JP2933451B2

JP2933451B2 - 新規微生物および新規微生物による赤色色素の生産方法

Info

Publication number: JP2933451B2
Application number: JP26606692A
Authority: JP
Inventors: 俊之助阿部; 仁小笠原
Original assignee: KARUSONITSUKU KK
Current assignee: KARUSONITSUKU KK
Priority date: 1992-10-05
Filing date: 1992-10-05
Publication date: 1999-08-16
Anticipated expiration: 2014-08-16
Also published as: JPH06113824A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規微生物および該微
生物による新規な赤色色素の生産方法に関するものであ
る。詳しく述べると、本発明は、ノカルディオイデス(N
ocardioides)属に属する新規な微生物および上記微生物
の培養物より単離、精製することにより得られる新規な
赤色色素の生産方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】１８３５年にエル・シー・マークアント
(L.C.Marquant) が初めてヤグルマギクの色素であるア
ントシアニンの純化、構造決定を行ってから現在まで、
微生物起源のフラボノイド化合物は数種類しか発見され
ておらず、ほとんどがキノノイド、カロチノイドおよび
クロロフィルである。

【０００３】系統的な進化過程において、フェニルアラ
ニンやチロシンからフラボノイド化合物への２次代謝経
路は、菌類から高等植物へと進化した後に獲得されたも
のとされていることもあり、アントシアニンはおろかフ
ラボノイドに相当するものでなく、従来の培養法を用い
て生成でき、容易に単離、精製することができるような
新規な微生物および該微生物の培養物より得られる新規
な赤色色素の生産方法は知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、新規な赤色色素を産生する新規な微生物を提供
することである。

【０００５】また、本発明の他の目的は、上記微生物の
培養物より単離、精製することにより生成される新規な
赤色色素の生産方法を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、基生菌糸
上および基生菌糸間に紫色ないし赤色色素を産生するノ
カルディオイデス・エスピー・Ｒ−００１株(Nocardioi
des sp. R-001) ＦＥＲＭＰ−１５３８５によって達
成される。

【０００７】また、上記諸目的は、ノカルディオイデス
(Nocardioides)属に属しかつ基生菌糸上および基生菌糸
間に紫色ないし赤色色素を産生する微生物の培養物より
精製する紫色ないし赤色色素の生産方法によっても達成
される。

【０００８】

【作用】本発明の微生物は、本発明者らが愛媛県松山市
内（愛媛大学農学部構内）の表層土壌より、ＹＥＰＧ寒
天培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２
％、寒天２％）を用いた培地で培養し、形成されたコロ
ニーを分離することにより取得したものである。

【０００９】また、本発明の微生物について、バージェ
ーズ・マニュアル・オブ・ディターミネイティブ・バク
テリオロジー(Bergey's Manual of Determinative Bact
eriology) に記載の方法に基づいて菌学的試験を行った
ところ、本発明の微生物は、ノカルディオイデス(Nocar
dioides)属に属することがわかり、本発明の微生物をノ
カルディオイデス・エスピー・Ｒ−００１株 (Nocardio
ides sp. R-001) （以下、Ｒ−００１株と称する）と命
名した。また、Ｒ−００１株は、平成８年１月９日付に
て工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、その
受託番号は、ＦＥＲＭＰ−１５３８５［平成４年２月
２０日付にて工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れた受託番号微工研菌寄第１２７８４号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２７８４）］である。

【００１０】以下、本発明の微生物Ｒ−００１株の菌学
的性質を示す。

【００１１】（１）形態 a) 胞子形成菌糸の分枝法単純分枝（胞子形成は菌糸
の分裂のみで、菌糸の分枝法に準じる） b) 胞子形成菌糸の形態基生菌糸並びに気中菌糸の
断裂による胞子形成のみ c) 胞子の数１０以上 d) 胞子の表面構造滑らか e) 胞子の大きさ１．０〜１．２μｍ×０．
８〜１．０μｍ f) 鞭毛胞子の有無無 g) 胞子嚢の有無無 h) 胞子柄の着生位置胞子柄なし i) 菌糸の分裂状態寒天培地上で接種後３から
７日で気中菌糸並びに基生菌糸がほぼ完全に分裂する j) 菌核形成性無（２）培地における生育状態（括弧内はそれぞれの生育
の状態を表わす） a)シュークロース・コロニーの生育が悪い（±）硝酸塩寒天培地基生菌糸の生育も悪い（±）集落表面は、白色を呈する b)グルコース・コロニーの生育が悪い（±）アスパラギン寒天培地基生菌糸の生育も悪い（±）集落表面は、白色を呈する c)グリセリン・コロニーの生育は良い（＋
＋）アスパラギン寒天培地基生菌糸は、生育に伴い赤みを
呈する（＋＋）集落表面は、白色を呈する d)スターチ寒天培地コロニーの生育は非常に良い
（＋＋＋）基生菌糸は、赤紫色を呈し、生育に伴い濃くなる（＋＋
＋）集落表面は、粉っぽいグレーを呈する e)チロシン寒天培地コロニーの生育は非常に良い
（＋＋＋）基生菌糸は、赤紫色を呈し、生育に伴い濃くなる（＋＋
＋）集落表面は、粉っぽいグレーを呈する f)栄養寒天培地コロニーの生育は良い（＋
＋）基生菌糸は、白色を呈し、生育に伴い卵色になる（＋
＋）集落表面は、白色を呈する g)イースト・コロニーは生育する（＋）麦芽寒天培地基生菌糸は、クリーム色を呈
し、生育に伴い白色になる（＋）集落表面は、白色を呈する h)オートミール寒天培地コロニーの生育は良い（＋
＋）基生菌糸は、淡い赤色を呈し、生育に伴い紫色になる
（＋＋）集落表面は、グレー色を呈する（３）生理学的性質 a)生育温度範囲１０〜３５℃ 最適生育温度は２６℃ ４℃以下及び３７℃以上では生育しない３０℃以上では気菌糸が形成されにくい b)ゼラチンの液化グルコース・ペプトン
ゼラチン培地上で、ゼラチンを液化する c)スターチの加水分解スターチ寒天培地上で
スターチを加水分解する d)脱脂牛乳の凝固、ペプトン化脱脂牛乳を凝固し、次
いでペプトン化する e)メラニン様色素の生成メラニン様色素を生成
しない（４）プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上での炭素源の
同化性（下記糖を各々１％加えて行った） a)Ｌ−アラビノース同化しない（−） b)Ｄ−キシロース同化する（＋） c)Ｄ−グルコース同化する（＋＋＋） d)Ｄ−フラクトース同化する（＋） e)シュクロース同化しない（−） f)イノシトール多少同化する（±） g)Ｌ−ラムノ−ス多少同化する（±） h)ラフィノース同化しない（−） i)Ｄ−マンニット同化する（＋＋）本菌の培養に使用する培地は、固体または液体のいずれ
でも良く、本菌が資化しうる炭素源を含有していること
を要し、さらに適量の窒素源および無機塩などを含有す
る培地であれば、合成培地および天然培地のいずれでも
よい。

【００１２】炭素源としては、本菌が資化しうるもので
あれば特に制限はないが、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ガラクト−ス、Ｄ−マンノ
ース、マルトース、サリシン、スターチ、グリセリン等
の糖質原料、ペプトン、肉エキス等の天然物などが使用
できる。

【００１３】また、本菌は、基生菌糸上および基生菌糸
間に多量の紫色ないし赤色色素を産生する。本菌は、グ
ルコース・硝酸塩寒天培地、ベネット寒天培地、プリド
ハム・ゴドリーブ寒天培地では濃い紫色の色素を、イー
スト寒天培地、鉄寒天培地、およびペプトン・イースト
・鉄寒天培地を除く他の培地では赤紫色の色素を産生す
る。ただし、イースト寒天培地、鉄寒天培地、およびペ
プトン・イースト・鉄寒天培地では色素を産生しにく
く、基生菌糸は白色から黄土色を呈する。イースト寒天
培地においては培地に微量塩液（例えば、プリドハム・
ゴドリーブの微量塩液）を加えるか、若しくは水道水を
用いるかすると、赤色から赤紫色の色素を産生する。気
菌糸は、黄色がかった白色から淡い灰色を呈しており、
どの培地でも生育が非常に良いが、可溶性色素は生産さ
れない。しかし、寒天培地が古くなると、この寒天培地
中に赤色色素が拡散していく。また、気菌糸を形成する
前のコロニーは表面にしわが入り、光沢があまりない。

【００１４】培養は、好気的条件下で行われ、培養に適
当な温度は、１０から３５℃であるが、２６℃付近で培
養することが望ましい。また、培養に適当な培地のｐＨ
は、３から９であるが、好ましくは６から７．５であ
る。

【００１５】本発明微生物が産生する新規な赤色色素
は、以下に示す理化学的性質を示す。

【００１６】（１）元素分析（Ｃ₆₈Ｈ₇₀Ｏ₂₉Ｎ）_n （２）分子量１３６４の整数倍（３）融点３６０℃〜４００℃ （４）紫外線吸収スペクトル図１に示す（５）赤外線吸収スペクトル図２に示す（６）プロトンＮＭＲ図３に示す（７）溶剤に対する溶解性ピリジン、ジメチルス
ルホキシド、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサ
ンに易溶ｎ−ヘキサン、ベンゼン、エーテル、メタノール、酸に
不溶薄いアルカリ水溶液、クロロホルムにわずかに溶解（８）呈色反応アルミニウムイオンに
より赤紫色を呈する（深色シフトを起こす）（９）物質の色赤色結晶性物質さらに、本発明微生物の産生する赤色色素の抽出および
精製方法は以下の通りである。本菌Ｒ−００１株を、グ
ルコースを２％添加したＹＭ培地（０〜２％イーストエ
キス、０．５〜２％麦芽エキス、０〜５％グルコースを
水道水を用いて調製するか、微量塩液を加える）に接種
し、２６℃で振盪培養する。この際、必要であれば、同
培地で本菌Ｒ−００１株による前培養を行い、その一部
または全部を本培養の培養液に接種する。これを９６〜
１２０時間培養後、培養液全体に０．０５〜０．５％ア
スコルビン酸を加え、さらに濃塩酸を１／１５〜１／１
０容加える。次に、培養液１リットル当たり４００ｍｌ
の０．０１〜０．１％のｔ−ブチルキノンを含むテトラ
ヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた後、食塩飽和にしてＴ
ＨＦ層を分離する。分離したＴＨＦ層を遠心（１０００
ｇ、５分）して、その上清を集め、ロータリーエバポレ
ーターで蒸留濃縮する。さらに、濃縮した液に２〜１０
倍容の水を加え、粗色素を沈殿させる。この沈殿物を遠
心（１０００ｇ、１０分）により集め、蒸留水で洗浄
後、アセトンに溶解する。この溶液に１０〜２０倍容の
蒸留水を加えることによって、色素を沈殿させ、この沈
殿物を遠心（１０００ｇ、１０分）により集めた後、水
洗する。さらに、この沈殿物をｎ−ヘキサン、次いでエ
−テルに懸濁し、遠心（１０００ｇ、５分）により洗浄
する。このようにして洗浄した沈殿物を減圧下にて乾燥
後、少量のアセトンに溶解した後、ｎ−ヘキサンを少し
ずつ加えることにより色素を沈殿させ、この沈殿物をｎ
−ヘキサンで十分洗浄した後、減圧下にて乾燥する。こ
のようにして、培養液より粗色素が得られる。

【００１７】次に、この粗色素を真空下または５酸化リ
ンデシケーター中で十分乾燥した後、少量のアセトンに
溶解し、ワコーゲルＣ−２００カラムにかけ、ジオキサ
ン、水、塩酸（１００：５：０．７）の水溶液で展開
し、赤色の最も強い画分を集めて蒸留乾固する。さら
に、乾固したものをｎ−ヘキサンで洗浄した後、アセト
ンに転溶し、蒸留水を少しずつ加えることによって、結
晶を析出させる。析出した結晶をさらに水洗した後、遠
心（１０００ｇ、５分）または濾過により集め、減圧乾
燥後、アセトンに再度溶解する。さらに、上記溶液にｎ
−ヘキサンを少しずつ加えて結晶を析出させる。この結
晶を集め、ｎ−ヘキサンで洗浄した後、恒量になるまで
真空乾燥し、精製色素標品を得る。

【００１８】なお、本菌株より産生される赤色色素の収
量は、分光光度計により５１０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより、以下の値を元にして算定される。精製色素
標品は、８０ｕｇ／ｍｌジオキサン溶液で１０Ｄ₅₁₀の
吸収を持ち、粗標品は、１５０〜２００ｕｇ／ｍｌジオ
キサン溶液当たり１０Ｄ₅₁₀の吸収を持つ。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を示しながら、本発明をさらに
詳細にかつ具体的に説明するが、本発明はこれらの例に
限定されるものではない。

【００２０】実施例１ノカルディオイデス・エスピー・Ｒ−００１株 (Nocard
ioides sp. R-001) の気菌糸１〜２白金耳をスラントか
らかきとり、１０ｍｌのグルコースを２％添加したＹＭ
培地（０．５％イーストエキス、１％麦芽エキス、２％
グルコースを水道水を用いて調製するか、プリドハム・
ゴドリーブの微量塩液を加える）に接種し、２６℃で４
８時間振盪培養する。培養後、培養液０．５ｍｌを３５
０ｍｌの上記と同様のＹＭ培地を入れた振盪フラスコに
接種し、本培養した。この本培養における菌量をＯＤ８
００ｎｍで測定した。

【００２１】この際の成長曲線を図４に示す。

【００２２】図４に示されるように、Ｒ−００１株は、
６〜４８時間の間に活発な生長が認められ、以後はほぼ
定常となる。

【００２３】実施例２実施例１と同様にして、ノカルディオイデス・エスピー
・Ｒ−００１株 (Nocardioides sp. R-001) の培養液１
リットルを９６〜１２０時間培養後、培養液全体に０．
１％アスコルビン酸を加え、さらに濃塩酸を０．０８容
加える。次に、この培養液に４００ｍｌの０．０３％の
ｔ−ブチルキノンを含むＴＨＦを加えた後、食塩飽和に
してＴＨＦ層を分離する。分離したＴＨＦ層を遠心（１
０００ｇ、５分）して、その上清を集め、ロータリーエ
バポレーターで蒸留濃縮する。さらに、濃縮した液に１
０倍容の水を加え、粗色素を沈殿させる。この沈殿物を
遠心（１０００ｇ、１０分）により集め、蒸留水で洗浄
後、アセトンに溶解する。この溶液に１０倍容の蒸留水
を加えることによって、色素を沈殿させ、沈殿物を遠心
（１０００ｇ、１０分）により集めた後、水洗する。さ
らに、この沈殿物をｎ−ヘキサン、次いでエ−テルに懸
濁し、遠心（１０００ｇ、５分）により洗浄する。さら
に、洗浄した沈殿物を減圧下にて乾燥後、少量のアセト
ンに溶解した後、ｎ−ヘキサンを少しずつ加えることに
より色素を沈殿させ、この沈殿物をｎ−ヘキサンで十分
洗浄した後、減圧下にて乾燥する。上記工程によって、
１リットルの培養液当たり０．２〜０．３ｇの粗色素が
得られる。

【００２４】次に、この粗色素を真空下または５酸化リ
ンデシケーター中で十分乾燥した後、少量のアセトンに
溶解し、ワコーゲルＣ−２００カラムにかけ、ジオキサ
ン、水、塩酸（１００：５：１）の水溶液で展開し、赤
色の最も強い画分を集めて蒸留乾固する。さらに、乾固
したものをｎ−ヘキサンで洗浄した後、アセトンに転溶
し、蒸留水を少しずつ加えることによって、結晶を析出
させる。析出した結晶をさらに水洗した後、遠心または
濾過により集め、減圧乾燥後、アセトンに再度溶解す
る。さらに、ｎ−ヘキサンを少しずつ加えて結晶を析出
させる。この結晶を集め、ｎ−ヘキサンで洗浄した後、
恒量になるまで真空乾燥し、精製色素標品を得る。この
際の精製色素収量は、培養液１リットル当たり８０ｍｇ
程度である。

【００２５】なお、本菌株より産生される赤色色素の収
量は、上記作用に記載した方法と同様にして測定され
る。

【００２６】この際の色素の生産を図５および図６に示
す。図５および６において、横軸は培養時間を示し、縦
軸は色素生産量を示す。なお、図５において、白抜きお
よび黒塗りの三角は、菌体中に含まれる色素量を示し、
白抜きおよび黒塗りの丸は、培地上清中に含まれる色素
量を示す。また、図６は、図５に示した菌体中および培
地上清中に含まれる色素量の合計を示す。

【００２７】図５、６に示されるように、色素の生産
は、培地上清中および菌体画分中ともに、２４時間以降
に始まり、培地上清中の色素量は、７２〜１６８時間で
ほぼ一定となる。また、菌体画分中の色素量は、４８時
間以降急増し、７２〜９６時間で最大に達し、以降はほ
とんど増加しない。

【００２８】また、色素の全量は、９６〜１２０時間で
最大に達する。

【００２９】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によるノカル
ディオイデス属 (Nocardioides) に属する微生物は新規
な微生物であり、さらに本発明による微生物の培養物を
単離、精製することによって新規な赤色色素を得ること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】は、本発明による微生物が産生する赤色色素の
紫外線吸収スペクトルを示す。

【図２】は、本発明による微生物が産生する赤色色素の
赤外線吸収スペクトルを示す。

【図３】は、本発明による微生物が産生する赤色色素の
プロトンＮＭＲを示す。

【図４】は、本発明による微生物の生長曲線を示すグラ
フである。

【図５】は、本発明による微生物が産生する赤色色素量
を示すグラフである。

【図６】は、本発明による微生物が産生する赤色色素量
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】基生菌糸上および基生菌糸間に紫色ない
し赤色色素を産生するノカルディオイデス・エスピー・
Ｒ−００１株(Nocardioides sp. R-001)ＦＥＲＭＰ−
１５３８５。
【請求項２】ノカルディオイデス(Nocardioides)属に
属しかつ基生菌糸上および基生菌糸間に紫色ないし赤色
色素を産生する微生物の培養物より精製する紫色ないし
赤色色素の生産方法。