０℃で２４時間培
養を行なった。得られた培養液ｌ−をさらに同培地３０
ｍ！（坂ロフラスコ）に植菌し、３４℃で振とう培養を
行なった。

培地Ｃ ペプトン　　　　　　　　　　　　　１．０％イースト
エキストラクト　　　　　　１，０％リン酸水素二カリ
ウム　　　　　　　０．１％硫酸マグネシウム　　　　
　　　　　０．０２％可溶性デンプン　　　　　　　　
　　１．０％炭酸ナトリウムＩ］　（無水）１．０％グ
ルコース”　　　　　　　　　　　　１．０％フラクト
ース”　　　　　　　　　　　１．５％＄１グルコース
、フラクトースと炭酸ナトリウムは別滅菌 （２）副機生物として核酸分解酵素とタンパク質分解酵
素を生産するバチルス・マイコイデス（ＡＨＩ１１０３
４）を用いた。スラントから培地Ｂ、３０−（坂ロフラ
スコ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた
異種微生物の培養液を前記で得たアミラーゼ生産菌の培
養液（培養開始後、１０時間目）に０．３ｍＮ（１％）
植菌し、３４℃で３８時間培養した。

培養終了後、培養液のアミラーゼ活性、夾雑物含量およ
びメンブランフィルタ−透過流束を測定した。

（ａ）アミラーゼ活性 アミラーゼ生産菌から生産されたアミラーゼの活性は以
下のように測定した。可溶性デンプン（２，５％）０．
２ｒｄ！、０．５Ｍグリシン緩衝液（Ｊ）Ｈ９，０）　
０．１　ｍｊ！、及び脱イオン水０．１−からなる基質
溶液に酵素液０．１ｍｉ’を加え、４０℃、２０分間反
応した。反応後、３，５−ジニ）ロサリチル酸（３，５
−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　Ａｃ１ｄ（ＤＮ
Ｓ）　）法にて還元糖の定量を行なった。すなわち、反
応液０．５−にＯＮＳ試薬１−を加え、５分間１００℃
で加熱発色させ、冷却後、４．５ｍｌ！の脱イオン水を
加えて希釈した。これを波長５３５　ｎｍで比色定置し
、相対活性によって表した。

夾雑物含量及び透過流束は実施例１と同様にして測定し
た。得られた結果を表５に示す。

以下余白

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　微生物を培養することによって該微生物が生産する
   物質を製造する方法において、目的物質を生産する微生
   物と夾雑物を分解又は低減する酵素を生産する微生物と
   を混合培養することを特徴とする微生物が生産する物質
   の製造法。