JPH05219966A

JPH05219966A - カテコールの製造法

Info

Publication number: JPH05219966A
Application number: JP2537392A
Authority: JP
Inventors: Mayumi Tsujiki; 真由美辻木; Yasushi Aoki; 裕史青木; Yuuko Wanaki; 優子和南城; Satoshi Tsuzuki; 敏続木
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1992-02-12
Publication date: 1993-08-31

Abstract

(57)【要約】【構成】ロドコッカス属に属し、ベンゼンを酸化して
カテコールを生成する能力を有する微生物をベンゼンを
含有する培地中で培養し、又は菌体をベンゼンを含有す
る溶液に懸濁して反応させて、培養液又は反応液中にカ
テコールを蓄積せしめこれを採取することを特徴とする
カテコールの製造法。【効果】ベンゼンより微生物を使用してカテコールを
効率良く安全に製造することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は合成樹脂の重合防止剤・
医薬品等の合成原料、酸化防止剤等に幅広く利用されて
いるカテコールの製造法に関し、微生物を用いたベンゼ
ンよりの製造手段に関する。

【０００２】

【従来の技術】カテコールの工業的製造は、従来、フェ
ノ−ルを原料として過酸化水素等の酸化剤を用いて化学
的に酸化する方法により行なわれてきた。近年、ベンゼ
ンを原料として、微生物によってカテコールを製造しよ
うとする試みが成されている。例えば、特開昭５９−１
９６０９６にはシュ−ドモナス属の菌株を用いてカテコ
ールを製造する方法が示されている。同様に、特開昭６
１−１４９０８１、特開昭６２−２２８２７６、特開昭
６２−２８９６７４、特開昭６３−２４８８２、特開昭
６３−２４８９１にも同属菌株或いはそれ由来の遺伝子
を用いた方法が示されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は安全か
つ安価に、高収率・高選択性をもってベンゼンからカテ
コールを製造することにある。従来からの工業的製造方
法である化学合成では、フェノールの酸化に用いる過酸
化物の取扱に爆発などの危険が伴い、製造に特殊な技術
と安全対策が要求される。また、合成途上でハイドロキ
ノン等の副産物が生成し、カテコールの収率を下げる要
因となっている。本発明による微生物を用いた製造方法
では、常温・常圧の条件下での安全な、副成物の極めて
少ない高収率の製造が可能である。また、従来から提起
されている微生物によるカテコールの製造方法では、用
いられる菌株はシュードモナス属のものであるが、本発
明者らの知見によればこれらの方法では生成するカテコ
ールの量は工業的に必ずしも十分とは言えない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するために検討を重ねた結果、ロドコッカス属に
属する微生物を用いることにより効果的にベンゼンから
カテコールを製造できることを見出し、本発明を完成す
るに至った。即ち、本発明によればロドコッカス属に属
しベンゼンを酸化してカテコールを生成する能力を有す
る微生物をベンゼンを含有する培地中で培養し、培養液
中にカテコールを蓄積せしめこれを採取することを特徴
とするカテコールの製造法及びロドコッカス属に属し、
ベンゼンを酸化してカテコールを生成する能力を有する
微生物を培養し、得られた菌体をベンゼンを含有する溶
液に懸濁して反応させて液中にカテコールを蓄積せし
め、これを採取することを特徴とするカテコールの製造
法が提供される。

【０００５】本発明で使用されるロドコッカス属の微生
物としては、例えば、東京都大田区の土壌よりベンゼン
を唯一の炭素源及びエネルギ−源とする培地を用いて分
離されたロドコッカスＳＤ８０１株等が挙げられる。そ
の菌学的性質は下記のとおりである。尚、本菌株の同定
は「バ−ジェイズマニュアルオブシステマティッ
クバクテリオロジー」及び「放線菌の同定実験法」
（日本放線菌研究会編）に基づいて成された。

【０００６】ロドコッカスＳＤ８０１株菌学的性質細胞の形態：多形性桿菌、桿形−球形のサイク
ルを有する。細胞の大きさ：長径１．２〜１５μｍ、短径１．
２〜１．５μｍグラム染色性：陽性芽胞：形成しない運動性：なしオキシダーゼ：陰性カタラーゼ：陽性集落の色調^* ：オレンジ色集落の形態^* ：円形、均一で盛り上がる。光沢あ
り。湿潤。集落の大きさ^* ：径１．５ｍｍ酸素に対する態度：好気的細胞壁のジアミノ酸：メソジアミノピメリン酸グリコリル試験：陽性（グリコリル型）細胞壁の糖組成：アラビノース及びガラクトース；
陽性キノン系：ＭＫ−８（Ｈ₂ ）チロシン分解：陽性尿素分解：陰性０．０２％アジ化ナトリウム存在下の生育：陰性４０℃での生育：陽性５％塩化ナトリウム存在下の生育：陽性０．３％フェニルエチルアルコール存在下の生育：陽性炭素化合物の資化性：資化しない；イノシトール、マルトース。資化する；マンニトール、ソルビトール、メタヒドロキ
シ安息香酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム、乳酸ナトリウム、アセトアミド、ピルビン酸ナトリ
ウム、エタノ−ル、ベンゼン。（＊：０．８％ニュートリエント寒天平板培地、３５
℃、３日間培養）

【０００７】本菌株はオレンジ色のバクテリア様集落を
形成すること、細胞が多形性を有すること、グラム染色
性が陽性であること、好気的であること等から判断して
ロドコッカス属に属するものと推定された。更に、集落
の形態、色調が特異的なこと、チロシンの分解性が陽性
であること、イノシトールを資化しないこと、メタヒド
ロキシ安息香酸を資化すること、安息香酸を資化するこ
と、クエン酸を資化すること、チロシンを分解するこ
と、尿素を分解しないこと、主たるメナキノンがＭＫ−
８タイプであることなどから、ロドコッカス・ロドクロ
スであると推定された。しかしながら、マルト−スを資
化しないこと、ベンゼンを資化することにおいて、本菌
株は既知のロドコッカス・ロドクロスとは異なるもので
ある。以上の菌学的検討の結果、本発明で用いられる微
生物はロドコッカス・ロドクロスの新菌株であると結論
された。そこで本菌株はロドコッカスＳＤ８０１株と命
名され、工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第１
２７０８号として寄託されている。

【０００８】本発明はロドコッカスＳＤ８０１株の突然
変異株のうち、カテコール生産性の増大したものを用い
て行なうこともできる。このような突然変異株は、例え
ば、ベンゼンに対する耐性の向上した変異株、カテコー
ルに対する耐性の向上した変異株、カテコールを分解し
なくなったカテコール非資化性変異株、カテコール生成
に係わるベンゼンジオキシゲナ−ゼとジヒドロカテコー
ルデヒドロゲナ−ゼのうち１種又は両方の高生産性変異
株などである。突然変異株の取得方法としては、通常、
対数増殖期後期の菌体、例えば、ロドコッカスＳＤ８０
１株を１％ペプトンなどの栄養培地で３５℃で６〜１０
時間程度培養したもの等を使用して変異誘起処理すれば
よい。変異源としてはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤、５−
ブロモウラシル（５ＢＵ）等の塩基アナログ、ジメチル
アミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム（ＤＡＰ
Ａ）、アザセリンやアクリジンオレンジなど一般に知ら
れる変異誘起化合物や紫外線が用いられる。ＤＡＰＡの
場合は栄養源存在下で増殖させながら、また他の変異誘
起化合物や紫外線の場合には集菌後に生理食塩水やリン
酸緩衝液等に再懸濁して処理を行なう。ベンゼン或いは
カテコールに対する耐性の向上した変異株はいわゆる集
積培養によって濃縮することができる。即ち、変異誘起
処理後の菌体をロドコッカスＳＤ８０１株がよく生育で
きない濃度、夫々１０ｇ／ｌ以上のベンゼン或いはカテ
コールを含む栄養培地で数時間培養する。これを繰り返
すことによってベンゼン或いはカテコールに対する耐性
の向上した株を高頻度で得ることができる。

【０００９】変異誘起処理後の菌体に、いわゆるペニシ
リンスクリーニングを行なうことによってカテコールの
非資化性株を濃縮することができる。本発明の場合に
は、ロドコッＳＤ８０１株の生育できない、１０μｇ／
ｍｌ程度の濃度のペニシリン存在下、カテコールを唯一
の炭素源とする培地中で菌体を数時間培養することによ
って行なう。但し、この操作は省略しても良い。変異誘
起処理後或いは濃縮後の菌体からの非資化性変異株の選
抜はレプリカ法によって行なう。即ち、一度ニュートリ
エント寒天等の栄養平板培地に全ての菌をプレ−ティン
グして培養して独立したコロニーを形成させてから、こ
れをカテコールを唯一の炭素源とする寒天平板培地に滅
菌したビロ−ド布等を用いてレプリカして培養する。生
じたコロニーを栄養培地に生じたコロニーと比較して、
栄養培地にのみ生育するコロニーを釣菌する。こうして
得られたカテコール非資化性変異株群の中に極めて高頻
度で求めるカテコール高生産株を見出すことができる。

【００１０】カテコール生成に係わる酵素の高生産変異
株は変異誘起処理後の菌体をベンゼンを唯一の炭素源と
する培地を用いて数時間づつ繰り返し培養して濃縮す
る。濃縮操作後の菌を単コロニー分離し、ベンゼンを唯
一の炭素源とする培地で親株よりも生育速度の早いもの
を探すことにより該酵素の高生産変異株を得ることがで
きる。これら人工突然変異によるカテコール生産性に関
する特性の付与は各々単一でも効果があるが、これらを
組み合わせ、複合した特性を有する変異株を得ることに
よって著しい生産性の向上を見ることも可能である。本
発明は遺伝子操作によって育種されるカテコール高生産
株を用いて行なうこともできる。このような遺伝子操作
株は一般的に知られる手法によりベンゼンからカテコー
ルの生成に関わるベンゼンジオキシゲナーゼおよびジヒ
ドロカテコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
菌体内に増幅することによって得られる。

【００１１】本発明における微生物の培養は、カテコー
ル非資化性変異株を用いる場合を除き、ベンゼンを単独
の炭素源として用いることができる。この時培地へのベ
ンゼンの添加濃度はベンゼンに対する耐性の向上した変
異株では１〜２０ｇ／ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／ｌで
行なう。その他の株では１〜５ｇ／ｌ、好ましくは１〜
２ｇ／ｌである。１ｇ／ｌを下回る濃度では生育及びカ
テコール生成速度が遅く、上限を上回る範囲では生育に
強い阻害が見られる。本発明における培養はベンゼンに
加え他の炭素源を補って行うこともできる。この時の炭
素源としてはベンゼンの他に、例えば、グルコースやシ
ュクロース、フルクト−スなどの糖類、エタノール又は
酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸などの有機
酸類又はそのアルカリ金属などの塩が用いられる。ま
た、例えば、ペプトン、肉エキス、かつおエキス、大豆
かす、ふすまなどの天然有機炭素源を使用することもで
きる。更に、同菌株が資化し生育できる炭素化合物なら
ばいずれでも使用可能である。これら炭素源は単独で或
いは組合わせて、通常各々１〜１００ｇ／ｌ程度の濃度
で培地に添加される。トルエン、エチルベンゼン、メタ
ノール、マルトース、デンプンは同菌株が資化すること
ができず用いることができない。補助炭素源を用いる場
合でもベンゼンの添加量はベンゼンを唯一の炭素源とす
る場合と同様である。

【００１２】培養時には菌の増殖に伴いベンゼンからカ
テコールが生成し蓄積する。培養開始時に低い濃度でベ
ンゼンを添加し、培養終了以前にベンゼンがすべて消費
された場合には、途中から更に前記濃度範囲のベンゼン
を添加しても良い。また、培養の増殖期にはベンゼンを
炭素源として用いず、培養途中で菌の生育が定常期に入
ってから反応基質としてベンゼンを添加することもでき
る。この場合にも、培養定常期までは上記炭素源のいず
れかを用いる。用いる菌株がカテコール非資化性変異株
の場合には、カテコールと同様ベンゼンをも資化するこ
とができないのでこの方法でのみ培養を行なう。いずれ
の場合にも、ベンゼンの添加濃度は増殖期から添加する
場合よりも高くすることができ、ベンゼンに対する耐性
の向上した変異株では１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは１〜
２０ｇ／ｌで行なう。それ以外の株では１〜５ｇ／ｌが
適当である。いずれも１ｇ／ｌ以下ではカテコール生成
速度が遅い。

【００１３】培養の窒素源としては、例えば、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩などの無機窒素
源、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなど
の有機窒素源を使用することができる。無機窒素源は
０．１〜１０ｇ／ｌ、有機窒素源は１〜１００ｇ／ｌ程
度の濃度で培地に添加される。尿素は同菌株が分解する
ことができず用いることができない。更に必要に応じ
て、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第１鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫
酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金
属塩やホウ酸が菌の生育改善のために添加される。添加
濃度は培養条件によって異なるが、通常、リン酸塩にお
いては０．５〜５０ｇ／ｌ、マグネシウム塩においては
０．１〜５ｇ／ｌ、他の化合物では０．１〜１００ｍｇ
／ｌの範囲である。また、選択する培地によりビタミ
ン、アミノ酸、核酸塩基の供給源としてそれぞれ酵母エ
キス、カザミノ酸、酵母核酸を１０〜５００ｍｇ／ｌ添
加し、より生育速度を増大させて安定した培養を行なう
ことができる。

【００１４】培養は通常好気的条件下、２０〜４１℃の
温度範囲、好ましくは３０〜３７℃の温度範囲で行なわ
れる。ロドコッカスＳＤ８０１株を用いる場合には、２
０℃以下でも菌は生育するが生育速度が極めて遅く好ま
しくない。また、４２℃以上の温度では菌は殆ど生育し
ない。培養時間は培地組成、培養条件によって異なる
が、通常１〜５日間で行なわれる。培養時のｐＨは６〜
８．５の範囲、好ましくは７〜８の範囲で行なわれる。
６未満或いは９以上のｐＨでは菌の生育が不良となる。
培地組成により培養中のｐＨは次第に低下或いは上昇す
るが、この場合には塩酸や硫酸、水酸化ナトリウムを逐
次添加して上記範囲内にｐＨを調整することが好まし
い。

【００１５】本発明におけるカテコールの製造は上記の
ごとくベンゼンを含む培地で培養した菌体或いは全くベ
ンゼンを含まぬ培地で培養した菌体を培養液から分離
し、ベンゼンを含む緩衝液等に再懸濁して反応させる、
いわゆるレスティング・セル・サスペンジョン法によっ
ても可能である。培養した菌体は遠心分離やメンブレン
フィルター濾過などの方法によって集めることができ
る。これに、例えば、リン酸、酢酸、ホウ酸やトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとその塩を混合
した緩衝液又は水を加えて懸濁する。緩衝液の濃度は１
０〜２００ｍＭ程度で行なう。２００ｍＭを越す濃度の
緩衝液中では反応に阻害が起こる。反応時の溶液のｐＨ
は培養時のｐＨと同じく６〜８．５の範囲が適当であ
る。菌体懸濁液に加える基質のベンゼン濃度はベンゼン
に対する耐性の向上した株で１〜５０ｇ／ｌ、好ましく
は１〜２０ｇ／ｌの濃度で行なう。その他の株では１〜
５ｇ／ｌが適当である。反応は好気的条件下、培養時と
同様の温度、ｐＨ、時間で行なう。用いた緩衝液の濃
度、種類によっては反応中にｐＨが変動するが、培養時
と同様にしてｐＨのコントロールを行なうことが好まし
い。緩衝液の濃度が高ければ酸やアルカリの添加は殆ど
必要ないが、水中で反応させた場合には少量の酸または
アルカリが必要となる。

【００１６】培養液又は反応液からのカテコールの分離
・精製は有機溶媒による抽出等によって行なう。用いる
有機溶媒はカテコールを効率よく抽出出来るものならば
任意でよく、例えば、酢酸エチル等のエステル類、ジエ
チルエーテル等のエーテル類が使用できる。ノルマルヘ
キサン等のパラフィン類はカテコールの抽出率が低く適
当でない。用いる有機溶媒の量は種類によって異なる
が、培養液・反応液の１／１０から等量程度が適当であ
る。抽出前に培養液・反応液に塩酸などの酸を添加し溶
液のｐＨを２程度に下げておくことによって抽出をより
高効率にすることもできる。抽出操作後に水層を分液除
去して有機層の溶媒を留去することによってカテコール
粗結晶が得られる。更にこの粗結晶を水酸化ナトリウム
溶液等のアルカリ溶液に溶解し、有機溶媒による抽出と
分液、溶媒留去を繰り返すことによって純度の高いカテ
コールを得ることができる。

【００１７】本発明におけるカテコールの検出および定
量は高速液体クロマトグラフィーによって行なう。即
ち、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラム
などを固定相に用い、水とメタノール或いは水とアセト
ニトリルの混合物にリン酸等の酸を添加したものを移動
相とする一般的な逆相クロマトグラフィーによって分析
が可能である。検出は紫外部分光検出器によって波長２
５０ｎｍ付近で行なう。

【００１８】

【実施例】以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的
な説明を行なうが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。実施例１表１に示す培地１００ｍｌを調製後５００ｍｌ容の三
角フラスコに入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブ
滅菌を行い、予め１％ペプトン寒天培地（ｐＨ７）で前
培養しておいたロドコッカスＳＤ８０１株を１白金耳量
植菌した。フラスコに１００ｍｇのベンゼンを添加し、
シリコン栓で密栓後３５℃で２日間振盪培養した。培養
終了後、培養液に濃塩酸１ｍｌおよび酢酸エチル１００
ｍｌを加えて有機溶媒可溶性成分を抽出し、有機層を分
離後その一部を下記に示す条件で高速液体クロマトグラ
フィーにより分析した結果、標品カテコールと一致する
ピ−クが認められた。カラム：ＳｈｏｄｅｘＯＤＳｐａｋＦ４１１又はＲＳ
ｐａｋＤＳ−６１３移動相：水：アセトニトリル（３０：７０）、５０ｍＭ
リン酸送液：１ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３５℃、検出方法：ＵＶ吸収波長２５４ｎｍ次に、抽出した有機層の一部を下記に示す条件でガスク
ロマトグラフィーにより分析した結果、メインのピーク
の保持時間が標品カテコールと一致した。カラム：５％フェニルメチルシリコン移動相：ヘリウム（３０ｍｌ／ｍｉｎ．）、昇温：１５０〜２５０℃、５℃／ｍｉｎ．気化室温度：２７０℃、検出方法：ＦＩＤ更に、抽出した有機層の一部をＧＣマススペクトログラ
フィーにより分析した結果、上記ガスクロマトグラフィ
ーで見られたメインのピークに分子量１１０の分子イオ
ンピ−クが認められ、その分解パターンは標品カテコー
ルと完全に一致した。以上の分析結果より生成したカテ
コール濃度は０．５５ｍｇ／ｍｌと計算された。

【００１９】実施例２表１の培地の成分のうちエタノールを除く各成分を５
００ｍｌ容フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１℃、２０
分間のオートクレーブ滅菌を行なった。これにエタノー
ルを所定濃度になるように添加し、予め１％ペプトン寒
天培地（ｐＨ７）で前培養しておいたロドコッカスＳＤ
８０１株を１白金耳量植菌した。フラスコに１００ｍｇ
のベンゼンを添加してシリコン栓で密栓後３５℃で２日
間振盪培養した。培養終了後実施例１と全く同様にして
抽出し定量を行なった結果、培養液中に生成したカテコ
ール濃度は０．８９ｍｇ／ｍｌであった。

【００２０】実施例３表１の培地の成分のうちエタノールを除く各成分を綿
栓付き５００ｍｌ容フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１
℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を行なった。これに
エタノールを所定濃度になるように添加し、予め１％ペ
プトン寒天培地（ｐＨ７）で前培養しておいたロドコッ
カスＳＤ８０１株を１白金耳量植菌し、３５℃で１日間
振盪培養した後、この培養液にベンゼン２００ｍｇを添
加し、６規定水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．
０に調整後、シリコン栓で密栓し３５℃でさらに１日間
培養した。培養終了後、実施例１と全く同様にして抽出
し定量を行なった結果、培養液中に生成したカテコール
濃度は２．０３ｍｇ／ｍｌであった。

【００２１】実施例４表１の培地の成分のうちエタノールを除く各成分を綿
栓付き５００ｍｌ容フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１
℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を行なった。これに
エタノールを所定濃度になるように添加し、予め１％ペ
プトン寒天培地（ｐＨ７）で前培養しておいたロドコッ
カスＳＤ８０１株を１白金耳量植菌し、３５℃で１日間
振盪培養した後、この培養液から菌体を１０，０００
Ｇ、２０分の遠心分離により集菌し、ｐＨ８．０に調製
した１００ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌに懸濁した。こ
れを５００ｍｌ容三角フラスコに移した後、２００ｍｇ
のベンゼンを添加して、シリコン栓で密栓後３５℃で１
６時間振盪した。反応液に濃塩酸１ｍｌおよび酢酸エチ
ル１００ｍｌを加えて有機溶媒可溶性成分を抽出し、実
施例１と同様にして分析した結果、反応液中に生成した
カテコール濃度は２．２６ｍｇ／ｍｌであった。

【００２２】実施例５予め１％ペプトン寒天培地（ｐＨ７）で前培養しておい
たロドコッカスＳＤ８０１株をモルトン栓付き試験管に
入れた１％ペプトン５ｍｌに１白金耳量植菌し、３５℃
で６時間振盪培養した後、菌体を遠心分離によって集め
て生理食塩水５ｍｌに懸濁した。３５℃で１時間振盪後
集菌し、再び同量の生理食塩水に懸濁した。これに濃度
０．１ｍｇ／ｍｌとなるようにＮＴＧを添加し、３５℃
で１０分間振盪した。変異誘起処理した菌体を遠心分離
と生理食塩水への懸濁の繰り返しによって洗浄後、１０
ｍｇ／ｍｌのベンゼンを含む１％ペプトン５ｍｌを入れ
た試験管に移し、シリコン栓で密栓後３５℃で２４時間
振盪培養した。これを集菌してベンゼンを含まぬ１％ペ
プトン５ｍｌに懸濁し３５℃で２４時間振盪培養したと
ころ培養液に濁度の上昇が認められた。この菌体を遠心
分離によって集め、再び１０ｍｇ／ｍｌのベンゼンを含
む１％ペプトン５ｍｌに懸濁し３５℃で１２時間振盪培
養した。培養液の濁度の上昇を確認後生理食塩水で適宜
希釈して１％ペプトン寒天平板培地にプレ−ティングし
３５℃で２日間培養した。この平板培地に生じたコロニ
ーのうち１０コロニーを釣菌し、各々を１０ｍｇ／ｍｌ
のベンゼンを含む１％ペプトン５ｍｌに植菌した。３５
℃で６時間培養したところ１０株のうち８株の培養液に
濁度の上昇が見られた。このとき同条件で培養した親株
には濁度上昇は見られず、この８株はベンゼンに対する
耐性の向上した変異株であると判断された。次に、この
変異株のうち最も濁度の上昇した１株の１白金耳量を綿
栓付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れた表１に示す培
地２０ｍｌに植菌し、３５℃で１日間振盪培養した
後、この培養液にベンゼン２００ｍｇを添加し、６規定
水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．０に調整後シ
リコン栓で密栓し３５℃で更に２日間培養した。培養終
了後培養液に濃塩酸０．２ｍｌおよび酢酸エチル２０ｍ
ｌを加えて抽出し、実施例１と同様に分析を行なった結
果、培養液中に生成したカテコール濃度は８．６２ｍｇ
／ｍｌであった。

【００２３】実施例６実施例５で用いたベンゼンに対する耐性の向上した変異
株を１％ペプトン寒天培地（ｐＨ７）で前培養し、モル
トン栓付き試験管に入れた１％ペプトン５ｍｌに１白金
耳量植菌して３５℃で６時間振盪培養した。菌体を遠心
分離によって集め、実施例５と全く同様にしてＮＴＧに
よる変異誘起処理を行なった。変異誘起処理した菌体を
実施例５と同様にして集菌、洗浄した後モルトン栓付き
試験管に入れた表１の培地５ｍｌに移した。これにカ
テコール非資化性変異株の濃縮のためアンピシリンを濃
度１０μｇ／ｍｌとなるように添加して３５℃で３時間
振盪培養した。集菌、洗浄後、同一培地に再び懸濁しア
ンピシリン処理を繰り返した。濃縮処理後菌体を集菌、
洗浄し、生理食塩水に懸濁し、更に適宜希釈して１％ペ
プトン寒天平板培地にプレーティングした。３５℃で２
日間培養後滅菌したビロード布を用いて第１表に示す
組成に１５ｍｇ／ｍｌの寒天を加えて作成した平板培地
にレプリカした。レプリカした平板を３５℃で５日間培
養後、冷蔵保存しておいた元のペプトン平板と並べて比
較し、後者には存在するが前者には生じていないコロニ
ーを探した。レプリカした約３万コロニーのうち、求め
るコロニーは４個得られた。得られたカテコール非資化
性株４株を１％ペプトン寒天平板培地に植え継ぎ、３５
℃で２日間培養後モルトン栓付き試験管に入れた表１の
培地５ｍｌに各々１白金耳量植菌して３５℃で１２０
時間振盪培養した。いずれの菌株も親株に比べ生育が著
しく不良であった。培養終了後各々の培養液の一部を高
速液体クロマトグラフィー分析した結果、４株のうち１
株でカテコールが全く分解されていないことがわかっ
た。この株はカテコール分解酵素を欠損したカテコール
非資化性変異株であると判断された。次に、この変異株
の１白金耳量を綿栓付き５００ｍｌ容三角フラスコに入
れた表１の培地２０ｍｌに植菌し３５℃で１日間振盪
培養した後、この培養液にベンゼン２００ｍｇを添加
し、６規定水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．０
に調整後、シリコン栓で密栓し３５℃でさらに２日間培
養した。培養終了後培養液に濃塩酸０．２ｍｌお呼び酢
酸エチル２０ｍｌを加え抽出し、実施例１と同様にして
分析を行なった結果、培養液中に生成したカテコール濃
度は１４．１ｍｇ／ｍｌであった。

【００２４】

【発明の効果】本発明によりロドコッカス属に属し、ベ
ンゼンを酸化してカテコールを生成する能力を有する微
生物を使用してカテコールを効率良く安全に製造するこ
とが可能である。

【００２５】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者続木敏東京都大田区多摩川２丁目24番25号昭和電工株式会社生化学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ロドコッカス属に属し、ベンゼンを酸化
してカテコールを生成する能力を有する微生物をベンゼ
ンを含有する培地中で培養し、培養液中にカテコールを
蓄積せしめこれを採取することを特徴とするカテコール
の製造法。
【請求項２】ロドコッカス属に属し、ベンゼンを酸化
してカテコールを生成する能力を有する微生物を培養
し、得られた菌体をベンゼンを含有する溶液に懸濁して
反応させて液中にカテコールを蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするカテコールの製造法。
【請求項３】用いる菌株がロドコッカスＳＤ８０１
株またはその突然変異株である請求項１または２記載の
カテコールの製造法。
【請求項４】ロドコッカスＳＤ８０１株。