KR0141322B1 - 항생물질 키모렉신- 에이(kimorexin - a) 및 그 제조법 - Google Patents

항생물질 키모렉신- 에이(kimorexin - a) 및 그 제조법

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KR0141322B1
KR0141322B1 KR1019940025560A KR19940025560A KR0141322B1 KR 0141322 B1 KR0141322 B1 KR 0141322B1 KR 1019940025560 A KR1019940025560 A KR 1019940025560A KR 19940025560 A KR19940025560 A KR 19940025560A KR 0141322 B1 KR0141322 B1 KR 0141322B1
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Abstract

이발명은 키타사토스포리아속에 속하는 새로운 미생물의 배양물로 부터 얻어지는 새로운 항생물질 키모렉신-에이에 관한 것임. 키모렉신-에이는 다음의 물리,화학적 특성 및 생리 활성을 갖고있으며, 살균제로 유용하게 이용됨.
(1) 형상 : 흰색 분말
(2) 자외선흡광 스펙트럼 : maxnm(E1cm1%)
0.1 N HC1 - MeOH : 234, 266, 300, 310
MeOH-CHC13(1:1) : 238(1254), 274(644), 286(555), 300(408), 310(314)
0.1 N NaOH - MeOH : 234, 266, 300, 310
(3) 적외부흡수 스펙트럼 : maxKBr(cm-1))
3400, 2920, 2350, 1650, 1510, 1430, 1380, 1280, 1240, 1170, 1070, 1040
(4) 분자량 : [M+H]+1473 (FAB-MS)
(5) 핵자기 공명 스펙트럼 (프로톤 엔엠알) : DMSO-d에 용해시켜 외부기준으로 테트라메틸실란을 사용하여 측정(500 MHz)
(6) 용해성 : 물과 디메틸설폭사이드에 잘 녹으며, 메타놀, 에타놀에는 저농도로 용해되나 기타 비극성 유기용매나 아세톤에는 불용, 클로로포름과 메타놀(9:1) 혼합용매계에서도 매우 잘 용해됨
(7) 정색반응 : 닌히드린 → 음성
브름크레졸그린 →
바닐린-황산 →
안트론 →
아니스알데하이드-황산 →
2,4-디니트로페닐하이드라진→
라이돈-스미스 →
드라겐도르프 → 양성
요오드 →
(8) 박층크로마토그라피상에서의 Rf치

Description

항생물질 키모렉신-에이(KIMOREXIN-A) 및 그 제조법
제1도는 본 발명에 의한 키모렉신-에이의 자외선 흡광 스펙트럼을 나타내는 도표이고,
제2도는 본 발명에 의한 키모렉신-에이의 적외부 흡수 스펙트럼을 나타낸 도표이며,
제3도는 본 발명에 의한 키모렉신-에이의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 도표이다.
본 발명은 새로운 항생물질 및 그 제조법에 관계되는 것으로서, 특히 키타사토스포리아(Kitasatosporia)속에 속하는 새로운 미생물의 배양물로 부터 얻어지는 새로운 항생물질에 관한 것이다.
항생물질은 의약용은 물론 농약용으로도 널리 이용되고 있다. 본 발명자들은 의약 및 농약용으로 유용한 항생물질을 탐색하기 위하여 국내는 물론 세계 각지에서 채취한 토양으로부터 미생물을 분리하여 그 미생물의 배양액으로 부터 항생물질을 단리 및 정제하여 동정하고, 얻어진 물질의 용도를 개발하는 연구를 수행하여 왔다.
그 결과 키타사토스포리아 속에 속하는 새로운 미생물의 배양물로 부터 아직까지 알려져 있지 않은 신규 항생물질이 생산, 축적되는 사실을 확인하고 그 물질을 단리, 정제하여 동정하는데 성공하고, 이 항생물질을 키모렉신-에이로 명명하였다.
본 발명의 키모렉신-에이는 키타사토스포리아 속에 속하는 항생물질 키모렉신-에이 생산균을 배양하여 그 배양물로 부터 분리 채취한 신규 항생물질로서 농약용으로 유용하게 이용될수 있는 물질이다.
본 발명의 목적은 새로운 항생물질 및 그 항생물질을 방선균 키타사토스포리아속에 속하는 방선균 배양액으로 부터 분리, 획득하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
사용한 미생물
본 발명에 사용하는 미생물은 발명자들에 의하여 충북괴산에서 채취한 토양으로 부터 분리되어 키타사토스포리아 키모렉세(kitasaporia kimorexae)로 명명되고 키타사토스포리아 균주번호 90-GT-302라는 일련번호를 갖고 있는 새로운 회귀 토양 방사선균으로서, 본 발명자들에 의해 1994. 9.17 한국유전공학연구소에 수탁번호 KCTC0119BP로 기탁되었다. 이 미생물은 키타사도스포리아속에 속하는 균종으로서 본 발명의 항생물질 키모렉신-에이를 생산하는 균으로 본 발명에 유용하게 이용되된다.
일반적으로 미생물은 인공배지상에서 장기간 보존하거나 계대 배양할 경우 형태적, 생리적 특성이 변할수도 있다는 것은 이미 알려진 사실이다. 따라서 상기 90-GT-302 균주의 자연적 및 인공적 변이주는 물론, 키타사토스포리아속에 속하는 균종으로서 전술한 항생물질, 키모렉신의 생산능을 가진 미생물은 전부본 발명에 포함된다.
상기 90-GT-302 균주는 다음과 같은 균학적 특성을 가진다.
가) 형태적 특성
본 균주는 충남 괴산에서 채취한 토양으로 부터 분리되었으며 본 균주의 세포벽 산가수분해불의 디아미노피멜릭산 조성은 meso- 및 LL-타임인 것으로 나타났다. 또한 본 균주는 한천배지상에서 배양 초기에 노란색의 기질균사를 형성하며 배양기간 이 경과함에 따라 흰색의 직선형 기균사가 형성되었다가 회색의 포자사슬로 변한다. 포자는 타원형에 가까운 형태를 하고 있으며 표면은 활면(smooth type)이었다. 본 발명의 균주는 멜라노이드 색소를 생성하지 않고 전분을 쉽게 용해하며 탈지유를 응고시키나 펩톤화시키지는 못하였다. 질산을 환원시키지 못하며 젤라틴은 액화시키나 섬유소는 분해하지 못하였다. 이상의 결과로 부터 본 균주는 키타사토스포리아 속에 속한다는 사실을 알 수 있다.
나) 각종 한천배지상에서의 생육특성
각종 한천 배지상에서 27℃, 3주간 배양하였을 때 본 균주의 생육특성은 표1과 같으며 이때 색깔의 판정은 미국상무성 표준국의 아이에스시시-엔비에스 센트로이드 칼라 챠트(ISCC-NBS Centroid Color Charts)를 표준으로 하여 판정하였다.
다)탄소원의 이용
키타사토스포리아 속에 속하는 방선균은 지금까지 총 7균주(K. 세타에, K. 시스타르기니아, K. 그리시올라, K. 포살라시니아, K. 멜라노게나, K. 파풀로사, K. 그리시아)가 보고되고 있다.
본 발명의 균주는 당 이용성은 몰론 젤라틴 액화, 유화수소 생성, 생육가능 온도범위(14-45℃) 탈지분유 응고현상 흑은 생육, 생리적 특성등에서 이들과 다른 특성을 나타냈다. 또한, 지금까지 알려진 키타사토스포리아 속에 속하는 방선균들은 항세균성 항생물질이나 레닌 저해제(renin inhibitor)를 생산하는 것으로 알려져 있기 때문에 90-GT-302 균주와는 생리활성 물질 생산에 있어서도 특징을 달리한다는사실을 알 수 있다. 따라서 본 균주는 버기스 매뉴얼 어브 시스티 매틱 박테리올로지(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1989, 제4권)의 방선균 분류학상 키타사토스포리아 속에 속하는 새로운 종으로 동정되었으며, 키타사토스포리아 키모렉세(Kitasatosporia Kimorexae, 이하 K. 키모렉세로 표기함)로 명명하였다.
참고문헌
윌리암스, 에스. 티., 엠. 이. 챠프 및 제이. 지. 홀트 공저, 버기스 매뉴얼 어브 시스테마틱 박테리올로지, 제4권, 1989, 윌리암 & 윌킨스, 미국, 발티모어
배양법 및 제조법
본 발명의 항생물질 키모렉신을 얻기 위하여는 키타사토스포리아 속에 속하는 상기 항생물질 생산균을 항생물질을 생산하는 통상의 방법으로 배양하면 된다. 배양의 형태는 항생물질 생산균을 유리하게 배양하기 위하여 본 생산균의 포자현탁액 흑은 배양액을 액체배지에 접종시켜 통기교반 배양을 행하는 것이 좋다.
배지의 영양원으로서 특히 한정된 것을 사용하지 않고 미생물 배양에 통상 이용되는 탄소원, 질소원 등을 배지중에 첨가한다. 탄고원으로서는 전분, 덱스트린, 글리세린, 글루코스, 슈크로스, 갈락토스, 면실유, 대두유, 만리톨 등이 사용되고, 질소원으로서는 펩톤, 대두분, 육 엑기스, 쌀겨, 말토스, 낙화생분, 면실분, 어분, 콘스티브 리쿼, 효모 엑기스, 질산소다, 질산암모늄, 황산암모늄 등이 사용되며, 또한 무기염으로서는 식염, 인산염, 탄산칼슘 또는 아연, 망간, 코발트, 철등의 금속염류를 적당히 첨가하는 것이 좋다. 필요에 따라서는 소포제로서 실리콘 오일, 동물유, 식물유, 광물유 등을 첨가 할 수도 있다. 통기량, 배양온도, 배양시간 등의배양조건은 사용균의 발육에 따라 적절히 조절하여 키모렉신 생산이 최고로 되는 조건을 선택하면 된다. 예를들며, 배지의 pH는 4-9, 특히 6.5-7.5 범위가 좋으며, 배양 최적온도는 25℃-35℃ 범위가 좋다. 그러나 이들 배양조성물, 배지의 수소이온농도, 배양온도, 용존산소, 교반조건 등의 배양조건은 사용하는 균주의 특성과 외부조건 등에 따라 좋은 결과가 나올수 있도록 적절히 조절해야 한다.
이와같이 하여 얻어진 배양물로 부터 항생물질 키모렉신을 얻기 위하여는 대사산물을 분리, 정제하는데 통상적으로 이용되는 수단을 적절히 사용한다. 예를들면, 키모렉신과 불순물간의 용해도 차, 유기용매에 대한 분배계수의 차, 이온결합력의 차, 흡착친화력의 차, 분자량의 차 등을 이용하는 수단을 단독 혹은 적절히 결합하거나 반복하여 사용한다.
구체적으로 기술하면, 키모렉신은 배양액과 균사체내에 축적되어 있으므로 배양액을 여과 흑은 원심분리하여 상등액과 균사체를 분리한다. 균사체는 함수아세톤이나 메타놀등과 같은 함수유기용매로 추출한 후 감압 농축하여 유기용매를 제거한다. 균사체 추출물과 상등액을 합쳐 다이아이온 에취피-10 (Diaion HP-10)에 흡착시킨 후 물과 50% 함수 메타놀로 충분히 씻어낸 다음, 70% 함수 아세톤으로 용출, 농축하면 상당히 정제된 분말상의 잔유물을 얻을수 있다. 이렇게 하여 얻어진 잔유물은 다시 실리카겔 칼럼에 걸어 클로로포름-메타놀 혼합유기용매를 8.5:1.5, 6:4, 3:7과 같이 순차적으로 극성을 높여가며 전개시킴으로서 상당히 정제된 활성분획을 얻을수 있다. 활성분획은 농축한 다음 에취피엘시(HPLC)에서 최종 정제를 수행하며 이때의 조건은 메타놀과 개미산으로 pH6.0-7.0으로 조절한 0.1-1.0% 디에틸아민 완충액을 60:40-70:30의 비율로 조절하여 오디에스(ODS)칼람을 이용하여 정제하였다. 이때 분리조건은 본 균주아 생산하는 항생물질이 복합물질이기 때문에 목적하는 물질에 따라 조금씩 달리하였다. 에취피엘시에서 분취한 활성물질은 감압 농축시켜 유기용매를 완전히 제거한 다음 다이아아이온 에취피-10에 흡착시킨후 순수 증류수로 충분히 세척함으로서 완층액속에 용해되어 있는 디에칠아민과 개미산을 제거하였으며, 활성물질은 70% 함수아세통으로 용출하여 농축한 다음 동결건조하여 흰색 분말상으로 얻었다. 이때 디에칠아민과 개미산을 제거하기 위하여는 엠시아이겔(MCI gel)과 같은 활성탄 대체 인공 합성 수지나 기타 본 물질은 잘 흡착되지만 완충액 성분이 흡착되지 않는 수지를 사용 할수 있다. 또한 완충액으로서는 pH를 안정하게 유지시켜줄 수 있는 인산 완충액 들을 사용하여도 무방하다. 본 균주가 생산하는 항생물질은 현재까지 적어도 5가지 이상이 복합적으로 존재하고 있음이 확인되었으나 그 함량이 키모렉신 에이와 비료하여 매우 적으므로 대량 배양하여 본 발명의 물질만을 분리 정제하는 것이 가능하다.
이화학적 및 생물학적 성질
(1) 형상 : 흰색 분말
(2) 자외선흡광 스펙트럼 : maxnm(E1cm1%, 그림 1과 같다)
산성 (0.1 N HC1 - MeOH) : 234, 266, 300, 310
중성 (MeOH-CHC13, 1:1) : 238(1254), 274(644), 286(555), 300(408), 310(314)
염기성 (0.1 N NaOH - MeOH) : 234, 266, 300, 301
(3) 적외부흡수 스펙트럼 : νmaxKBr(그림 2와 같다)
3400, 2920, 2350, 1650, 1510, 1430, 1380, 1280, 1240, 1170, 1070, 1040
(4) 분자량 : [M+H]+1473 (FAB/MS)
(5) 핵자기 공명 스펙트럼 (프로톤 NMR) : DMSO-d에 용해시켜 테트라메틸실란을 외부기중으로 하여 측정한 핵자기 공명스펙트럼(500 MHz)은 그림 3에 나타난 바와 같다.
(6) 용해성 : 클로로포름-메타놀(9:1), 물 및 디메틸설폭사이드에 가용, 에타놀, 메타놀에 난용, 그외의 아세톤이나 비구성 유기용매에는 불용
(7) 정색반응 : 아니스알데하이드-황산 → 음성
안트론 →
바닐린-황산→
라이돈-스미스 →
난하이드린 →
2,4-디니트토페닐하이드라진 →
브롬크레졸그린 →
요오드 → 양성
드라겐드르프 →
(8) 박층크로마토그라피상에의 Rf치
(9) 항균스펙트럼 : 한천평판 희석법에 의한 검정을 행하여 검정균의 생육이 저해되는 최소 발육 저지 농도를 구하였다.
기지의 다른 항생물질과 비교
본 발명은 식물병원성 곰팡이 즉, 도열병균, 벼잎집얼룩병균, 인삼근부병균) 등에 대하여 균사팽윤현상을 일으키며 지금까지 분자량 1472의 항생물질로 알려진 사라마이세틴1)과 사이크로치아조마이신2)과는 항항균 스펙트럼 혹은 물리, 화학적인 특성에 있어 차이를 보여주며, 특히 아니모산 조성에 있어 페닐알라닌을 분자내에 함유하고 있다는 점에서 큰 차이점을 보이고 있다. 또한 본 화합물은 pH 4-10의 인산 환충액상에서 4℃에서는 물론 실온에서 10일간 보관하였을 때 나 분말상태로 실온에서 5개월 이상 보관하였을 때에도 매우 안정된 상태를 유지하였으며, 이와같은 성질은 약산성 및 알카리 조건하에서 매우 불안정한 사라마이세틴과는 전혀 다른 성질을 나타낸다.
참고문헌
1) Budet, P. and E. cherbuliez : 1964, Helv. Chem. Acta, 47,661-683.
2) Aoki, M., T. Ohtsuka, M.Yamada, Y. Ohba, H. Yoshizaki, H. yasuno, T.sano, J.Watanabe, K. Yokose, and H. Seto : 1991, J. Antibiotics, 44, 582-588
실시예
방선균 90-GT-302 균주(KCTC 0119BP)를 글루코스 2%, 가용성 전분 1%, 육엑기스 0.1%, 효모엑기스 0.4%, 대두분 2.5%, 식염 0.2%, 제2인산칼륨 0.005%, 소포제로서 실리콘오일 0.1% 및 폴리엔계 0.1%로 조성된 액체배지 30리터(pH 7.3)를 함유하는 50리터용 발효조 중에 접종시키고 32℃, 96시간, 100-700rpm, 통기량 5-30리터/분으로 통기교반하여 배양을 하였다. 4일간 배양시 배양액의 최종 pH는 8.0-8.1정도였다. 배양액은 원심분리하여 균사체와 상등액을 분리하였고, 균사체내에도 항생물질 키모렉신을 다량 축적하고 있어 균사체에 대하여는 70% 아세톤으로 하룻밤 동안 추출하였다. 균사체의 아세톤 추출물은 감압 농축하여 아세톤을 제거한 다음 상등액과 합쳐 다이아이온 에이취피-10 약 8리터에 흡착시킨후 물과 50% 함수 메타놀 각 30리터씩으로 세척하였다. 활성물질은 70% 함수 아세톤으로 용출하여 낸 다음 감압 농축하여 시리카겔 칼람(500ml x 3)에 걸어 클로로포름-메타놀의 비를 8.5:1.5, 6:4, 3:7로 용매의 극성을 순차적으로 높여가며 2리터씩 분취하였다. 활성물질은 주로 6:4 용출액에서 얻어 졌으며, 이 분획은 다시 감압농축하여 에취피엘시(HPLC)에서 최종적으로 정제하였다. 이때의 조건은 본 균주가 생산하는 활성물질이 적어도 5가지 이상이 존재하기 때문에 목적하는 활성물질에 따라 개미산으로 pH를 6.0-7.0으로 조절한 0.1-1.0% 디에틸아민과 메타놀을 40:60-30:70의 비율로 사용하여 분획처리하였다. 이때 사용한 완충액은 pH를 안정하게 유지시켜 주기 위한 것으로서 무기 인삼염 완충액이나 기타 완충액을 사용하여도 무방하며 분획물은 농축한 다음 다이아이온 에이취피-10에 활성물질을 흡착시킨후 수지를 물로 충분히 세적함으로서 완충액을 제거하였다. 흡착된 활성물질은 70% 아세톤으로 용출하여 농축, 동결 건조하여 순수하게 정제된 흰색 가루상의 활성물질을 얻었다.
식물병 방제효과
90-GT-302 균주(Kitasatosporia kimorexae)가 생산하는 활성물질의 각종식물 병원성 곰팡이에 대한 폿트 시럼결과는 다음과 같다. 폿트 시험은 본 균주의 배양여액을 식물체마다 10ml씩 3회 반복처리하고 24시간이 경과한후 병원균의 포자, 우주자 또는 균질화된 균체를 처리하여 발병정도를 조사하였으며 접종원의 준비를 위하여 벼잎집얼룩병(Rhizoctonia solani)은 밀기을 배지에 배양후 균체를 균질화 한 다음 슬러리 상태로 접종하였다. 한편 강남콩 흰가루병과 밀녹균병은 발병식물체에 형성된 포자를 식물체와 함께 건조하여 냉동보관 중인 것을 멸균수에 현탁한 다음 포자농도가 100배 광학 현미경하에서 15-20개가 보일 정도로 조절하여 분무 접종하였다. 이때 본 항생물질의 식물체에 대한 부착성을 향상시키기 위해 일반적으로 시판되고 있는 전착제를 사용하여도 무방하다. 또한, 본활성물질은 수용성 항생물질이기 때문에 부형제, 희석제, 분산제가 따로 필요치는 않으나 필요에 따라 사용하여도 무방하다. 그예로서 폴리옥시 에칠렌 알킬 아릴에테르(10%)와 소듐리그노설포네이트(20%)가 주성분인 전착제를 20L당 10ml(0.5%)를 첨가하여 사용한다. 이때 사용한 시료는 정제과정을 전혀 거치지 않은 배양액 상채로 키모렉신-에이의 20ppm 농도 수준인 것을 사용하였다.

Claims (3)

  1. 하기의 물리, 화학적 특성 및 생리활성을 갖고 있고 기타사토포리아 속 미생물을 배양하여얻은 항생물질 키모렉신-에이.
    (1) 현상 : 흰색 분말
    (2) 자외선흡광 스펙트럼 : maxnm(E1cm1%)
    0.1 N HC1 - MeOH : 234, 266, 300, 310
    MeOH-CHC13(1:1) : 238(1254), 274(644), 286(555), 300(408), 310(314)
    0.1 N NaOH - MeOH : 234, 266, 300, 310
    (3) 적외부흡수 스펙트럼 : maxKBr(cm-1)
    3400, 2920, 2350, 1650, 110, 1430, 1380, 1280, 1240, 1170, 1070, 1040
    (4) 분자량 : [M+H]+1473 (FAB-MS)
    (5) 핵자기 공명 스펙트럼 (프로톤 엔엠알) : DMSO-d에 용해시켜 외부기준으로 테트라메틸실란을 사용하여 측정 (500 MHz)
    (6) 용해성 : 물과 디메틸설폭사이드에 잘 녹으며, 메타놀, 에타놀에는 저농도로 용해되나 기타 비극성 유기용매나 아세톤에는 불용, 클로로포름과 메타놀(9:1) 혼합용매계에서도 매우 잘 용해됨.
    (7) 정색반은 : 닌히드린 → 음성
    브름크레졸그린 →
    바닐린-황산 →
    안트론 →
    아니스알데하이드-황산 →
    2,4-디니트로페닐하이드라진 →
    라이든-스미스 →
    드라겐도르프 → 양성
    요오드 →
    (8) 박층크로마토그라피상에서의 Rf치
    (9) 항균스펙트럼 : 벼잎집얼룩병균, 담배, 오이의 흰가루병균, 밀녹병균, 도열병균 등 식물병원성 곰팡이에만 활성을 나타냄.
  2. 키타사토스포리아 속의 키타사토스포리아 키모렉세(Kitasatosporia kimorexae)를 배양하여, 그 배양물로 부처 다음의 물리, 화학적 특성과 생리활성을 갖는 항생물질 키모렉신-에이를 분리, 정제하는 것을 특징으로하는 항생물질 키모렉신-에이의 제조방법.
    (1) 형상 : 흰색 분말
    (2) 자외선흡광 스펙트럼 : λmaxnm(E1cm1%)
    0.1 N HC1 - MeOH : 234, 266,, 300, 310
    MeOH-CHC13(1:1) : 238(1254), 274(644), 286(555), 300(408), 310(314)
    0.1 N NaOH- MeOH : 234, 266, 300, 310
    (3) 자외부흡수 스펙트럽 : maxKBr(cm-1)
    3400, 2920, 2350, 1650, 1510, 1430, 1380, 1280, 1240, 1170, 1070, 1040
    (4) 분자량 : [M+H]+1473 (FAB-MS)
    (5) 핵자기 공명 스펙트럼 (프로톤 엔엠알) : DMSO-d에 용해시켜 외부기준으로 테트라메틸실란을 사용하여 측정 (500 MHz)
    (6) 용해성 : 물과 디메틸설폭사이드에 잘 녹으며, 메타놀, 에타놀에는 저농도로 용해되나 기타 비극성 유기용매나 아세톤에는 불용, 클로로포름과 메타놀(9:1) 혼합용매계에서도 매우 잘 용해됨.
    (7) 정색반은 : 닌히드린 → 음성
    브름크레졸그린 →
    바릴린-황산 →
    안트론 →
    아니스알데하이드-황산 →
    2,4-디니트로패닐하이드라진 →
    라이든-스미스 →
    드라겐도르프 → 양성
    요오드 →
    (8) 박층크로마토그라피상에서의 Rf치
    (9) 항균스펙트럼 : 벼잎집얼룩병균, 담배, 오이의 흰가루병균, 밀녹병균, 도열병균 등 식물병원성 곰팡이에만 활성을 나타냄.
  3. 청구범위 1항의 항생물질을 유효성분으로 포함하는 살균제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160145526A (ko) * 2016-12-06 2016-12-20 농업회사법인 (주)고려전통식품 청국장 발효용 복합 스타터 균주, 그를 포함하는 발효식품 및 그를 이용한 생청국장의 제조방법
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