KR950005548B1

KR950005548B1 - 항생물질 gtx-01 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR950005548B1
Application number: KR1019910017517A
Authority: KR
Inventors: 김시관; 김상석; 이광승; 유광근
Original assignee: 재단법인한국인삼연초연구소; 유광근
Priority date: 1991-10-07
Filing date: 1991-10-07
Publication date: 1995-05-25
Also published as: KR930008151A

Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 GTX-01 및 그 제조방법

제1도는 GTX-01의 자외부 흡수 스펙트럼을 보인 그래프이고,

제2도는 GTX-01의 자외선 흡수 스펙트럼을 보인 그래프이며,

제3도는 GTX-01의 핵자기공명 스펙트럼을 보인 그래프이다.

본 발명은 항생물질 GTX-01 및 그 제조법에 관한 것이다. 본 발명의 GTX-01은 스트랩토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 항생물질 GTX-01의 생산균을 배양하여 그 배양물로 부터 분리 채취된 신규한 항생물질이다.

항생물질은 의약용은 물론, 농약용으로도 이용하는 것들이 현재까지 다수 발견되어 있다. 본 발명자들은 종래부터 상기와 같이 유용한 항생물질의 탐색을 목적으로 하여 국내는 물론 세계 각지에서 채취한 토양으로부터 미생물을 분리, 그 미생물이 생산하는 항생물질에 대하여 정제, 동정 및 용도의 개발을 수행하여 왔다.

그 결과, 스트랩토마이세스 속에 속하는 미생물의 배양물로 부터 아직까지 알려져 있지 않은 신규 항생물질이 생산, 축적되는 사실을 확인하고 그 물질을 단리 정제 하는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 새로운 항생물질 및 그 항생물질을 방선균 스트랩토마이세스 속에 속하는 미생물로 부터 분리, 획득하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

[사용한 미생물]

본 발명에서 사용한 미생물은 항생물질 GTX-01 생산능을 가진 스트랩토마이세스 속에 속하는 균종이다. 본 발명에 사용되는 미생물중의 하나인 스트랩토마이세스 균주번호 90-GT-129(이하 90-GT-129균주라 칭함)라 불리우는 미생물의 상기의 특성을 가진 본 발명의 항생물질 GTX-01을 유리하게 생산하는 균으로서 본 발명에 유효하게 이용된다.

본 발명에 의하면 상기 90-GT-129 균주의 자연적 및 인공적변이주는 물론, 스트랩토마이세스 속에 속하는 균종으로서 후술의 항생물질 GTX-01의 생산능을 가진 미생물은 전부 본 발명 방법에 있어 사용할 수 있다.

상기 90-GT-129 균주는 본 발명자에 의해 충남 금산군에서 채취한 토양으로 부터 발견된 토양방선균으로서, 한국유전공학연구소에 1991년 5월 13일로 미생물 기탁번호 KCTC 0011BP로 기탁되어 있다. 상기 90-GT-129 균주는 다음과 같은 균학적 특성을 가진다.

1. 형태적 특성

본 균주는 충남 금산군에서 채취한 토양으로 부터 분리되었으며 본 균주는 균체 염산 가수분해물에 의한 세포벽 구성성분, 디아미노피멜릭산은 LL-이성체인 것으로 나타났다. 본 균주는 한천배지상에서 배양할 때 나선형의 기균사를 풍부하게 가진 긴 포자쇄를 형성한다. 포자는 타원형에 가까운 형태를 하고 있으며 표면은 활면(Smooth type) 이었다. 멜라노이드색소를 생성하며, 잔틴과 전분을 이용하고 탈지유는 응고 시키거나 팹톤화 시키지 못하였고 질산을 환원시키지 못하며 젤라틴을 액화 시키나 섬유소는 분해하지 못하였다. 이상의 결과로 부터 본 균주는 스트랩토마이세스 속에 속한다는 사실을 알 수 있었다.

2. 각종 한천배지상에서의 생육특성

각종 한천배지상에서 27℃ 3주간 배양 하였을때 본 균주의 생육 특성은 표 1과 같다. 색깔의 판정은 미상 무성 표준국의 아이세스시시-엔비에스 센트로이드 칼라 챠트(ISCC-NBS Centroid Color Charts)에 근거를 두었다.

[표 1]

[90-GT-129 균주의 생육특성]

3. 탄소원의 이용

탄소원 이용

L-아라비노스 ＋

락토스 ＋

D-자일로스 ＋

D -글루코스 ＋

D-푸락토스 ＋

D-슈크로스 ＋

이노시톨 －

L-람노스 ＋

라피노스 －

D-만니톨 ＋

D-갈락토스 ＋

＋ : 생육함 － : 생육못함

이상의 성질을 가진 90-GT-129균주는 스트랩토마이세스 로체이(Streptomyces rochei) 그룹에 가장 가깝다는 사실을 알 수 있었다. 스트랩토마이세스 로체이 근연종 그룹에는 지금까지 인터내셔널 스트랩토마이세스 프로젝트(International Streptomyces Project)에 26균주가 보고되어 있다. 이들 균주중 멜라닌 색소를 형성하는 것은 스트랩토마이세스 인디고페러스(ISP 5124)와 스트랩토마이세스 그리세오마이시니(ISP 5159)뿐이다. 그러나 스트랩토마이세스 인디코페러스는 타이로신 한천배지에서 멜라닌 색소를 생성하지 못하는 반면 90-GT-129 균주는 생성 하였다. 또한 스트랩토마이세스 그리세오마이시니는 기균사의 색깔이 녹색계열이므로 본 균주와 다르다는 것을 알 수 있었다. 더욱이 이 두 균주의 탄소원 이용성은 90-GT-129 균주의 특성과는 매우 상이 하였다.

따라서 본 균주는 인터내셔널 스트랩토마이세스 프로젝트 방법, 버기스 매뉴얼 오브 시스티매틱 박테이올로지 1989. 4권의 방선균 동정법에 스트랩토마이세스 로체이 근연종에 속하는 새로운 종으로 동정 하였다.

이상 90-GT-129 균주의 특성에 관하여 기술하였으나 방선균의 제 성질은 항상 일정한 것이 아니라 자연적 인공적으로도 용이하게 변화할 수 있다는 것이 주지의 사실이다. 따라서 본 발명에서는 스트랩토마이세스 속에 속하며 항생물질 GTX-01을 생산하는 모든 균주를 사용할 수 있다.

본 발명의 항생물질 GTX-01을 얻기 위하여는 스트랩토마이세스 속에 속하는 상기 항생물질 생산균을 항생물질을 생산하는 통상의 방법으로 배양하면 된다. 배양의 형태는, 액체 배양이든 고체 배양이든 상관 없으나 액체 진탕 배양을 하는 것이 바람직하며 공업적으로 유리하게 배양하기 위하여는 본 생산균의 포자현탁액 혹은 배양액을 액체 배지에 접종시켜 통기교반 배양을 행하는 것이 좋다.

배지의 영양원으로서는 특히 한정된 것을 사용하는 것이 아니라, 미생물의 배양에 통상 이용되는 탄소원, 질소원 등을 배지중에 첨가한다. 탄소원으로서는 전분, 덱스트린, 글리세린, 글루코스, 슈크로스, 갈락토스, 면실유, 대두유, 만니톨 등이, 질소원 으로서는 팹톤, 대두분, 육엑키스, 쌀겨, 말토스, 낙화성분, 면실분, 어분, 콘스티브리퀴, 이스트 엑키스, 질산소다, 질산암모늄, 황산암모늄 등이, 또한 무기염으로서는 식염, 인산염, 탄산칼슘, 아연, 망간, 코발트, 철 등의 금속염류를 적당히 첨가하며 좋으며, 필요에 따라 소포제로서 동.식.광물유 등을 첨가하면 좋다. 배양온도, 배양시간 등의 배양조건은 사용균의 발육에 따라 적절히 조절하여, GTX-01의 생산이 최고로 되게 하기 위한 조건을 선택하면 된다. 예를들면 배지의 pH는 4-9, 특히 6.5-7.5 부근이 좋으며 배양최적온도는 25℃-35℃ 정도가 좋다. 그러나 이들 배양 조성물, 배지의 수소이온농도, 배양온도, 교반조건 등의 배양조건은 사용하는 균주의 종류와 외부조건 등에 따라 좋은 결과가 나올 수 있도록 적절히 조절해야 한다.

이와 같이 얻어진 배양물로부터 항생물질 GTX-01을 얻기 위하여는 대사산물을 분리 정제하는데 통상 이용되는 수단을 적절히 이용 하는바, 예를 들면 GTX-01과 불순물간의 용해도 차, 이온 결합력의 차, 흡착 친화력의 차, 분자량의 차 등을 이용하는 수단 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 의한 GTX-01의 분리 방법을 예를 들어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

GTX-01은 배양액과 균사체내에 축적되어 있으므로 배양액을 여과 혹은 원심분리하여 상등액과 균사체를 분리한다. 균사체는 아세톤, 메타놀 등과 같은 유기 용매로 추출한 후 감압 농축하여 유기 용매를 제거한다. 균사체 추출물과 상등액을 합쳐 pH4 정도로 조절한 다음 에칠아세테이트로 추출하고 다시 이 추출물을 감압 농축하여 기름상의 잔류물을 얻은 다음 실리카겔 칼람에 걸어 클로로포름-메타놀, 클로로포름-메타놀-증류수를 용매계로 하여 구배 용출 분취한다.

활성이 있는 부분만을 모아 농축한 다음 다시 실리카겔 칼람에 걸어 클로로포름-포름-메타놀과 클로로포름-메타놀-증류수로 분배 크로마토그라피를 행한 다음 얻어진 활성물질 잔유물은 최종적으로 고속액체 크로마토그라피를 이용하여 순수 정제한다. 이렇게하여 얻어진 항생물질 GTX-01의 이화학적 및 생물학적 성질은 다음과 같다.

[GTX-01의 이화학적 및 생물학적 성질]

(1) 형상 : 황색 분말

(2) 자외부흡수스팩트럼 : λmax^nm(제1도와 같다)

산성(0.1N HC1-MeOH)……………………224, 315(sh)

중성(MeOH)…………………………………234, 320(sh)

염기성(0.1N-NaOH-MeOH)……………………210, 222(sh), 310(sh)

(3) 적외부흡수스팩트럼 : νmax^AgBr(제2도와 같다)

(4) 핵자기공명스팩트럼 : 제3도와 같다.

CD₃OD에 용해시켜 테트라메틸실란을 외부 기준으로 하여 측정한 핵자기 공명 스팩트럼(270㎒)은 제3도에 나타난 바와 같다.

(5) 용해성 : 메타놀에 가용, 클로로포름, 에테르, 핵산 등의 유기용매와 물에 불용

(6) 정색반응 : 아니스알데하이드-황산…………양성

안트론………………………………양성

바닐린-황산………………………양성

라이돈-스미스……………………음성

닌하이드린…………………………음성

드라겐도르프………………………음성

2, 4-디니트로페닐하이드라진…음성

브롬클레졸그리인…………………의심

(7) 박층크로마토그라피상에서의 Rf위치

＊순상(실리카겔, 시그마)

＊역상(C18 HPTLC, 시그마)

(8) 항균스팩트럼 :

한천평판희석법에 의한 검정을 행하여 검정균의 생육이 저해되는 최소발육저지 농도를 구하였다.

[기지의 다른 항생물질과 비교]

본 물질은 특이적인 항균 스팩트럼을 나타내며 식물병원성 그람음성균중 잔토모나스 속과 인체의 패혈증을 일으키는 스트랩토코커스 속에만 선택적으로 항균활성을 나타냈다. 지금까지 잔토모나스 속에만 선택적으로 작용하는 항생 물질은 잔토사이딘, 잔토스타틴 및 아스카마이신 만이 발견되어 있으나 본 물질과 비교하여 볼 때 자외부흡수스팩트럼, 적외부흡수스팩트럼, 핵자기공명스팩트럼 모두에 있어 본 물질과 현저하게 상이 하고 또한 스트랩토코커스에 대한 활성은 보고된 바 없다. 따라 본 물질은 신규 항생 물질로 결론지었다.

GTX-01은 상기 식물병원성 잔토모나스 속에 대하여 생육저해 작용을 가진다는 사실로부터 농약용 항생물질로서의 이용이 기대된다.

[실시예]

[생산균의 배양과 물질의 정체]

방성균 90-GT-129 균주(KCTC 0011BP)를 글루코스 2%, 가용성 전분 1% 육엑키스 0.1%, 효모엑키스 0.4%, 대부분2.5%, 식염 0.2%, 제 2인산칼륨 0.005% 조성의 액체배지 12리터를 함유하는 20리터용 발효조중에 접종, 27℃ 96시간, 700rpm, 통기량 12리터/분으로 통기교반 배양을 하였다. 배양액의 최종 pH는 7.3-7.8 정도 였다. 배양액은 원심분리하여 균사체와 상등액을 분리하고 균사체내에도 항생물질 GTX-01을 축적하고 있어 균사체에 대하여는 60% 아세톤으로 하룻밤 추출하였다. 균사체 아세톤 추출물은 감압 농축하여 아세톤을 제거한 다음 상등액과 합쳐 pH를 4 정도로 조절한 후 에칠아세테이프 25리터로 3회에 나누어 추출하였다. 에칠아세테이트 추출물을 전부 합쳐 감압농축하여 GTX-01 조추출물(4.6g)을 얻었다. 이것은 실리카겔 칼람에 걸어 클로로포름-메타놀(9 : 1), 클로로포름-메타놀-증류수(30 : 9 : 1)로 분배크로마토그라피를 행하였다. 분취한 각 분획에 대하여는 잔토모나스 시트리에 대한 항균 활성을 기초로 활성분획을 찾아들어 갔으며 활성이 있는 부분에 대하여는 전부 모아 감압 농축하여 조추출물(1.2g)을 얻었다. 이것은 에프에프엘시(FFLC, 실리카겔, 야마젠, 230㎚)에서 클로로포름-메타놀-증류수(30 : 9 : 1)을 용매계로 분취하여 활성분획(596㎎)을 얻었다. 이중 일부를 고속액체 크로마토그라피(다이오넥스, 포라실 C18 칼람, 내경 10㎜길이 30㎝, 230㎜)에서 55%메타놀을 용매계로 하여 순수 정제 하였다. 물질의 고속 액체크로마토그라피상에서의 보지시간은 7분 이었다. 정제된 생성물을 동결 건조하고 물-에타놀에 의해 재결정화 시켜 GTX-01 순품을 얻었다.

[식물병 방제효과]

십자화과 식물인 케일을 파종하여 30일후에 항생물질 GTX-01을 메타놀에 용해시켜 식물체 전체에 살포하였다. 살포후 24시간 뒤에 무우배추 검은 썩음병균,(Xanthomonas campestris Pv. campestris)을 접종하고 2주일 뒤에 발병정도를 무처리구와 비교하여 방제가를 구한 결과는 다음과 같다.

Claims

하기의 이화학적 성질 및 생물학적 특성을 가진 항생물질

(1) 성상 : 황색 분발

(2) 자외부흡수스팩트럼 : λmax^nm

0.1N HC1-MeOH : 224, 315(sh)

MeOH : 234, 320(sh)

0.1N NaOH-MeOH : 210, 222(sh), 310(sh)

(3) 적외부흡수스팩트럼 : νmax^KBr(㎝^-1)

3400, 2961, 2928, 1721, 1644, 1562, 1462, 1410, 1050

(4) 핵자기공명스팩트럼 : CD₃OD에 용해시켜 외부기준으로 테트라메칠실란을 사용하여 측정(270㎒).

(5) 용해성 : 메타놀에는 용해되나, 물과 거의 모든 유기용매에 불용

(6) 정색반응 : 닌히드린 …………음성

브롬크레졸그린 ……………………의심

바닐린-황산 ………………………양성

안트론 ………………………………양성

아니스알데하이드 …………………양성

2,4 -디니트로페닐하이드라진…음성

라이돈-스미스 ……………………음성

드라겐도르프 ………………………음성

(7) 박층크로마토그라피상에서의 Rf치

＊ 순상(실리카겔, 시그마)

＊＊ 역상(C18 HPTLC, 시그마)

(8) 항균스팩트럼 : 잔토모나스 (Xanthomonas spp.)와 스트랩토코커스(Streptococcus Spp.)에만 특이적으로 항균활성을 나타냄.
스트랩토마이세스 속에 속하는 항생물질 GTX-01 생산균을 배양 하여, 그 배양물로부터 항생물질 GTX-01을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 항생물질 GTX-01의 제조법.
청구범위 2항에서, 항생물질 GTX-01생산균이 스트랩토마이세스 에스피(Streptomyces Sp.)임을 특징으로 하는 방법.