JPH0678780A - パラヒドロキシ安息香酸の製造法およびその製造法に使用する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 微生物を利用して安息香酸からパラヒドロキ
シ安息香酸を高収率、高選択率で製造する方法を提供す
る。 【構成】 安息香酸を酸化してパラヒドロキシ安息香酸
を生成する能力を有するペニシリウム(Penicillium) 属
あるいはアスペルギルス(Aspergillus) 属に属する微生
物を培地中で培養し、培養液中にパラヒドロキシ安息香
酸を蓄積せしめこれを採取するパラヒドロキシ安息香酸
の製造法、その製造法に用いるペニシリウム(Penicilli
um) 属およびアスペルギルス(Aspergillus) 属に属する
微生物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は合成樹脂、合成繊維、染
顔料等の原料、あるいは食品、化粧品、医薬品用の防腐
剤の原料等として有用なパラヒドロキシ安息香酸の製造
法に関する。さらに詳しくいえば、微生物を用いて安息
香酸からパラヒドロキシ安息香酸を製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術およびその課題】パラヒドロキシ安息香酸
は、従来工業的にはフェノールを原料として製造されて
いる。すなわち、フェノールをカリウム塩として脱水
後、加圧、加熱条件下で二酸化炭素と化学的に反応させ
る方法により製造されているが、この方法は工程が複雑
であり、高温、高圧下で大量の有機溶媒を用いるため爆
発などの危険が伴うほか環境への影響も無視できない。

【０００３】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、常
温、常圧の条件下で実施できる微生物の培養を利用し
て、安全かつ安価に、高収率、高選択率で安息香酸から
パラヒドロキシ安息香酸を製造する方法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するべく検討を重ねた結果、ペニシリウム(Penicil
lium) 属あるいはアスペルギルス(Aspergillus) 属に属
する微生物を用いることにより副生成物が極めて少なく
高収率で効果的に安息香酸からパラヒドロキシ安息香酸
を製造できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００５】すなわち、本発明は １）安息香酸を酸化してパラヒドロキシ安息香酸を生成
する能力を有する微生物を安息香酸を含有する培地中で
培養し、培養液中にパラヒドロキシ安息香酸を蓄積せし
めこれを採取することを特徴とするパラヒドロキシ安息
香酸の製造法、 ２）安息香酸を酸化してパラヒドロキシ安息香酸を生成
する能力を有する微生物を培養し、得られた菌体を安息
香酸を含有する溶液に懸濁して反応させて液中にパラヒ
ドロキシ安息香酸を蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とするパラヒドロキシ安息香酸の製造法、

【０００６】３）ペニシリウム(Penicillium) 属または
アスペルギルス(Aspergillus) 属に属する微生物を使用
する前記１または前記２に記載のパラヒドロキシ安息香
酸の製造法、 ４）パラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有するペ
ニシリウム・ジャンシネルム(Penicillium janthinellu
m ）ＳＤ８０２株、および ５）パラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有するア
スペルギルス・フラビペス(Aspergillus flavipes ）Ｓ
Ｄ８０３株を提供したものである。

【０００８】本発明の製造法で使用されるペニシリウム
属あるいはアスペルギルス属の微生物としては、例え
ば、土壌中から安息香酸を唯一の炭素源およびエネルギ
ー源とする培地を用いて分離されたペニシリウム・ジャ
ンシネルム(Penicillium janthinellum ）ＳＤ８０２
株、アスペルギルス・フラビペス(Aspergillus flavipe
s）ＳＤ８０３株が挙げられる。

【０００９】その菌学的性質を下記に示す。なお、本菌
株の同定は「ア・ラボラトリー・ガイド・トゥー・コモ
ン・アスペルギルス・スピーシーズ・アンド・ゼア・テ
レオモルフス（A laboratory guide to common Aspergi
llus species and their teleomorphs）」および「ア・
ラボラトリー・ガイド・トゥー・コモン・ペニシリウム
・スピーシーズ（A laboratory guide to common Penic
illium species」（共にＣＳＩＲＯ ディビジョン・オ
ブ・フードプロセッシング（CSIRO Division of Foodpr
ocessing) 出版）に基いて行なった。

【００１０】ペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２
株の菌学的性質 Ａ．培地上での生育状態 供試カビを麦芽エキス寒天平板培地（培地−１）および
ツァペックイーストエキス寒天平板培地（培地−２）に
接種し、２５℃および３７℃、７〜１４日間培養後、生
育したカビ集落の色調、形状および分生子形成構造等の
形態を観察した。 生育速度（２５℃，７日間） 培地−１：集落の直径 ４〜５ｃｍ 培地−２：集落の直径 ４〜５ｃｍ 生育速度（３７℃，７日間） 培地−２：わずかに生育 集落表面の色 培地−１：大部分白色，一部灰緑色 培地−２：明るい灰緑色 集落裏面の色 培地−１：ごくうすい黄色〜うすい赤 培地−２：ごくうすい黄色 集落表面の組織 培地−１：ビロード状〜羊毛状 培地−２：ビロード状〜羊毛状

【００１１】 栄養菌糸の色 培地−１：白色 培地−２：白色 分生子柄先端の分枝 培地−２：不対称に分枝，高角度に散開， 単輪性体のものを認める 分生子柄 培地−２：滑面 分生子形態細胞 培地−２：フィアライド 分生子の形態 培地−２：楕円形〜亜球形，滑面，直径２〜３ μｍ 子のう 培地−１：認めず 培地−２：認めず

【００１２】Ｂ．生理的・生態的性状 最適生育条件：２８〜３０℃、ｐＨ 6.2〜6.8 生育の範囲 ：２０〜３７℃、ｐＨ 4.5〜7.5

【００１３】本菌株は、綿毛状、淡灰緑色のコロニーを
形成し、裏面が赤褐色になること、分生子柄が粗壁で散
開し、楕円形〜球形の分生子を形成することなどから、
ペニシリウム・ジャンシネルム(Penicillium janthinel
lum)と推定された。本菌株はペニシリウム・ジャンシネ
ルム(Penicillium janthinellum ）ＳＤ８０２株と命名
され、工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第１３
１３９号として寄託されている。

【００１４】アスペルギルス・フラビペスＳＤ８０３株の菌学的性質 Ａ．培地上での生育状態 供試カビを麦芽エキス寒天平板培地（培地−１）および
ツァペックイーストエキス寒天平板培地（培地−２）に
接種し、２５℃および３７℃、７〜１４日間培養後、生
育したカビ集落の色調、形状および分生子形成構造等の
形態の観察により同定を試みた。

【００１５】 生育速度（２５℃，７日間） 培地−１：集落の直径 ２〜３ｃｍ 培地−２：集落の直径 ２〜３ｃｍ 生育速度（３７℃，７日間） 培地−２：集落の直径 約２ｃｍ 集落表面の色 培地−１：うすいオレンジ色〜淡黄色 培地−２：うすいオレンジ色〜淡黄色 集落裏面の色 培地−１：淡黄色〜淡褐色 培地−２：褐色〜暗褐色 集落表面の組織 培地−１：ビロード状 培地−２：ビロード状 栄養菌糸の色 培地−１：白色 培地−２：白色

【００１６】 水滴 培地−１：水滴を認めず 培地−２：水滴を認める 分生子頭の形態 培地−１：放射状 培地−２：放射状 分生子柄 培地−２：やや粗面 頂のうの形態，色調 培地−２：亜球形〜フラスコ状，先端緑色 フィアライド形成部分 培地−２：上部に形成 分生子形態細胞 培地−２：メトレ，フィアライド 分生子の形態 培地−２：球形〜亜球形，滑面，直径２〜３μ ｍ 子のう 培地−１：認めず 培地−２：認めず

【００１７】Ｂ．生理的・生態的性状 最適生育条件：２８〜３０℃、ｐＨ 6.0〜6.8 生育の範囲 ：２０〜３７℃、ｐＨ 4.5〜7.5

【００１８】本菌株は、上記の培地で生育が比較的遅い
こと、分生子柄や分生子が明るい黄褐色を呈しているこ
と、分生子柄の頂のうにメトレを介しフィアライドが形
成されること、培養時寒天培地上に水滴を生じことなど
から、アスペルギルス・フラビペス(Aspergillus flavi
pes ）と推定された。本菌株はアスペルギルス・フラビ
ペス(Aspergillus flavipes ）ＳＤ８０３株と命名さ
れ、工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第１３１
４０号として寄託されている。

【００１９】本発明の製造法では、安息香酸を酸化しパ
ラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物と
して、上記ペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２株
およびアスペルギルス・フラビペスＳＤ８０３株の突然
変異株の中から、パラヒドロキシ安息香酸生産性の増大
したものを選択して用いることもできる。

【００２０】このような突然変異体としては、例えば、
安息香酸に対する耐性の向上した変異株、パラヒドロキ
シ安息香酸に対する耐性の向上した変異株、パラヒドロ
キシ安息香酸を分解しなくなったパラヒドロキシ安息香
酸非資化性変異株、パラヒドロキシ安息香酸生成に関与
する安息香酸 ４−ハイドロキシラーゼの生産性の高い
変異株などが挙げられる。

【００２１】このような突然変異体の取得方法として
は、通常、分生子、例えば、ペニシリウム・ジャンシネ
ルムＳＤ８０２株あるいはアスペルギルス・フラビペス
ＳＤ８０３株を栄養寒天平板培地で３０℃で１〜２週間
程度培養し、生じた分生子を使用して変異誘起処理すれ
ばよい。突然変異源としては、一般に変異誘起化合物と
して知られている、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤、５−ブ
ロモウラシル（５ＢＵ）等の塩基アナログ、ジメチルア
ミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム（ＤＡＰ
Ａ）、アザセリンやアクリジンオレンジなどおよび紫外
線が用いられる。ＤＡＰＡの場合は、栄養源存在下で増
殖させながら処理し、また他の変異誘起化合物や紫外線
の場合には分生子を生理食塩水やリン酸緩衝液等に懸濁
して処理を行なう。

【００２２】安息香酸およびパラヒドロキシ安息香酸耐
性変異株の取得法 安息香酸あるいはパラヒドロキシ安息香酸に対する耐性
の向上した変異株は、集積培養法によって濃縮すること
ができる。すなわち、ペニシリウム・ジャンシネルムＳ
Ｄ８０２株あるいはアスペルギルス・フラビペスＳＤ８
０３株の変異誘起処理後の分生子をそれぞれよく生育で
きない、安息香酸（１０ｇ／ｌ以上）あるいはパラヒド
ロキシ安息香酸（１０ｇ／ｌ以上）を含む栄養寒天平板
培地で４８時間程度培養し、コロニー生育速度の速いも
のを新しい栄養寒天平板培地に釣菌する。これを繰り返
すことにより安息香酸あるいはパラヒドロキシ安息香酸
に対する耐性の向上した株を高頻度で得ることができ
る。

【００２３】パラヒドロキシ安息香酸非資化性株の取得法 変異誘起処理後の分生子を、パラヒドロキシ安息香酸を
炭素源として培養し、発芽しない分生子を集めることに
よりパラヒドロキシ安息香酸非資化性株を濃縮すること
ができる。本発明の場合には、変異処理後の分生子を１
ｇ／ｌのパラヒドロキシ安息香酸を唯一の炭素源とする
培地中で十数時間培養してパラヒドロキシ安息香酸資化
性株の分生子を発芽させた後、培養液をナイロンメッシ
ュ等でろ過して除去することによりろ液中に発芽しない
パラヒドロキシ安息香酸非資化性株の分生子を回収す
る。ただし、この操作は省略してもよい。

【００２４】変異誘起処理後あるいは濃縮後の分生子か
らの非資化性変異株の選抜は、パラヒドロキシ安息香酸
の資化に伴うｐＨの上昇を指標にして行なう。すなわ
ち、パラヒドロキシ安息香酸と微量のマルトース等を炭
素源とし、ブロモ・クレゾール・パープル（ＢＣＰ）等
のｐＨインジケーターを混入した寒天平板培地に処理後
の分生子を塗布して培養し、パラヒドロキシ安息香酸の
資化によるｐＨの上昇に伴うｐＨインジケーターの色調
変化の認められないコロニーを釣菌する。こうして得ら
れたパラヒドロキシ安息香酸非資化性変異株群のなかに
目的とするパラヒドロキシ安息香酸蓄積株を高頻度で見
出すことができる。

【００２５】パラヒドロキシ安息香酸生成酵素生産性の
高い変異株の取得法 パラヒドロキシ安息香酸の生成に関与する酵素生産性の
高い変異株は、変異誘起処理後の分生子を栄養培地で発
芽させた後、安息香酸を唯一の炭素源とする培地を用い
て生育速度の速い株を繰り返し植え継いで濃縮する。濃
縮操作後の株を安息香酸を唯一の炭素源とするｐＨイン
ジケーターを含む寒天平板培地で培養し、親株よりも色
調変化の早いものを探すことにより目的とする酵素生産
性の高い変異株を得ることができる。

【００２５】これら人工突然変異によるパラヒドロキシ
安息香酸生産性に関する特性は、各々単一の特性を付し
ても効果があるが、これらを組合わせ複合した特性を有
する変異株を得ることによって著しい生産性の向上を図
ることが可能である。

【００２７】本発明の方法は、一般的に知られている遺
伝子操作の手法によって育種されるパラヒドロキシ安息
香酸高生産性株を用いて行なうこともできる。このよう
な遺伝子操作株は安息香酸からパラヒドロキシ安息香酸
の生成に係わる安息香酸 ４−ハイドロキシラーゼをコ
ードする遺伝子を菌体内に増殖することによって得るこ
とができる。

【００２８】

【微生物の培養】次に本発明の製造法における微生物の
培養について説明する。本発明において微生物の培養に
用いる培地の炭素源としては、パラヒドロキシ安息香酸
非資化性変異株を用いる場合を除いて、安息香酸を単独
で用いることができる。この時の培地への安息香酸の添
加濃度は１〜５ｇ／ｌ、好ましくは１〜２ｇ／ｌであ
る。５ｇ／ｌを上回る濃度では生育に阻害が見られる。

【００２９】炭素源としては、安息香酸に加えて他の炭
素源（補助炭素源）を用いることもできる。このような
炭素源としては菌株が資化し生育できる炭素化合物であ
ればいずれでも使用可能である。例えば、グルコースや
マルトース、シュクロースなどの糖類、マンニトールや
ソルビトール、グリセロールなどの還元糖類、可溶性デ
ンプン、ペプトン、肉エキス、ふすまなどの天然有機炭
素源を使用することもできる。さらに、これらの炭素源
は単独で、あるいは複数を組合せて、通常各々１０〜５
０ｇ／ｌ程度の濃度で添加される。補助炭素源を用いる
場合でも安息香酸の添加量は安息香酸を唯一の炭素源と
する場合と同様である。なお、補助炭素源を用いる場合
も、安息香酸を単独で用いる場合も、培養時の安息香酸
の資化速度に差は見られない。

【００３０】培養時には菌の増殖に伴い安息香酸からパ
ラヒドロキシ安息香酸が生成し蓄積するが、培養開始時
には安息香酸を低い濃度で添加し、培養終了以前に安息
香酸がすべて消費された場合には、途中からさらに前記
濃度範囲の安息香酸を添加してもよい。

【００３１】また、培養の増殖期には安息香酸を炭素源
として用いず、菌の生育が定常期に入った培養途中から
反応基質として安息香酸を添加することもできる。この
方法によれば、安息香酸およびパラヒドロキシ安息香酸
が菌体の増殖に使用されないため、安息香酸を増殖開始
時から添加する方法に比べ、パラヒドロキシ安息香酸の
収率が向上する。この場合においても、培養定常期まで
は炭素源として上記のいずれかのものを用いる。

【００３２】培養の窒素源としては、例えば、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩などの無機窒素
源、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用するこ
とができる。無機窒素源は0.1 〜１０ｇ／ｌ、有機窒素
源は１〜５０ｇ／ｌ程度の濃度で培地に添加される。

【００３３】さらに必要に応じて、リン酸二水素カリウ
ム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸
銅などの金属塩が菌の生育改善のために添加される。添
加濃度は培養条件によって異なるが、通常、リン酸塩に
おいては0.1 〜５ｇ／ｌ、マグネシウム塩においては0.
01〜0.1 ｇ／ｌ、他の化合物では0.1 〜５０ｍｇ／ｌの
範囲である。また、選択する培地によっては、ビタミン
の供給源として酵母エキスを0.1 〜0.5 ｇ／ｌ添加し
て、より生育速度を増大させ、安定した培養を行なうこ
とができる。

【００３４】培養は通常、好気的条件下、２５〜３２℃
の温度範囲、好ましくは２８〜３０℃の温度範囲で行わ
れる。ペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２株ある
いはアスペルギルス・フラビペスＳＤ８０３株を用いる
場合には、２０℃以下でも菌は生育するが、生育速度が
遅く好ましくない。また、３７℃以上の温度では菌は殆
ど生育しない。培養時間は培地組成、培養条件により異
なるが、通常１〜３日間で行なわれる。培養時のｐＨは
5.5 〜7.5 の範囲、好ましくは6.2 〜6.8 の範囲で行な
われる。５未満あるいは８以上のｐＨでは菌の生育が阻
害される。培地組成により培養中のｐＨは変動するが、
この場合には塩酸や硫酸、水酸化ナトリウムを逐次添加
して上記範囲内にｐＨを調整することが好ましい。

【００３５】本発明におけるパラヒドロキシ安息香酸の
製造は上記のごとく安息香酸を含む培地で培養した菌体
あるいは安息香酸を含まぬ培地で培養した菌体を培養液
から分離し、安息香酸を含む緩衝液等に再懸濁して反応
させる、いわゆるレスティング・セル・サスペンション
法によっても可能である。この方法によれば、液中に培
地成分や菌の代謝産物が少ないため、パラヒドロキシ安
息香酸の分離、精製が容易である。

【００３６】培養した菌体は遠心分離やろ紙によるろ過
などの方法によって集めることができる。これに、例え
ば、リン酸、酢酸などとその塩を混合した緩衝液または
水を加えて懸濁する。緩衝液の濃度は５０〜２００ｍＭ
程度で行なう。反応時の溶液のｐＨは6.0 〜6.5 の範
囲、好ましくは6.2 〜6.4 の範囲で行なう。菌体懸濁液
に加える基質安息香酸の濃度は0.5 〜5.0 ｇ／ｌ、好ま
しくは1.0〜2.0 ｇ／ｌの濃度で行なう。反応は好気的
条件下、反応温度は１７〜３２℃、好ましくは２０〜３
０℃の範囲で行なう。用いた緩衝液の濃度、種類によっ
ては反応中にｐＨが変動するが、培養時と同様にしてｐ
Ｈを調整しながら行なうことが望ましい。

【００３７】培養液または反応液からのパラヒドロキシ
安息香酸の分離、精製は培養液への酸の添加によるパラ
ヒドロキシ安息香酸の析出によって行なう。培養液また
は反応液への酸の添加量は、パラヒドロキシ安息香酸の
蓄積量が２ｇ／ｌ未満のときは蓄積量の２当量、パラヒ
ドロキシ安息香酸の蓄積量が２ｇ／ｌ以上のときは蓄積
量の１当量が望ましい。添加する酸の種類は任意である
が、塩酸または硫酸が好ましい。

【００３８】析出操作後沈殿したパラヒドロキシ安息香
酸は遠心、ろ過等の操作により集めることができる。さ
らにこの粗結晶を水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶液
に溶解し、それに酸を加えることにより再沈殿させ、純
度の高いパラヒドロキシ安息香酸を得ることができる。

【００３９】なお、本発明の製造法においてはパラヒド
ロキシ安息香酸の検出および定量は、例えば、高速液体
クロマトグラフィーによって行なわれる。すなわち、オ
クタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを
固定相に用い、水とメタノール、あるいは水とアセトニ
トリルの混合物にリン酸等の酸を添加したものを移動相
とする一般的な逆相クロマトグラフィーによって分析が
可能である。検出は紫外部分光検出器によって波長２５
０ｎｍ付近で行なう。

【００４０】

【実施例】以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的
な説明を行なうが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。

【００４１】実施例１ 表１の培地に示す組成の培地を調製し、綿栓付き５０
０ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌ入れ、１２０℃
（１ｋｇｆ／ｃｍ² ）にて２０分間オートクレーブ滅菌
を行なった。これにあらかじめ同培地で２８℃で１日間
前培養したペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２株
を１０ｍｌ分植菌し、２８℃で１日間振盪培養した。

【００４２】培養終了後、綿ろ過して菌体を除去した培
養液の一部を下記に示す条件で高速液体クロマトグラフ
ィーにより分析した結果、標品パラヒドロキシ安息香酸
と一致するピークが認められた。 カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＲＳ−ｐａｋ ＤＳ−６１３
（昭和電工（株）製） 移動相：水：アセトニトリル（３０：７０）、５０ｍＭ
リン酸 送液 ：１ｍｌ／ｍｉｎ． カラム温度：４０℃ 検出方法：ＵＶ吸収波長２５４ｎｍ

【００４３】さらに、５ｍｌの培養液に２Ｎ塩酸0.2 ｍ
ｌを加えた後、酢酸エチル２ｍｌで有機溶媒可溶成分を
抽出し、その一部をＧＣマススペクトログラフィーによ
り分析した結果、メインピークの１つについて分子量１
３８の分子イオンピークが認められ、その分解パターン
は標品パラヒドロキシ安息香酸と完全に一致した。以上
の分析結果より生成したパラヒドロキシ安息香酸濃度は
0.05ｍｇ／ｍｌと計算された。

【００４４】実施例２ アスペルギルス・フラビペスＳＤ８０３株について実施
例１と全く同様に培養と分析とを行なったところ、培養
液中に標品パラヒドロキシ安息香酸と一致するピークが
みられ、培養液抽出物の一部をＧＣマススペクトルグラ
フィーにより分析した結果、メインのピークに分子量１
３８の分子イオンピークが認められ、その分解パターン
は標品パラヒドロキシ安息香酸と完全に一致した。培養
液中に生成したパラヒドロキシ安息香酸濃度は0.03ｍｇ
／ｍｌと計算された。

【００４５】実施例３ 表１の培地に示す組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ
容の三角フラスコに入れ、１２０℃（１ｋｇｆ／ｃ
ｍ² ）にて２０分間オートクレーブ滅菌を行なった。こ
れに予め同培地で２８℃で１日間前培養しておいたペニ
シリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２株を１０ｍｌ分植
菌し、２８℃で１日間振盪培養した。培養終了後、実施
例１と同様にして培養液を高速液体クロマトグラフィー
により分析した結果、培養液中に生成したパラヒドロキ
シ安息香酸濃度は0.09ｍｇ／ｍｌであった。

【００４６】実施例４ アスペルギルス・フラビペスＳＤ８０３株について実施
例３と全く同様に培養したところ、培養液中に蓄積した
パラヒドロキシ安息香酸量は0.08ｍｇ／ｍｌであった。

【００４７】実施例５ 表１の培地に示す組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ
容の三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分間オートク
レーブ滅菌を行なった。これに予め同培地で２８℃で１
日間前培養しておいたペニシリウム・ジャンシネルムＳ
Ｄ８０２株を１０ｍｌ分植菌し、２８℃で１日間振盪培
養した。この培養液から菌体をろ紙を用いてろ集し、ｐ
Ｈ6.4 に調製した１００ｍＭリン酸緩衝液５０ｍｌに懸
濁した。これを５００ｍｌの三角フラスコに移した後、
５０ｍｇの安息香酸を添加して、綿栓をして２５℃で８
時間振盪した。反応液の一部を実施例１と同様にして高
速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、反応液
中に生成したパラヒドロキシ安息香酸濃度は0.12ｍｇ／
ｍｌであった。

【００４８】実施例６ 実施例５と同様の反応をアスペルギルス・フラビペスＳ
Ｄ８０３株について行なったところ、反応液中に生成し
たパラヒドロキシ安息香酸濃度は0.10ｍｇ／ｍｌであっ
た。

【００４９】実施例７ 表１の培地の組成において安息香酸を欠いた培地を調
製し、このもの１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラス
コに入れ、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行
なった。これに予め同培地で２８℃で１日間前培養した
ペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２株１０ｍｌ分
を植菌し、２８℃で１日間振盪培養した。この培養液か
ら菌体をろ紙を用いてろ集し、ｐＨ6.4 に調製した１０
０ｍＭリン酸緩衝液５０ｍｌに懸濁した。これを５００
ｍｌの三角フラスコに移した後、５０ｍｇの安息香酸を
添加して、綿栓をして２５℃で１２時間振盪した。反応
液の一部を実施例１と同様にして高速液体クロマトグラ
フィーにより分析した結果、反応液中に生成したパラヒ
ドロキシ安息香酸濃度は0.12ｍｇ／ｍｌであった。

【００５０】実施例８ 実施例７と全く同様の反応をアスペルギルス・フラビペ
スＳＤ８０３株について行なったところ、反応液中に生
成したパラヒドロキシ安息香酸濃度は0.10ｍｇ／ｍｌで
あった。

【００５１】実施例９ 表１の培地２リットルを５リットル容の小型ジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃、２０分間オートクレー
ブ滅菌を行なった。これに予め同培地で２８℃で１日間
前培養しておいたペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８
０２株２００ｍｌ分を植菌し、２８℃で２日間通気撹拌
培養した。培養中、培養液の一部を実施例１と同様にし
て高速液体クロマトグラフィーにより分析して、安息香
酸濃度が１〜２ｇ／ｌの範囲を保つように安息香酸を追
加添加した。ｐＨは６〜７の範囲になるよう６Ｎ塩酸を
用いて調整した。また、培養２４時間目に、麦芽エキス
２０ｇ、マルトース４０ｇ、リン酸二水素カリウム８
ｇ、硫酸アンモニウム６ｇを各々培養液に添加した。培
養液中に生成したパラヒドロキシ安息香酸量は培養開始
後３５時間に最高に達し、この時の蓄積量は1.78ｇ／ｌ
であった。この時までに追加添加された安息香酸は18.0
ｇ／ｌであった。

【００５２】実施例１０ 表１の培地２リットルを５リットル容の小型ジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃、２０分間オートクレー
ブ滅菌を行なった。これに予め同培地で２８℃で１日間
前培養しておいたペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８
０２株２００ｍｌ分を植菌し、２８℃で１日間培養し
た。この培養液から菌体をろ紙を用いてろ集し、ｐＨ6.
4 に調整した１００ｍＭリン酸緩衝液１リットルに懸濁
した。これを小型ジャーファーメンターに移した後、２
ｇの安息香酸を添加して、２５℃で反応させた。反応
中、反応液の一部を実施例１と同様にして高速液体クロ
マトグラフィーにより分析し、安息香酸濃度が１〜２ｇ
／ｌの範囲を保つよう安息香酸を追加添加した。ｐＨは
６〜７の範囲になるよう６Ｎ塩酸を用いて調整した。培
養液中に生成したパラヒドロキシ安息香酸は反応開始後
２４時間に最高に達し、この時の蓄積量は0.40ｇ／ｌで
あった。このときまでに追加添加された安息香酸は3.0
ｇ／ｌであった。

【００５３】実施例１１ ペニシリウム・ジャンシネルムＳＤ８０２株をポテト・
デキストロース寒天平板培地で培養して形成させた分生
子を、平板培地上に滅菌水１０ｍｌを加えコンラージ棒
で撹拌して懸濁させて回収した。この分生子懸濁液を遠
心分離して分生子を集めてｐＨ6.2 のリン酸緩衝液１ｍ
ｌに再懸濁した。これに変異誘起剤として濃度2.25ｍｇ
／ｍｌとなるようにＮＴＧを添加し、２５℃で４０分間
振盪した。

【００５４】変異誘起処理した分生子を遠心分離とリン
酸緩衝液への懸濁の繰り返しによって洗浄後、１ｇ／ｌ
のパラヒドロキシ安息香酸を含む表１に示す培地に移
し、２８℃で４８時間振盪培養した。培養終了後、発芽
生育した菌を滅菌したナイロンメッシュ・フィルターで
ろ過して除去し、ろ液を生理食塩水で適宜希釈して表１
の培地に２０ｇ／ｌの寒天を加えて平板培地としたも
のにプレーティングし、２８℃で３日間培養した。

【００５５】この平板培地に生じたコロニーのうち５０
コロニーを釣菌し、５０ｐｐｍのＢＣＰを含む表１に示
す培地の寒天平板培地に植え継いだ。２８℃で３日間
培養したところコロニー周辺の培地のｐＨインジケータ
ーの変色が見られないものが８株あった。この８株を各
々培地５ｍｌに植菌し、２８℃で２日間培養したとこ
ろ、８株中５株は生育しなかった。この５株を各々培地
５ｍｌに植菌し、２８℃で２日間培養した。培養終了
後各々の培養液の一部を実施例１と同様にして高速液体
クロマトグラフィーにより分析した結果、５株のうち１
株で生成したパラヒドロキシ安息香酸が著量蓄積してい
ることがわかった。この株はパラヒドロキシ安息香酸分
解酵素を欠損したパラヒドロキシ安息香酸非資化性変異
株であると判断された。この株が上記培養液中に生成し
たパラヒドロキシ安息香酸の濃度は0.95ｍｇ／ｍｌであ
った。

【００５６】

【表１】

【００５７】

【発明の効果】本発明によればペニシリウム属あるいは
アスペルギルス属に属し、安息香酸を酸化してパラヒド
ロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物を使用し
てパラヒドロキシ安息香酸を緩和な条件で効率よく製造
することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 続木 敏 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電工 株式会社生化学研究所内 (72)発明者 堀内 等希夫 東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電工 株式会社生化学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 安息香酸を酸化してパラヒドロキシ安息
   香酸を生成する能力を有する微生物を安息香酸を含有す
   る培地中で培養し、培養液中にパラヒドロキシ安息香酸
   を蓄積せしめこれを採取することを特徴とするパラヒド
   ロキシ安息香酸の製造法。
2. 【請求項２】 安息香酸を酸化してパラヒドロキシ安息
   香酸を生成する能力を有する微生物を培養し、得られた
   菌体を安息香酸を含有する溶液に懸濁して反応させて液
   中にパラヒロドキシ安息香酸を蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とするパラヒドロキシ安息香酸の製造
   法。
3. 【請求項３】 ペニシリウム(Penicillium) 属またはア
   スペルギルス(Aspergillus) 属に属する微生物を使用す
   る請求項１または２に記載のパラヒドロキシ安息香酸の
   製造法。
4. 【請求項４】 パラヒドロキシ安息香酸を生成する能力
   を有するペニシリウム・ジャンシネルム(Penicillium j
   anthinellum ）ＳＤ８０２株。
5. 【請求項５】 パラヒドロキシ安息香酸を生成する能力
   を有するアスペルギルス・フラビペス(Aspergillus fla
   vipes ）ＳＤ８０３株。