CZ282296B6 - Nové antibiotikum, Balhimycin, způsob jeho výroby a jeho použití jako léčiva - Google Patents

Nové antibiotikum, Balhimycin, způsob jeho výroby a jeho použití jako léčiva Download PDF

Info

Publication number
CZ282296B6
CZ282296B6 CS912334A CS233491A CZ282296B6 CZ 282296 B6 CZ282296 B6 CZ 282296B6 CS 912334 A CS912334 A CS 912334A CS 233491 A CS233491 A CS 233491A CZ 282296 B6 CZ282296 B6 CZ 282296B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
balhimycin
dsm
fermentation
carried out
culture
Prior art date
Application number
CS912334A
Other languages
English (en)
Inventor
Suresh Rudra Dr. Nadkarni
Sugata Dr. Chatterjee
Mahesh Vithalbhai Dr. Patel
Kalyanapuram Rajagopalan Desikan
Erra Koteswara Satya Dr. Vijayakumar
Bimal Naresh Dr. Ganguli
Jürgen Dr. Blumbach
Hans-Wolfram Dr. Fehlhaber
Herbert Dr. Kogler
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Aktiengesellschaft filed Critical Hoechst Aktiengesellschaft
Publication of CS233491A3 publication Critical patent/CS233491A3/cs
Publication of CZ282296B6 publication Critical patent/CZ282296B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K4/04—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/04—Actinomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

Nové glykopeptidové antibiotikum nazvané Balhimycin molekulového vzorce C.sub.66.n.H.sub.73.n.Cl.sub.2.n.N.sub.9.n.O.sub.24 .sub..n.produkované mikroorganismem Actinomycete species Y-86, 21 022 /DSM 5908/, způsob jeho přípravy a léčiv, která jej obsahují.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nového glykopeptidového antibiotika, nazvaného Balhimycin, získatelného z aktinomycetové kultury Hoechst India Limited Y-86,21022. Balhimycin může být popsán jako antibakteriální antibiotikum, náležící do třídy glykopeptidů. Vynález se rovněž týká způsobu přípravy Balhimycinu, farmaceutického prostředku, obsahujícího tento Balhimycin jako účinnou složku, použití Balhimycinu jako antibiotika a rovněž nové aktinomycetové kultury Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908).
Dosavadní stav techniky
Glykopeptidová antibiotika jsou úzkospektrální antibiotika, působící hlavně proti Grampozitivním bakteriím. Jejich účinnost vůči S. aureus (MRSA) kmenům, rezistentním na methicillin, z něho učinila hodnotné léčivo při léčení infekcí, vyvolaných, MRSA. Tato glykopeptidová antibiotika jsou také užitečná jako promotory růstu ve veterinární oblasti. Glykopeptidová antibiotika jsou popsána v publikacích: Topics in Antibiotic Chemistry, Vol. 5, strana 119 (1980), Joumal of Antibiotics, Vol. 38, str. 561 (1985), Joumal of Antibiotics, Vol. 40, str. 924 (1987), Joumal of Organic Chemistry, Vol. 54, str. 983 (1989).
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří Balhimycin, což je sloučenina sumárního molekulového vzorce
C66H73CI2N9O24 a strukturního vzorce:
HO + h2o
A
- H,0
- 1 CZ 282296 B6
jehož trifluoracetátová sůl má teplotu tání > 300 °C (za rozkladu), index lomu [cc]D -23,2 ± 2°(C=5, H2O) a UVmax (H2O) 208,285 nm, a který je získatelný produkčním mikroorganizmem Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908) a následnou izolací a čištěním z kultivačního prostředí, a rovněž farmaceuticky přijatelné soli této sloučeniny.
Podstata postupu výroby Balhimycinu podle vynálezu spočívá v tom, že Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908) mutanty a/nebo variety se kultivují za aerobních podmínek v živném médiu, obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, anorganické živné soli a stopové prvky, a takto získaná sloučenina se izoluje a čistí od kultivačního prostředí obvyklým způsobem.
Kultivace se ve výhodném provedení postupu podle vynálezu provádí při teplotě v rozmezí od 28 °C do 32 °C a při hodnotě pH v rozmezí od 6 do 8, nejvýhodněji při teplotě asi 29 °C ± 1 °C a hodnotě pH 7.
Výhodně se fermentace provádí po dobu v rozmezí 68 až 72 hodin, přičemž je rovněž výhodné tuto fermentaci provádět jako submerzní fermentaci.
Do rozsahu předmětného vynálezu náleží rovněž farmaceutický prostředek s antibiotickými účinky, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje uvedený Balhimycin v kombinaci s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou a/nebo vehikulem nebo vehikuly.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití uvedeného Balhimycinu pro přípravu léčiva s antibiotickými účinky.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží nový mikroorganizmus Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908).
Balhimycin, který je zde popsán, se liší od všech známých glykopeptidových antibiotik svým molekulovým vzorcem. Navíc on-line rešerše v Chemical Abstracts, provedená na klíčová rešeršní hesla, týkající se molekulové hmotnosti a molekulového vzorce, potvrzují novost této sloučeniny.
-2 CZ 282296 B6
Mikroorganizmus, kultura č. Hoechst India Limited, Y-86,21022, uváděná v popisu předmětného vynálezu jako Y-86,21022, použitá pro produkci Balhimycinu, byla izolována z půdního vzorku, sebraného v Thamu forest, Himalaya, India. Mikroorganizmus Y-86,21022 náleží do řádu Actinomycetales. Mikroorganizmus Y-86,21022 je uložen v Deutsche Sammlung von Mikroorganismen za podmínek Budapešťské smlouvy, od 6. dubna 1990, pod číslem DSM 5908.
Dalším aspektem tohoto vynálezu je postup výroby nového antibiotika Balhimycin z kultury č. Hoechst India Limited Y-86,21022, jejích mutantů a variet. Uvedený způsob zahrnuje kultivaci kultury Y-86,21022, jejích mutantů a variet za aerobních podmínek v živném médiu, obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, živné anorganické soli a stopové prvky, a izolaci a čištění tohoto antibiotika z kultivačního prostředí. Zdroji uhlíku mohou být škrob, glukóza, sacharóza, dextrin, fruktóza, melasa, glycerol, laktóza nebo galaktóza. Výhodným zdrojem uhlíku je glycerol. Zdroje dusíku mohou být sojová moučka, moučka z podzemnice olejně, kvasnicový extrakt, hovězí extrakt, pepton, sladový extrakt, kukuřičný výluh, želatina nebo kasaminové kyseliny. Výhodným zdrojem dusíku je sojová moučka. Živnými anorganickými solemi mohou být hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, chlorid vápenatý, uhličitan vápenatý, dusičnan draselný, síran amonný nebo síran hořečnatý. Stopovými prvky mohou být soli železa, manganu, mědi, zinku nebo kobaltu nebo jiných těžkých kovů.
Kultivace kultury č. Y-86,21022 se výhodně provádí při teplotách mezi 28 až 32 °C a při hodnotách pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Zejména se kultura č. Y-86,21022 kultivuje při teplotě asi 29 °C (± 1 °C) a pH asi 7,0.
Fermentace se provádí výhodně pod dobu 60 až 72 hodin, kdy se získá optimální výtěžek antibiotika podle tohoto vynálezu. Fermentace se zejména provádí po dobu 68 až 72 hodin za podmínek submerzní fermentace v třepacích baňkách, stejně jako v laboratorních fermentorech. V případě potřeby je možno použít ve fermentoru odpěňovací prostředek, jako je DesmophenR (Polyoly Bayer-AG Leverkusen, SRN). Postup fermentace a tvorbu sloučeniny podle tohoto vynálezu je možno sledovat vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC) a měřením bioaktivity kultivačního prostředí vůči druhům Staphylococcus, běžně známou testovací metodou na mikrobiální difúzi na agarové plotně. Výhodnou kulturou je v tomto případě Staphylococcus aureus 3066, která je rezistentní vůči methicillinu, což je beta-laktamové antibiotikum, popsané v literatuře.
Balhimycin může být například izolován z kultivačního bujónu přímou adsorpcí na vhodných adsorbentech, jako je aktivované uhlí, Diaion HP-20 (vysokoporézní pryskyřice na bázi polystyren-divinylbenzenového kopolymeru, Mitsubishi Chemical Industries, Japonsko) nebo Amberlite XAD (porézní pryskyřice na bázi polystyrenu a esteru kyseliny akrylové, Rohm and Haas Co., U.S.A). Výhodným adsorbentem je diaion HP-20. Balhimycin může být vyeluován z těchto adsorbentů pomocí mobilních fází, jako je voda, methanol, aceton, acetonitril nebo jejich vhodné kombinace. Výhodné eluenty jsou vodný methanol nebo aceton.
Výše zmíněné aktivní eluáty, obsahující Balhimycin, mohou být koncentrovány a potom dále čištěny různými způsoby. Například readsorpčními a elučními postupy s aktivovaným uhlím, Amberlitem XAD-4 a 7, Diaionem HP-20; gelovou filtrací se Sephadexem LH-20 nebo za pomoci G-série gelů (Pharmacia Fine Chemicals AB, Švédsko) za použití vody methanolu, acetonu nebo vhodných kombinací těchto látek jak eluentů; iontovýměnnou chromatografii s IRC-50 (IT) při rozmezí pH 6,5 až 8,5 za použití 0,1 N HCl jako eluentu; nebo střednětlakou kapalinovou chromatografii (MPLC) na vhodných adsorbentech, jako je například oxid křemičitý, modifikovaný oxid křemičitý, jako oxid křemičitý s reverzními fázemi, například oktadecyldimethylsilylovaný oxid křemičitý (RP-18) a neutrální oxid hlinitý. Dále je možno aplikovat protiproudou chromatografii s daným mnohosložkovým rozpouštědlovým systémem, která rovněž může být použita pro daný účel. Výhodný způsob čištění zahrnuje opakovanou
-3 CZ 282296 B6
MPLC na RP-18 za použití vodného methanolu nebo acetonitrilu, obsahujícího vhodné aditivum, jako například sůl nebo kyselinu, jako eluentu.
Balhimycin může být převeden na svou farmakologicky přijatelnou sůl, například reakcí s organickými nebo anorganickými kyselinami, jako je kyselina chlorovodíková HCI, kyselina sírová H2SO4, kyselina citrónová, kyselina mléčná, kyselina jantarová, kyselina octová, kyselina trifluoroctová, což se provede běžně známým způsobem.
Fyzikálně chemické a spektrální vlastnosti Balhimycinu jsou uvedeny v tabulce 1, která následuje.
Tabulka 1
Fyzikálně-chemické a spektrální vlastnosti Balhimycinu (ve formě trifluoracetátové soli).
vzhled chemický typ : bílý prášek : bázický glykopeptid : vankomycinové třídy
rozpustnost teplota tání Mn22 : voda, dimethylsulfoxid : 300 °C (rozklad) : -23,2 ± 2° (C=5, H2O)
vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC):
retenční doba : 4,2 min, 4 x (250 + 30) mm 10 μ ODS Hypersil kolona; eluent 18 % acetonitril ve vodě, obsahující 0,1 % TFA, průtok 2 ml/min, detekce 220 nm, rychlost posunu 10 mm/min, obr. 1 přiložených výkresů
molekulový vzorec : C66H73CI2N9O24 určený vysokorozlišovací FAB hmotnostní spektrometrií (M + FT naměřeno: m/z 1446, 4204, vypočteno: m/z 1446, 4205 pro Có6 H74 CI2 N9 Ο24
UVmax(H2O) *H NMR (400MHz D2O, 300K) : 208, 285 nm : obr. 2 přiložených výkresů.
Příklady provedení vynálezu
Předložený vynález je dále charakterizován následujícími příklady provedení a obsahem patentových nároků.
-4 CZ 282296 B6
Příklad 1
Izolace kultury Y-86,21022 z půdy /a/ složení živného izolačního média
kukuřičný škrob kasein peptol kvasnicový extrakt K2HPO4 agarový prášek demineralizovaná voda pH 10,0 g 1,0 g 1,0 g 1,0 g 0,5 g 13,0 g 1,0 1 7,5
/b/ ředění a izolace půdy g půdy, sebrané zThamu Forest, Himalaya, Indie, bylo přidáno do 90 ml sterilizované demineralizované vody ve 250 ml Erlenmeyerově bance, která byla třepána po dobu 2 hodin na rotační třepačce /220 otáček/min/. Výše uvedená suspenze půdy pak byla postupně ředěna v 10 násobných stupních až na/10'5/. Z posledního zředění byl 1 ml suspenze uložen do středu sterilní skleněné Petriho misky /15 cm v průměru/, do které bylo pak nalito přibližně 50 ml výše uvedeného izolačního média, doplněného 25 mcg/ml amphotericinu B jako protiplísňového prostředku a ochlazeno na 45 °C a miska byla důkladně provířena. Směs suspenze půdy a média byla ponechána usadit a byla inkubována při 28 °C /± 1 °C/ po dobu 7 dní. Petriho miska pak byla periodicky sledována a kultura č. Y-86,21022 byla izolována z rostoucích mikroorganizmů.
Příklad 2
Udržování kultury Y-86,21022
Složení udržovacího média
Kultura č. Y-86,21022 byla udržována na následujícím médiu
sladový extrakt kvasnicový extrakt glukóza agarový prášek demineralizovaná voda pH 10,0 g 4,0 g 4,0 g 13,0 g 1,01 7,0
Po úplném rozpuštění složek zahřátím bylo médium distribuováno do zkumavek a pak sterilizováno při 121 °C po dobu 20 minut. Zkumavky byly ochlazeny a ponechány ztuhnout v šikmé poloze. Šikmé agary byly naočkovány výpěstkem kultury č. Y-86,21022 drátěnou kličkou a inkubovány při 28 °C /± 1 °C/, dokud nebyl zjištěn dobrý nárůst. Náležitě vypěstované kultury byly uskladněny v chladničce při teplotě + 8 °C.
Příklad 3
Fermentace kultury Y-86,21022 v třepacích baňkách
-5 CZ 282296 B6
Složení očkovacího média
glukóza sojová mouka kukuřičný výluh CaCO3 demineralizovaná voda pH 15,0 g 15,0 g 5,0 g 2,0 g 1000 ml 7,0
Výše uvedené očkovací médium bylo rozděleno v 80 ml množstvích do 500 ml Erlenmeyerových baněk a autoklávováno po dobu 20 minut. Baňky byly ochlazeny na teplotu místnosti a každá baňka pak byla naočkována kličkou výše uvedenou vypěstovanou kulturou z příkladu 2 a třepána v rotační třepačce po dobu 72 minut při 240 otáčkách za minutu při teplotě 29 °C /± 1 °C/, čímž se získala očkovací kultura.
Složení produkčního média
glycerol sojová mouka CaCO3 NaCl COC12 demineralizovaná voda PH 15,0 g 10,0 g 1,0 g 5,0 g 0,001 g 1000 ml 7,0
Produkční médium bylo rozděleno po 60 ml množstvích do 500 ml Erlenmeyerových baněk a udržováno v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 20 minut. Baňky byly ochlazeny a pak naočkovány výše uvedenou očkovací kulturou /1% obj/obj./. Fermentace byla prováděna na rotační třepačce při 240 otáčkách za minutu a při teplotě 29 °C /± 1 °C/ po dobu 60 hodin.
Produkce antibiotika byla určována vysokotlakou kapalinovou chromatografií a testováním bioaktivity vůči S. aureus 3066 za použití hloubkově difuzní metody známým způsobem. Po získání byl kultivační bujón odstředěn a Balhimycin izolován z filtrátu kultury a vyčištěn, jak je popsáno v příkladu 4.
Příklad 4
Kultivace kultury č. Y-86,21022 ve fermentorech
Příprava očkovací kultury v třepacích baňkách
Očkovací médium z příkladu 3 bylo rozděleno po 160 ml množstvích do 1 litrových Erlenmeyerových baněk a autoklávováno po dobu 20 minut. Očkovací kultura byla pěstována v těchto baňkách, jak je popsáno v příkladu 3.
Provozní fermentace
Složení produkčního média
glycerol sojová mouka CaCO3 NaCl 15,0 g 10,0 g 1,0 g 5,0 g
-6 CZ 282296 B6 demineralizovaná voda pH
1000 g
6,8
100 litrů produkčního média ve 150 litrovém Marubishi fermentoru spolu s 30 ml Desmophenu jako odpěňovadla bylo sterilizováno in šitu po dobu 24 minut při teplotě 121 °C, ochlazeno na 29 °C ± 1 °C a naočkováno 3 1 očkovací kultury, jak byla výše uvedena.
Fermentace probíhala za následujících podmínek:
teplota míchání aerace doba pěstování °C ± 0,5 °C
110 až 120 otáček/min až 100 epm až 72 hodin
Produkce antibiotika byla kontrolována bioaktivitou vůči S. auerus 3066. Když byla fermentace zastavena, pH kultivačního bujónu bylo 6,0 až 7,0. Kultivační bujón byl odstředěn, po harvestování a antibiotikum Balhimycin bylo izolováno a vyčištěno od kultivačního filtrátu, jak je dále popsáno.
Izolace a čištění Balhimycinu
Přibližně 100 1 získaného bujónu, jak je uvedeno v příkladu 4, bylo odděleno od mycelia odstředěním. Výsledný bujónový filtrát /80 1/,/pH 6,5/, prošel kolonou 5 litrů 1 Diaionu HP- 20 ve vodě. Kolona byla promyta 40 litry demineralizované vody, načež výplachy byly bezbarvé. Kolona pak byla promyta 8 litry 1M vodného roztoku NaCl, načež byla promyta 10 1 demineralizované vody. Tento proces byl ještě jednou opakován. Kolona pak byla promyta 10 litry 30 %ního MeOH ve vodě a nakonec eluována 51 1 75%ního MeOH ve vodě, sebraného ve frakcích o velikosti 1 litru. Přítomnost Balhimycinu v těchto eluátech byla kontrolována aktivitou vůči Staphylococcus aureus 3066, což je organizmus, rezistentní vůči methicillinu. Shromážděné aktivní eluáty byly koncentrovány za vakua při teplotě 40 až 45 °C na přibližně 1 1, který pak byl lyofilizován, čímž se získalo 30 gramů surového Balhimycinu jako prášku.
Výše uvedený surový Balhimycin pak byl podroben ve 3 dávkách po 10 g střednětlaké kapalinové chromatografií /MPLC/ na RP-18, naplněného v 6,5 x 55 cm skleněné koloně, mající objem vrstvy 1,2 1. Kolona byla eluována 2 1 vody, obsahující 0,1 % trifluoroctové kyseliny /TFA/, načež následovala eluce 5%ním acetonitrilem / 4 1/, 7,5%ním acetonitrilem, 9 a 10 %ním acetonitrilem /24,5 1/ ve vodě, obsahující 0,1 % TFA. Balhimycin byl vyeluován v 10 %ních acetonitrilových eluátech, které byly sloučeny do frakcí po 500 ml a kontrolovány in vitro antibiotickou aktivitou.
Sloučené aktivní eluáty byly koncentrovány za vysokého vakua při 40 °C a pak lyofilizovány, čímž se získalo 2,1 g Balhimycinu jako světležlutého prášku. 3 takovéto postupy daly celkem 6,3 g poločistého Balhimycinu z 30 g surového materiálu.
6,3 g takto získaného poločistého Balhimycinu bylo nakonec vyčištěno ve 3 dávkách po 2,1 g střednětlakou kapalinovou chromatografií na RP-18 v 6 x 45 mm skleněné koloně s objemem vrstvy 500 ml. Kolona byla promyta jedním litrem vody, obsahujícím 0,1 % TFA, načež byla promyta 2 litry a 1,5 1 5 %ního a 7,5 %ního acetonitrilu ve vodě, obsahující 0,1 % TFA. Vyeluovaný Balhimycin v 10%ním acetonitrilu ve vodě, obsahující 0,1 % TFA, byl kontrolován po 250 ml frakcích UV detektorem, pracujícím při 220 nm a antibiotickými zkouškami. Celkem 8 1 aktivních eluátů bylo koncentrováno za vysokého vakua při 40 °C, načež násl?dov?.la lyofilizace, čímž se získalo 600 mg Balhimycinu ve formě trifluoroctanové soli jako bílý prášek. Z 6,3 g poločistého Balhimycinu bylo vyrobeno 1,8 g čistého Balhimycinu.
-7 CZ 282296 B6
Biologické vlastnosti Balhimycinu
Antibakteriáiní účinnost Balhimycinu v hodnotách minimální inhibiční koncentrace /MIC/, vyžadovaných k inhibici růstu různých bakterií, je uvedena v tabulce 2.
Tabulka 2
Minimální inhibiční koncentrace /MIC/ Balhimycintrifluor acetátu zkoušený organizmus MIC /pg/ml/
S. aureus 209 P 0,39
S. aureus /MethR/ 0,39
S. aureus 3066 /MethR/ 0,78
S. aureus E 690 /MethR/ 0,39
Streptococcus faecalis ATCC 29212 1,56
S. faecD2177 0,78
S. faec D Endococcen 0,78
S. faecium D-59 1,56
S. faecium D-65 0,78
Staph. epidermidis 178 1,56
S. epi. 825 3,12
S. epi. 823 /TeicoplaninR/ 12,5
Stap. haemolyticus 712 1,56
S. haemo. 809 /TeicoplaninR/ 6,25
E. coli 9632 > 100
P. vulgaris > 100
Ps. aeruginosa > 100

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Balhimycin sumárního molekulového vzorce C66H73C12N9O24 a strukturního vzorce:
    - H,0 ''
    Λ
    - H->0
    -9 CZ 282296 B6 jehož trifluoracetátová sůl má teplotu tání > 300 °C za rozkladu, index lomu [a]D 22 -23,2 ± 2° (C=5, H2O) a UVmax (H2O) 208,285 nm, a který je získatelný produkčním mikroorganizmem Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908) a následnou izolací a čištěním z kultivačního 0, prostředí, a rovněž farmaceuticky přijatelné soli této sloučeniny.
  2. 2. Způsob výroby Balhimycinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908) mutanty a/nebo variety se kultivují za aerobních spodmínek v živném médiu, obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, anorganické živné soli a stopové prvky, a takto získaná sloučenina se izoluje a čistí od kultivačního prostředí obvyklým způsobem.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se kultivace provádí při teplotě v rozmezí od 28 °C do 32 °C a při hodnotě pH v rozmezí od 6 do 8.
  4. 4. Způsob podle nároků 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se kultivace provádí při teplotě 29 °C ± 1 °C a hodnotě pH 7.
  5. 5. Způsob podle některého z nároků 2 až 4, vyznačující se t í m , že se fermentace provádí po dobu v rozmezí 68 až 72 hodin.
  6. 6. Způsob podle některého z nároků 2 až 5, vyznačující se t í m , že se fermentace provádí jako submerzní fermentace.
  7. 7. Farmaceutický prostředek s antibiotickými účinky, vyznačující se tím, že obsahuje Balhimycin, sloučeninu podle nároku 1, v kombinaci s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou a/nebo vehikulem nebo vehikuly.
  8. 8. Balhimycin podle nároku 1 pro přípravu léčiva s antibiotickými účinky.
  9. 9. Actinomycete species Y-86,21022 (DSM 5908).
CS912334A 1990-07-27 1991-07-25 Nové antibiotikum, Balhimycin, způsob jeho výroby a jeho použití jako léčiva CZ282296B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90114471 1990-07-27
EP90119883 1990-10-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS233491A3 CS233491A3 (en) 1992-03-18
CZ282296B6 true CZ282296B6 (cs) 1997-06-11

Family

ID=26125378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS912334A CZ282296B6 (cs) 1990-07-27 1991-07-25 Nové antibiotikum, Balhimycin, způsob jeho výroby a jeho použití jako léčiva

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0468504B1 (cs)
JP (1) JP3119680B2 (cs)
KR (1) KR100221687B1 (cs)
AT (1) ATE159261T1 (cs)
AU (1) AU648570B2 (cs)
CA (1) CA2047997C (cs)
CY (1) CY2114B1 (cs)
CZ (1) CZ282296B6 (cs)
DE (1) DE69127935T2 (cs)
DK (1) DK0468504T3 (cs)
ES (1) ES2108022T3 (cs)
FI (1) FI101402B (cs)
GR (1) GR3025433T3 (cs)
HR (1) HRP940710B1 (cs)
HU (1) HU215146B (cs)
IE (1) IE912643A1 (cs)
IL (1) IL98958A0 (cs)
IN (1) IN171883B (cs)
NO (1) NO305132B1 (cs)
NZ (1) NZ239130A (cs)
PT (1) PT98444B (cs)
RU (1) RU2043418C1 (cs)
YU (1) YU48601B (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5721208A (en) * 1991-06-29 1998-02-24 Hoechst Aktiengesellschaft Glycopeptides a process for their preparation and their use
TW213468B (cs) * 1991-06-29 1993-09-21 Hoechst Ag
DE19523394A1 (de) * 1995-06-28 1997-01-09 Hoechst Ag Verwendung von Balhimycin zur Leistungssteigerung bei Tieren sowie leistungssteigernde Mittel
US6509177B1 (en) 1999-02-03 2003-01-21 Biogal Gyogyszergyar Rt. Process for the preparation of pseudomonic acid A antibiotic by microbiological method
DE19926770A1 (de) 1999-06-11 2000-12-14 Basf Ag Nukleinsäurefragment und Vektor, enthaltend eine Halogenase, sowie ein Verfahren zur Halogenierung chemischer Verbindungen

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3067099A (en) * 1955-09-16 1962-12-04 Lilly Co Eli Vancomycin and method for its preparation

Also Published As

Publication number Publication date
ATE159261T1 (de) 1997-11-15
PT98444B (pt) 1999-01-29
NO912931L (no) 1992-01-28
IN171883B (cs) 1993-01-30
YU128491A (sh) 1994-12-28
FI913569A0 (fi) 1991-07-25
CA2047997C (en) 2002-04-30
RU2043418C1 (ru) 1995-09-10
JP3119680B2 (ja) 2000-12-25
HRP940710A2 (en) 1997-06-30
EP0468504B1 (en) 1997-10-15
HU215146B (hu) 2000-03-28
JPH04261200A (ja) 1992-09-17
AU8145391A (en) 1992-01-30
ES2108022T3 (es) 1997-12-16
IL98958A0 (en) 1992-07-15
FI101402B1 (fi) 1998-06-15
KR100221687B1 (ko) 1999-10-01
DE69127935D1 (de) 1997-11-20
AU648570B2 (en) 1994-04-28
CA2047997A1 (en) 1992-01-28
YU48601B (sh) 1998-12-23
GR3025433T3 (en) 1998-02-27
PT98444A (pt) 1992-05-29
NO305132B1 (no) 1999-04-06
EP0468504A1 (en) 1992-01-29
CS233491A3 (en) 1992-03-18
DK0468504T3 (da) 1998-06-02
HRP940710B1 (en) 2001-02-28
CY2114B1 (en) 2002-04-26
NZ239130A (en) 1993-09-27
IE912643A1 (en) 1992-01-29
HU912516D0 (en) 1992-01-28
HUT61606A (en) 1993-01-28
DE69127935T2 (de) 1998-03-19
FI913569A (fi) 1992-01-28
KR920002795A (ko) 1992-02-28
FI101402B (fi) 1998-06-15
NO912931D0 (no) 1991-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5112806A (en) Antibiotic, mersacidin, a process for the preparation thereof and the use thereof as a pharmaceutical
JPH0819155B2 (ja) 脱マンノシルテイコプラニン誘導体
US5310873A (en) Cyclohexapeptide compound
CZ282296B6 (cs) Nové antibiotikum, Balhimycin, způsob jeho výroby a jeho použití jako léčiva
EP0005956A1 (en) A-38533 antibiotics, their preparation, formulations containing them, and micro-organism employed in their production
US5451570A (en) Antibiotic, balhimycin, a process for its production and its use as pharmaceutical
EP1129208B1 (en) Vancoresmycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical
US4293546A (en) Anthracycline antibiotics produced by Streptosporangium fragilis Shearer sp. nov. ATCC 31519
KR0172949B1 (ko) 항생제 데옥시물룬도칸딘, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제
JPH0213392A (ja) ペプチド抗生物質
EP0574857B1 (en) Polycyclic compounds 31668P and 31668U, a process for their production and their use as antibiotic or antitumor agents
EP0818464B1 (en) Methylsulfomycin l, a process for its production and its use
JPH07114704B2 (ja) 抗生物質ａ４２８６７およびその付加塩
WO1989002441A1 (en) Antibiotic compounds
KR0141322B1 (ko) 항생물질 키모렉신- 에이(kimorexin - a) 및 그 제조법
WO2003046192A1 (en) Antibiotics ge 81112 factors a, b, b1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof
EP0786471A1 (en) Arthrichitin, a process for its production and its use
JPH01242598A (ja) 抗生物質ａ４２８６７誘導体
NO322565B1 (no) Amycomycin, en fremgangsmate for dens fremstilling og dens anvendelse som farmasoytisk middel, og farmasoytisk sammensetning

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030725