JPH04365494A - ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を製造するための微生物学的方法 - Google Patents

ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を製造するための微生物学的方法

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JPH04365494A
JPH04365494A JP3289586A JP28958691A JPH04365494A JP H04365494 A JPH04365494 A JP H04365494A JP 3289586 A JP3289586 A JP 3289586A JP 28958691 A JP28958691 A JP 28958691A JP H04365494 A JPH04365494 A JP H04365494A
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pyrazine derivative
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Andreas Kiener
アンドレアス　キーナー
Klaus Heinzmann
クラウス　ハインツマン
Michael Bokel
ミヒヤエル　ボーケル
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Lonza AG
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ピラジンで成長し、一般式
【０
００２】
【化５】
【０００３】〔式中、Ｒ１は水素原子またはハロゲン原
子をあらわし、Ｒ２およびＲ３は同一または異なるもの
であって水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基をあらわ
すが、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３が同時に水素をあらわすこ
とはない。〕のピラジン誘導体をヒドロキシル化する新
規な微生物、ならびにヒドロキシル化されたピラジン誘
導体の製造方法に関する。
【０００４】ヒドロキシル化されたピラジン誘導体は、
たとえばメトキシアルキルピラジンを製造するための、
重要な中間体である。　　メトキシアルキルピラジンは
、香料の必須成分である（マガおよびサイザー、Ｊ．Ａ
ｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．，２１，１９７３，
２２−３０頁）。　　これまで、たとえばカルマスおよ
びスポエリにより、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
，７４，１９５２，１５８０−１５８４頁に記載されて
いるような、ヒドロキシル化されたピラジンの化学的製
法だけが知られていて、そこでは、たとえば２−ヒドロ
キシ−５−メチルピラジンを、メチルグリオキサールお
よびグリシンアミド塩酸塩を原料として合成する。　　
しかし、この方法には、生成物の純度が非常に低いとい
う欠点がある。
【０００５】さらに、２−ヒドロキシピラジンの生物学
的分解に関する研究が、マトレーおよびハルレ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，４，１９７６，４９
２−４９３頁に発表されている。　　ピラジンで成長す
る微生物を使用し、置換したピラジン誘導体から出発し
て局所特異的にヒドロキシル化されたピラジン誘導体を
製造するための方法は、知られていない。
【０００６】本発明の目的は、生物工学的方法で、経済
的に、かつ簡単に一般式Ｉのピラジン誘導体を局所特異
的にヒドロキシル化する新規な微生物を発見すること、
ならびにヒドロキシル化されたピラジン誘導体の生物工
学的な製造方法を開発することである。
【０００７】この目的は、請求項１の微生物および請求
項３のヒドロキシル化されたピラジン誘導体の製造方法
により達成される。　　これらの微生物は、ピラジンを
唯一の炭素、窒素およびエネルギーの供給源として成長
することができ、基質として、一般式
【０００８】
【化６】
【０００９】〔式中、Ｒ１は水素原子またはハロゲン原
子をあらわし、Ｒ２およびＲ３は同一または異なるもの
であって水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基をあらわ
すが、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３が同時に水素をあらわすこ
とはない。〕のピラジン誘導体を、一般式
【００１０】
【化７】
【００１１】〔式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は上記の意
味を有する。〕のヒドロキシル化されたピラジン誘導体
に変換し、その際、そのヒドロキシル化されたピラジン
誘導体が成長媒体中に蓄積される。
【００１２】本発明では、ピラジンを唯一の炭素、窒素
およびエネルギーの供給源として利用し、通常の微生物
学的技術により、たとえば土壌試料、浄化施設、大地、
蟻塚および堆肥の山から選択される、すべての微生物を
使用できる。
【００１３】有利なことに、ピラジンを分解し、一般式
Ｉのピラジン誘導体を基質としてヒドロキシル化し、一
般式ＩＩのヒドロキシル化されたピラジン誘導体に変換
してこれを成長媒体中に蓄積する、すべてのグラム陽性
菌およびグラム陰性菌を使用することができる。
【００１４】好ましい微生物は、ＤＳＭ−Ｎｏ．　６１
３６のアグロバクテリウム　ラジオバクターＤＲＳ　３
であるが、この微生物は、以下、詳細な識別データに基
づき、微生物アグロバクテリウムｓｐ．（ＤＳＭ−Ｎｏ
．　６１３６）と呼ぶ。　　この菌種は１９９０年９月
７日に、ドイチェン・ザムルング・フォン・ミクロオル
ガニズメン（ＤＳＭ）・ウント・ツェルクルトゥーレン
ＧｍｂＨ，マシェローデヴェーク１ｂ、３３００ブラウ
ンシュヴァイク／ＢＲＤに供託してある。
【００１５】 アグロバクテリウムｓｐ．（ＤＳＭ−Ｎｏ．　６１３６
）の科学的データ細胞形状　　　　　　　　　　　　　
　桿状　　　　　　　　ＡＤＨ　　　　　　　　　　　
　−　　幅　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
６−０．８　　長さ　　　　　　　　　　　　　　　　
１．５−３．０　　　　　ＬＤＣ　　　　　　　　　　
　　−移動性　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　ＯＤＣ　　　　　　　　　　　　−グ
ラム−反応　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　
　ＯＮＰＧ　　　　　　　　　　＋３％　ＫＯＨによる
溶解 アミノペプチダーゼ　　　　＋　　　　　　　　　　Ｖ
Ｐ　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　（
Ｃｅｒｎｙ） 胞子　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　インドール　　　　　　　　−オキシダー
ゼ　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　ＮＯ３
からＮＯ２　　　　　　　　＋カタラーゼ　　　　　　
　　　　　　Ｗ　　　　　　　　　　Ｄｅｎｔｉｆｒｉ
ｋａｔｉｏｎ　　　　＋成長　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　フェニルアラニ
ン　　嫌気性　　　　　　　　　　　　　　−　　　　
　　　　　　　　デスアミナーゼ　　＋　　３７／４１
　℃　　　　　　　　　　　　−／−　　　　　　　　
　レシチナーゼ　　　　　　−　　ｐＨ　５．６　　　
　　　　　　　　　　　−　　マッコンキー寒天　　　
　＋　　　　　　　　　　ウレアーゼ　　　　　　　　
＋　　ｓｓ−寒天　　　　　　　　　　　　　−　　セ
トリミド寒天　　　　　　−　　　　　　　　　　シモ
ンズクエン酸塩　　＋　　２％　ＮａＣｌ　　　　　　
　　　　　　　−　　　　　　　　　　マロン酸塩　　
　　　　　　−顔料　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−　　非分散　　　　　　　　　　　　　　−　　
　　　　　　　　ケトラクトース　　　　−　　分散　
　　　　　　　　　　　　　　　−　　蛍光発生　　　
　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　加水分解　
　ピオシアニン　　　　　　　　−　　　　　　　　　
　　　でん粉　　　　　　　　　　−　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ゼラチン　　　　　　　　−酸発生（ＯＦ−テス
ト）　　　　　　　　　　　　　　　　　　カゼイン　
　　　　　　　−　　グルコース好気　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　ＤＮＡ　　　　　　　　　　−
　　グルコース嫌気　　　　　　−　　　　　　　　　
　　　トゥイーン８０　　　　−　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　エスクリン　　　　　　＋グルコースからのガス　　
−　　　　　　　　　　チロシン分解　　　　　　−酸
発生（ＡＳＳ） 　　グルコース　　　　　　　　　　＋　　　　　　　
　　　Ｎ−アセチルグルコサミン　　＋　　フルクトー
ス　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　Ｌ−アスパ
ラギン酸塩　　＋　　キシロース　　　　　　　　　　
＋　　　　　　　　　　Ｌ−セリン　　　　　　　　　
　　　＋　　エタノール　　　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　Ｌ−グルタミン酸塩　　　　＋　　ｍ−
エリトリトール　　　　＋　　　　　　　　　　Ｌ−ヒ
スチジン　　　　　　　　−　　メレチトース　　　　
　　　　−　　　　　　　　　　ヒドロキシ酪酸　　　
　　　−　　アラビノース　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　ベタイン　　　　　　　　　　　　＋　　
サッカロース　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　
メチルアミン　　　　　　　　−　　セロビオース　　
　　　　　　＋　　　　　　　　　　メタノール　　　
　　　　　　　−　　トレハロース　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　エタノール　　　　　　　　　　
−　　ラムノース　　　　　　　　　　＋　　　　　　
　　　　主キノン成分：　　ユビキノン１０　　ズルシ
ット　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　リト
マス牛乳の　　ソルビトール　　　　　　　　＋　　　
　　　　　　　　　　　アルカリ化　　　　＋　　グリ
セロール　　　　　　　　＋ 　　マロン酸塩　　　　　　　　　　−　　　　　　　
　　　成長ホルモン要求　　−　　酢酸フェニル　　　
　　　　　− 　　スベリン酸塩　　　　　　　　−　　　　　　　　
　　基質利用　　セバシン酸塩　　　　　　　　−　　
　　　　　　　　　　酢酸塩　　　　　　　　　　＋　
　ｍ−酒石酸塩　　　　　　　　　　−　　　　　　　
　　　　　アジピン酸　　　　　　−　　Ｌ−アラビノ
ース　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　カプリン
酸塩　　　　−　　フルクトース　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　　　クエン酸塩　　　　　　−　　
グルコース　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　グリコール酸塩　　＋　　マンノース　　　　　
　　　　　＋　　　　　　　　　　　　乳酸塩　　　　
　　　　　　＋　　マルトース　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　　　レブリン酸塩　　　　−　　
キシロース　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　リンゴ酸塩　　　　　　＋　　フコース　　　　
　　　　　　　　−　　マンニット　　　　　　　　　
　＋　　２−ケトグルコン酸塩　　− ヒドロキシル化されたピラジン誘導体の製造には、微生
物に、一般式
【００１６】
【化８】
【００１７】〔式中、Ｒ１は水素原子またはハロゲン原
子をあらわし、Ｒ２およびＲ３は同一または異なるもの
であって水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基をあらわ
すが、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３が同時に水素をあらわすこ
とはない。〕のピラジン誘導体を過剰に供給し、一般式
【００１８】
【化９】
【００１９】〔式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は上記の意
味を有する。〕のヒドロキシル化されたピラジン誘導体
に変換し、濃縮された生成物を分離する。
【００２０】好ましくは、これらの微生物により、Ｒ１
が水素原子または塩素原子であり、Ｒ２およびＲ３が同
一または異なるものであって水素原子、メチル基または
エチル基であるが、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３が同時に水素
をあらわすことはない、ヒドロキシル化されたピラジン
誘導体を製造する。
【００２１】これらの微生物は、本来の工程（基質変換
）の前に、成長基質を含む媒体中で培養する。
【００２２】成長基質であるピラジンは、培養基に対し
て０．００１〜１０重量％の量で、好ましくは培養基に
対して０．００１〜５重量％の量で使用する。
【００２３】微生物のヒドロキシル化を行なう酵素は、
ピラジンにより誘発するのが有利である。
【００２４】誘発に使用する化合物は、ピラジン誘導体
（基質）の変換中に存在していてもよいし、変換の際に
この化合物の供給を停止してもよい。　　好ましくは、
誘発に使用する化合物の供給は、ピラジン誘導体の変換
の際は、供給中断、または遠心分離により停止する。
【００２５】基質を加える前に、細胞を６５０　ｎｍで
１００の光学密度まで、好ましくは６５０　ｎｍで１０
〜６０の光学密度まで高める（培養する）。
【００２６】微生物のための栄養媒体としては、培養に
も本来の工程にも、この専門分野で一般的な媒体を使用
することができる。　　好ましくは、表１に構成成分を
示す媒体を使用する。　　次いで、本来の工程を静止細
胞で実行するのが一般的である。
【００２７】一般式Ｉのピラジン誘導体は、基質として
、細胞分散物に１回で、または連続的に供給することが
できるが、培養基中の基質濃度が２０％（ｗ／ｖ）を超
えないようにするのが好ましい。　　とくに、基質の濃
度は培養基中で５％（ｗ／ｖ）を超えないようにする。
【００２８】変換は、ｐＨ４〜１０、好ましくは２０〜
４０℃の温度で行なう。
【００２９】５〜１００時間の一般的な変換期間の後、
ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を既知の方法で、
たとえば好適な有機溶剤で抽出することにより、分離す
ることができる。　　好ましくは、ヒドロキシル化され
たピラジン誘導体を塩素化した有機溶剤、たとえば塩素
化炭化水素または酢酸エチルで抽出することにより分離
する。
【００３０】
【実施例１】ピラジン代謝性微生物の分離好気性のピラ
ジン代謝性微生物を、Ａ＋Ｎ−媒体（表１）中で、唯一
の炭素およびエネルギーの供給源として０．１％（ｗ／
ｖ）ピラジンを加えて培養した。　　微生物を分離する
ための一般的な技術は、たとえば、Ｇ．ドリュウス『微
生物学実習』第４版、スプリンガー出版（１９８３）に
記載されている。　　接種物として、大地、浄化施設、
堆肥の山および蟻塚から得た試料を使用した。　　濃縮
は振とうフラスコ中で３０℃で行なった。　新しい培地
中に３回過剰接種した後、その濃縮物を１リットルあた
り１６　ｇの寒天を加えた同じ培地上に塗り、３０℃で
培養した。　　寒天培地上で何度も塗った後、純粋な培
養菌を分離することができた。
【００３１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　表１　　Ａ＋Ｎ−
媒体構成成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　濃度（ｍｇ／ｌ）（ＮＨ４）２
ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２０００Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２０００ＫＨ２ＰＯ４　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０００ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３０００ＭｇＣｌ２　　
６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　４００ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１４．５ＦｅＣｌ３・６Ｈ
２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．８ピリドキサール塩酸塩　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１０／１０００リボフラビン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５／１０００ニコチン酸アミド　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５／１０００チアミン塩酸
塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２／１０００ビオチン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２／１０００
パントテン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５／１０００ｐ−アミノ安息香酸塩
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５／１
０００葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２／１０００ビタミ
ンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５／１０００ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１００／１０００
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　９０／１０００Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３００／１
０００ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２００／１０００ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０／１００
０ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２０／１０００Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ
　　　　　　　　　　　　　　　　　３０／１０００Ｅ
ＤＴＡＮａ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５／１０００ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２／１０００（溶
液のｐＨは７．０に調節した）
【００３２】
【実施例２】３−クロロピラジンの３−クロロ−２−ヒ
ドロキシピラジンへの変換 発酵装置中で、アグロバクテリウムｓｐ．（ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．　６１３６）を、０．１％（ｗ／ｖ）ピラジンを加
えたＡ＋Ｎ−媒体中で、ｐＨ７および３０℃の温度で培
養した。　　続いて細胞を遠心分離し、Ａ＋Ｎ−媒体中
に再び分散させ、６５０　ｎｍにおける光学光度１０に
調節した。この細胞分散物を振とうフラスコ中に入れ、
１リットルあたり２６ｍｍｏｌの３−クロロピラジン（
０．３％ｗ／ｖ）を加えた。　　３０℃で８時間、振と
う装置上で培養した後、１リットルあたり２０　ｍｍｏ
ｌの３−クロロ−２−ヒドロキシピラジン、７７％収量
に相当、が確認された。
【００３３】
【実施例３〜５】実施例２に準じて行なった。　　その
結果を表２に示す。
【００３４】ヒドロキシ基の位置は、マクドナルド　　
ＪＣ，ビショップ　　ＧＧ，マズレク（１９７６），Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３２，６５５頁以降の記載にし
たがって確認した。
【００３５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表２　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　媒体中の複　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　素環式化合　　実施例　
　　　　　基質　　　　　　物の濃度　　　　反応時間
　　　　最終生成物　　　　　　　収量　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　％（ｗ／ｖ）
　　　　　　　（ｈ）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　（％）　　　　　３　　　　２−メ
チルピラジン　　０．２　　　　　　　　１　　　　２
−ヒドロキシ−６−　　　　５０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　メチルピラジン　　４　　　　
２−エチルピラジン　　０．２　　　　　　２４　　　
　６−エチル−２−ヒドロ　　２０　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　キシピラジン　　５　　　　
２，３−ジメチル　　　　　　０．２　　　　　　１０
　　　　２−ヒドロキシ−５，６−　　２０　　　　　
　　　　　　　　　ピラジン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ジメチルピラジン　　　　　

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　ピラジンを唯一の炭素、窒素およびエ
    ネルギーの供給源として成長することができ、基質とし
    て、一般式 【化１】 〔式中、Ｒ１は水素原子またはハロゲン原子をあらわし
    、Ｒ２およびＲ３は同一または異なるものであって水素
    原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基をあらわすが、Ｒ１，
    Ｒ２およびＲ３が同時に水素をあらわすことはない。〕
    のピラジン誘導体を、一般式 【化２】 〔式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は上記の意味を有する。 〕のヒドロキシル化されたピラジン誘導体に変換し、そ
    の際、そのヒドロキシル化されたピラジン誘導体が成長
    媒体中に蓄積されることを特徴とする微生物。
  2. 【請求項２】　　ＤＳＭに番号６１３６で寄託された、
    アグロバクテリウムｓｐ．と呼ばれる、請求項１の微生
    物、その子孫および突然変異体。
  3. 【請求項３】　　ヒドロキシル化されたピラジン誘導体
    の製造方法において、請求項１または２の微生物に、一
    般式 【化３】 〔式中、Ｒ１は水素原子またはハロゲン原子をあらわし
    、Ｒ２およびＲ３は同一または異なるものであって水素
    原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基をあらわすが、Ｒ１，
    Ｒ２およびＲ３が同時に水素をあらわすことはない。〕
    のピラジン誘導体を作用させて一般式 【化４】 〔式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は上記の意味を有する。 〕のヒドロキシル化されたピラジン誘導体に変換し、濃
    縮された生成物を分離することを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】　　微生物の有効な酵素をピラジンで誘発
    することを特徴とする請求項３の方法。
  5. 【請求項５】　　培養基中の基質濃度が２０％（ｗ／ｖ
    ）を超えないように、基質を１回で、または連続的に供
    給して変換を行なうことを特徴とする請求項３または４
    の方法。
  6. 【請求項６】　　変換をｐＨ４〜１０で行なうことを特
    徴とする請求項３〜５のいずれかの方法。
  7. 【請求項７】　　変換を０〜５５℃の温度で行なうこと
    を特徴とする請求項３〜６のいずれかの方法。
  8. 【請求項８】　　６−エチル−２−ヒドロキシピラジン
    。
JP3289586A 1990-11-08 1991-11-06 ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を製造するための微生物学的方法 Withdrawn JPH04365494A (ja)

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CH3550/90-2 1990-11-08
CH355090 1990-11-08

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JP (1) JPH04365494A (ja)
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