JPH04304893A

JPH04304893A - 微生物による含窒素複素環化合物の水酸化物の製造方法

Info

Publication number: JPH04304893A
Application number: JP6735091A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; 秀明山田; Toru Nagasawa; 長沢　透; Keigo Komura; 啓悟小村
Original assignee: IKEDA SHIYOKUKEN KK
Current assignee: IKEDA SHIYOKUKEN KK
Priority date: 1991-03-30
Filing date: 1991-03-30
Publication date: 1992-10-28
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPH0740951B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物を利用してニコ
チン酸、ピラジン酸およびピリジンカルボン酸から選ば
れる含窒素複素環化合物の水酸化物を製造する方法に関
する。

【０００２】

【従来技術および発明が解決しようとする課題】５−ヒ
ドロキシニコチン酸、５−ヒドロキシピラジン−２−カ
ルボン酸、６−ヒドロキシピリジン−３−スルホン酸な
どの含窒素複素環化合物の水酸化物は、各種医薬品の合
成原料または中間体として有用なことが知られているが
、これら含窒素複素環化合物の水酸化物の製法としては
もっぱら有機合成法によって行われており、微生物を利
用した方法は余り知られていない。わずかに知られてい
る例としては、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａ
ｃｔｅｒ）属の微生物を利用してニコチン酸から６−ヒ
ドロキシニコチン酸を製造する方法が報告されている（
特公昭６０−１９６１９３、特公昭６０−１９６１９４
）。一般に有機合成法では、置換反応が定量的でないと
か、反応に伴って好ましくない副生成物が生成するとい
った問題がある。これに対して、微生物を利用した方法
はこれら有機合成法の欠点を克服するものであり、比較
的安価に高純度かつ高収率で製造が可能である。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物に
よる含窒素複素環化合物の水酸化物についてさらに改良
された方法を見いだすべく鋭意研究を重ねた結果、上記
アクロモバクター属の微生物以外にもコマモナス（Ｃｏ
ｍａｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属または
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する
微生物もニコチン酸から６−ヒドロキシニコチン酸を生
成する能力を有することを発見し、さらに、これら微生
物がニコチン酸のみならずピラジン酸やピリジン−３−
スルホン酸などの他の含窒素複素環化合物を水酸化し得
る能力を有することを見いだし本発明を完成するに至っ
た。

【０００４】すなわち、本発明は、コマモナス属、セラ
チア属、アルカリゲネス属またはシュードモナス属に属
し、ニコチン酸、ピラジン酸またはピリジンスルホン酸
などの含窒素複素環化合物を水酸化し得る微生物、こと
にその菌体または該菌体の処理物もしくはその培養液を
用いて、ニコチン酸、ピラジン酸またはピリジン−３−
スルホン酸を処理して対応する水酸化物に導くことを特
徴とする含窒素複素環化合物の水酸化物の製造方法を提
供する。

【０００５】本発明の方法に使用する微生物としては、
コマモナス属、セラチア属、アルカリゲネス属またはシ
ュードモナス属に属する微生物であって、ニコチン酸、
ピラジン酸またはピリジン−３−スルホン酸をそれぞれ
６−ヒドロキシニコチン酸、５−ヒドロキシピラジン−
２−カルボン酸または６−ヒドロキシピリジン−３−ス
ルホン酸に変換する能力を有するものはすべて含まれ、
具体例としては、コマモナス・アシドボランス（Ｃｏｍ
ａｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）ＮＡ２、セラ
チア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅ
ｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１２６４８、アルカリゲネス・ファ
エカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ
）ＩＦＯ１３１１１およびシュードモナス・アエルギノ
ーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）ＩＦＯ１２５８９などが挙げられる。コマモナス・ア
シドボランスＮＡ２は、本発明者が天然から単離、同定
したものであって、平成３年２月２５日に工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２０３８号（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１２０３８）として寄託されている。他の
微生物は発酵研究所（ＩＦＯ）より入手可能である。上
記コマモナス・アシドボランスＮＡ２の菌学的性質は以
下の通りである。

【０００６】（ａ）形態（肉汁寒天培地で、３０°Ｃ、２４時間培養）■細胞の
形および大きさ：桿菌、０．８〜１．１μｍ×２．５〜
４．１μｍ ■細胞の多形性：無 ■運動性：有（極性鞭毛を有する） ■胞子：無 ■グラム染色性：不定 ■抗酸性：陰性

【０００７】（ｂ）各培地における生育状態（３０°Ｃ
、２４時間培養） ■肉汁寒天平板培養：コロニーは直径１ｍｍ以下の円形
、規則的、色は淡黄色、表面は平滑で光沢がある。 ■肉汁寒天斜面培養：中程度の生育で色は淡黄色、表面
は平滑で光沢がある。 ■肉汁液体培養：培養液は均一に濁り、底部に菌の沈澱
が生じる。

【０００８】（ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陽性 ■脱窒反応：陰性 ■インドールの生成：陰性 ■デンプンの加水分解：陰性 ■色素の生成：陰性 ■ウレアーゼ：陰性 ■オキシダーゼ：陽性 ■カタラーゼ：陽性 ■生育の範囲：ｐＨ６〜８、温度２０〜４１°Ｃ１０酸
素に対する態度：好気性

【０００９】１１Ｏ−Ｆテスト：Ｏ１２ウレアの加水分解：陰性１３テストステロンの分解：陰性１４テストステロンの利用：陰性１５ＮＯ３→ＮＯ２：陽性１６ＮＯ３→Ｎ２：陰性１７アセトアミドのアルカリ化：陽性１８アラントインのアルカリ化：陰性１９酒石酸のアルカリ化：陽性

【００１０】２０糖からの酸およびガスの発生：

【００
１１】以上の菌学的性質に基づいてバージーの細菌分類
書（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）によって分類
すると、この微生物は好気性のグラム陰性桿菌であり、
極性鞭毛を有して運動性があること、さらにその他の生
理学的性質からみてコマモナス・アシドボランス（Ｃｏ
ｍａｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）であると同
定した。

【００１２】本発明に使用するコマモナス属、セラチア
属、アルカリゲネス属およびシュードモナス属の菌の培
養は、一般に微生物の培養に際して用いられる培地およ
び培養条件で行うことができる。すなわち、培地として
は炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の栄養培地
を使用できる。炭素源として糖類、有機酸、またはグル
タミン酸などのアミノ酸類、窒素源としてポリペプトン
、酵母エキス、大豆粉加水分解物、硫酸アンモニウムな
ど、微量金属成分として鉄、マグネシウム、カリウム、
マンガンなどを適宜含有する培地を用いることができる
。培養は、ｐＨ６〜８、２０〜４１°Ｃ、好ましくは２
５〜３２°Ｃの温度にて１〜３日間、好気的条件下で行
う。

【００１３】本発明の方法を行うには、まず、ニコチン
酸、ピラジン酸またはピリジン−３−スルホン酸を、反
応を阻害しない無機または有機の溶媒中、好ましくは水
性溶媒中、上記で得た培養液、該培養液から採取した菌
体または該菌体の処理物（たとえば、洗浄菌体、乾燥菌
体、凍結菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の
超音波処理物、菌体抽出物など）で処理することによっ
て、それぞれ６−ヒドロキシニコチン酸、５−ヒドロキ
シピラジン−２−カルボン酸または６−ヒドロキシピリ
ジン−３−スルホン酸を生成させる。

【００１４】出発物質のニコチン酸、ピラジン酸または
ピリジン−３−スルホン酸の添加濃度は、０．１％（ｗ
／ｖ）以上で反応を阻害しない程度のものであればよい
。培養液、該培養液から採取した菌体または該菌体の処理
物で処理する際の条件としては、温度は酵素が変性しな
い温度であればよく、通常、５〜５０°Ｃ、好ましくは
３０〜３７°Ｃであり、ｐＨは４〜１０、好ましくは５
〜８である。

【００１５】培養液にニコチン酸、ピラジン酸またはピ
リジン−３−スルホン酸を添加する場合には、菌の対数
増殖期に添加するのが望ましい。菌体を用いる場合は、
上記方法で培養した対数増殖期または静止期の菌体を遠
心分離にかけ、生理食塩水などで洗浄後、適当な緩衝液
に菌体を懸濁し、ニコチン酸、ピラジン酸またはピリジ
ン−３−スルホン酸を添加すればよい。

【００１６】ついで、上記処理培養液または反応液から
生成物である６−ヒドロキシニコチン酸、５−ヒドロキ
シピラジン−２−カルボン酸または６−ヒドロキシピリ
ジン−３−スルホン酸を回収する。回収法としては、当
業者に知られた通常の方法を用いることができる。すな
わち、たとえば、反応液から菌体などを遠心分離や膜分
離などによって除いた後、カラムクロマトグラフィーや
結晶化などの精製手段によって目的化合物である６−ヒ
ドロキシニコチン酸、５−ヒドロキシピラジン−２−カ
ルボン酸または６−ヒドロキシピリジン−３−スルホン
酸を回収することができる。

【００１７】つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１コマモナス・アシドボランスＮＡ２による６−ヒドロキ
シニコチン酸の製造：（１）微生物の培養下記培地Ａを用い、コマモナス・アシドボランスＮＡ２
を２８°Ｃで３６時間振とう培養した。

【００１８】

【００１９】（注）＊：組成（溶液１Ｌ中）は以下の通
りである。ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　４００ｍｇＨ３
ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍ
ｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　４０ｍｇ
ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
００ｍｇＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　２００
ｍｇＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　４００ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　４００ｍｇＨ２
ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　２００ｍｇ

【００２
０】（２）６−ヒドロキシニコチン酸の製造：上記培養
液を遠心分離にかけて集菌し、生理食塩水で洗浄したも
のを反応に供した。すなわち、培養液１Ｌより得られる
菌体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に
懸濁して５０ｍｌとし、これにニコチン酸（９００ｍＭ
）を９回に分けて添加し、３５°Ｃで振とうしながら反
応を行った。反応開始から６４時間後にニコチン酸は完
全に消費され、生成した６−ヒドロキシニコチン酸の量
は８６５．２ｍＭに達した（転換率：９６．１％、反応
液１Ｌ当たり１２０．４ｇの６−ヒドロキシニコチン酸
が蓄積）。

【００２１】生成した６−ヒドロキシニコチン酸の同定
は、これを結晶として分離した後、元素分析、ＩＲ、Ｎ
ＭＲおよび質量分析により行った。

【００２２】実施例２コマモナス・アシドボランスＮＡ２による５−ヒドロキ
シピラジン−２−カルボン酸の製造：（１）微生物の培養コマモナス・アシドボランスＮＡ２を実施例１（１）と
同様の方法により培養し、下記工程に用いた。

【００２３】（２）５−ヒドロキシピラジン−２−カルボン酸の製造
上記培養液を遠心分離にかけて集菌し、生理食塩水で洗
浄したものを反応に供した。すなわち、培養液１Ｌより
得られる菌体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
．０）に懸濁して５０ｍｌとし、これにピラジン酸（９
００ｍＭ）を９回に分けて添加し、３５°Ｃで振とうし
ながら反応を行った。反応開始から５０．５時間後にピ
ラジン酸は完全に消費され、生成した５−ヒドロキシピ
ラジン−２−カルボン酸の量は７８２ｍＭに達した（転
換率：８６．９％、反応液１Ｌ当たり１０９．６ｇの５
−ヒドロキシピラジン−２−カルボン酸が蓄積）。

【００２４】生成した５−ヒドロキシピラジン−２−カ
ルボン酸の同定は、これを結晶として分離した後、元素
分析、ＩＲ、ＮＭＲおよび質量分析により行った。

【００２５】実施例３コマモナス・アシドボランスＮＡ２による６−ヒドロキ
シピリジン−３−スルホン酸の製造：（１）微生物の培養コマモナス・アシドボランスＮＡ２を実施例１（１）と
同様の方法により培養し、下記工程に用いた。

【００２６】（２）６−ヒドロキシピリジン−３−スルホン酸の製造
上記培養液を遠心分離にかけて集菌し、生理食塩水で洗
浄したものを反応に供した。すなわち、培養液１Ｌより
得られる菌体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
．０）に懸濁して５０ｍｌとし、これにピリジン−３−
スルホン酸（７００ｍＭ）を７回に分けて添加し、３５
°Ｃで振とうしながら反応を行った。反応開始から４８
時間後にピリジン−３−スルホン酸は完全に消費され、
生成した６−ヒドロキシピリジン−３−スルホン酸の量
は６６０．７ｍＭに達した（転換率：９４．４％、反応
液１Ｌ当たり１１５．７ｇの６−ヒドロキシピリジン−
３−スルホン酸が蓄積）。

【００２７】生成した６−ヒドロキシピリジン−３−ス
ルホン酸の同定は、これを結晶として分離した後、元素
分析、ＩＲ、ＮＭＲおよび質量分析により行った。

【００２８】実施例４セラチア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８による６−
ヒドロキシニコチン酸の製造方法：（１）微生物の培養セラチア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８を実施例１
（１）と同様の方法により培養し、下記工程に用いた。

【００２９】（２）６−ヒドロキシニコチン酸の製造方
法上記培養液を遠心分離にかけて集菌し、生理食塩水で
洗浄したものを反応に供した。すなわち、培養液１Ｌよ
り得られる菌体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）に懸濁して５０ｍｌとし、これにニコチン酸（
９００ｍＭ）を９回に分けて添加し、３５°Ｃで振とう
しながら反応を行った。反応開始から６６時間後にニコ
チン酸は完全に消費され、生成した６−ヒドロキシニコ
チン酸の量は８７４．８ｍＭに達した（転換率：９７．
２％、反応液１Ｌ当たり１２１．７ｇの６−ヒドロキシ
ニコチン酸が蓄積）。

【００３０】生成した６−ヒドロキシニコチン酸の同定
は、これを結晶として分離した後、元素分析、ＩＲ、Ｎ
ＭＲおよび質量分析により行った。

【００３１】実施例５アルカリゲネス・ファエカリスＩＦＯ１３１１１による
６−ヒドロキシニコチン酸の製造方法：（１）微生物の
培養アルカリゲネス・ファエカリスＩＦＯ１３１１１を実施
例１（１）と同様の方法により培養し、下記工程に用い
た。

【００３２】（２）６−ヒドロキシニコチン酸の製造方
法上記培養液を遠心分離にかけて集菌し、生理食塩水で
洗浄したものを反応に供した。すなわち、培養液１Ｌよ
り得られる菌体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）に懸濁して５０ｍｌとし、これにニコチン酸（
７００ｍＭ）を７回に分けて添加し、３５°Ｃで振とう
しながら反応を行った。反応開始から６４時間後にニコ
チン酸は完全に消費され、生成した６−ヒドロキシニコ
チン酸の量は６７５．５ｍＭに達した（転換率：９６．
５％、反応液１Ｌ当たり９４．０ｇの６−ヒドロキシニ
コチン酸が蓄積）。

【００３３】生成した６−ヒドロキシニコチン酸の同定
は、これを結晶として分離した後、元素分析、ＩＲ、Ｎ
ＭＲおよび質量分析により行った。

【００３４】実施例６シュードモナス・アエルギノーサＩＦＯ１２５８９によ
る６−ヒドロキシニコチン酸の製造方法：（１）微生物
の培養シュードモナス・アエルギノーサＩＦＯ１２５８９を実
施例１（１）と同様の方法により培養し、下記工程に用
いた。

【００３５】（２）６−ヒドロキシニコチン酸の製造方
法上記培養液を遠心分離にかけて集菌し、生理食塩水で
洗浄したものを反応に供した。すなわち、培養液１Ｌよ
り得られる菌体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）に懸濁して５０ｍｌとし、これにニコチン酸（
６００ｍＭ）を６回に分けて添加し、３５°Ｃで振とう
しながら反応を行った。反応開始から６０時間後にニコ
チン酸は完全に消費され、生成した６−ヒドロキシニコ
チン酸の量は５８９．８ｍＭに達した（転換率：９８．
３％、反応液１Ｌ当たり８２．０ｇの６−ヒドロキシニ
コチン酸が蓄積）。

【００３６】生成した６−ヒドロキシニコチン酸の同定
は、これを結晶として分離した後、元素分析、ＩＲ、Ｎ
ＭＲおよび質量分析により行った。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　コマモナス属、セラチア属、アルカリ
ゲネス属またはシュードモナス属に属し、ニコチン酸、
ピラジン酸またはピリジンスルホン酸を水酸化し得る微
生物を用いて、ニコチン酸、ピラジン酸またはピリジン
スルホン酸を処理することを特徴とする、含窒素複素環
化合物の水酸化物の製造方法。
【請求項２】　　微生物が、菌体、菌体処理物または培
養液の形態で用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】　　微生物が、コマモナス・アシドボラン
スＮＡ２、セラチア・マルセッセンスＩＦＯ１２６４８
、アルカリゲネス・ファエカリスＩＦＯ１３１１１およ
びシュードモナス・アエルギノーサＩＦＯ１２５８９よ
りなる群から選ばれたものである、請求項１または２に
記載の方法。
【請求項４】　　ニコチン酸から６−ヒドロキシニコチ
ン酸を製造する請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】　　ピラジン酸から５−ヒドロキシピラジ
ン−２−カルボン酸を製造する請求項１、２または３に
記載の方法。
【請求項６】　　ピリジン−３−スルホン酸から６−ヒ
ドロキシピリジン−３−スルホン酸を製造する請求項１
、２または３に記載の方法。