HU215146B - Eljárás új balhimicin antibiotikum és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására - Google Patents
Eljárás új balhimicin antibiotikum és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU215146B HU215146B HU516/91A HU251691A HU215146B HU 215146 B HU215146 B HU 215146B HU 516/91 A HU516/91 A HU 516/91A HU 251691 A HU251691 A HU 251691A HU 215146 B HU215146 B HU 215146B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- balhimycin
- culture
- fermentation
- carried out
- medium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
- C07K4/04—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/04—Actinomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás az (I) képletű és C66H73Cl2N9O24összegképletű balhimicin előállítására. Az előállítást Y–86.21022számú Actinomycetes faj (DS 5908), mutánsai és/vagy variánsai aerobkörülmények között, szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat ésnyomelemeket tartalmazó tápközegben végzett tenyésztésével, majd aképződött balhimicinnek a tápközegtől való elválasztásával éstisztításával végzik. A találmány tárgya továbbá a fenti vegyületettartalmazó gyógyszerkészítmény előállítása. ŕ
Description
A találmány tárgya új, balhimicinnek nevezett glikopeptid-származék antibiotikum előállítása a Hoechst India Limited Y-86.21022 számú Actinomycetes tenyészetből.
A glikopeptid antibiotikumok olyan szűk hatásspektrumú antibiotikumok, amelyek elsősorban a Gram-pozitív baktériumok ellen hatásosak. A meticillinrezisztens S. aureus (MRSA) törzsek elleni hatásuk következtében értékes MRSA által okozott betegségek elleni gyógyszerek, emellett az állattenyésztésben is jól alkalmazható növekedésserkentők. A glikopeptid antibiotikumok ismertetését megtaláljuk az Antibiotic Chemistry 5, 119. (1980); Journal of Antibiotics, 38, 561. (1985); Journal of Antibiotics, 40, 924. (1987); Journal of Organic Chemistry, 54, 983. (1989) irodalmi helyeken.
A leírásban ismertetett balhimicin képlete az összes ismert glikopeptidétől különbözik. A találmány szerinti vegyület molekulatömegének és képletének újdonságát egy Chemical Abstracts on-line kutatás is megerősíti.
A balhimicin előállítására alkalmazott Hoechst India Limited Y-86.21022 számú, a továbbiakban Y-86.21022, mikroorganizmuskultúrát az indiai Himalája-hegység Thamu erdőségében vett talajmintából izoláltuk. Az Y-86.21022 az Actinomycetalesek rendjébe tartozó mikroorganizmus.
Az Y-86.21022 mikroorganizmust a Budapesti Szerződésnek megfelelően a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél helyeztük letétbe 1990. április 6án, DSM 5908 számon.
A találmány tárgya eljárás az új balhimicin antibiotikum előállítására a Hoechst India Limited Y-86.21022 számú mikroorganizmus, valamint mutánsai és variánsai tenyészetéből. Az eljárásban az Y-86.21022, valamint mutánsai és variánsai tenyészetét aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, majd az antibiotikumot a tenyészközegtől elválasztjuk és tisztítjuk. Szénforrásként keményítőt, glukózt, szacharózt, dextrint, fruktózt, melaszokat, glicerint, laktózt vagy galaktózt alkalmazunk. Előnyös szénforrás a glicerin. Nitrogénforrásként szójalisztet, földimogyorólisztet, élesztőkivonatot, marhahúskivonatot, peptont, malátakivonatot, kukoricalekvárt, zselatint vagy kazaminosavakat alkalmazunk. Előnyös nitrogénforrás a szójaliszt. Szervetlen tápsóként alkalmazhatunk nátrium-hidrogén-foszfátot, kálium-hidrogén-foszfátot, nátrium-kloridot, kalciumkloridot, kalcium-karbonátot, kálium-nitrátot, ammónium-szulfátot vagy magnézium-szulfátot. Nyomelemként alkalmazhatunk vas, mangán, réz, cink, kobalt vagy egyéb nehézfémsókat.
Az Y-86.21022 számú kultúra tenyésztését előnyösen 28-32 °C hőmérsékleten és 6,0-8,0 pH-nál, elsősorban 29 °C hőmérsékleten (±1 °C) és körülbelül 7,0 pH-nál végezzük.
Az előnyösen 60-72 órás fermentálás eredményeként optimális hozamú, találmány szerinti antibiotikumot kapunk. A fermentálást elsősorban 68-72 órán át rázólombikokban vagy laboratóriumi fermentorokban, elárasztásos eljárással végezzük. A fermentorokban, kívánság esetén valamilyen habzásgátló szert, mint például Desmophen márkanevű, Bayer AG, Leverkusen, Németország gyártmányú poliolt alkalmazhatunk. A fermentálás előrehaladását és a találmány szerinti vegyület képződését nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) méréssel, valamint az ismert mikrobiológiai agarlemez-diffúziós mérési eljárással megvalósított Staphylococcus-fajták elleni tápközeg bioaktivitásának mérésével követjük. Előnyös kultúra a Staphylococcus aureus 3066, amely, mint ismeretes, rezisztens az irodalomban béta-laktám-antibiotikumnak nevezett meticillin ellen.
A balhimicin a tápközegtől elválasztható például megfelelő adszorbensen való közvetlen adszorpcióval. Adszorbensként alkalmazhatunk aktív szenet, Diaion HP-20 márkanevű terméket (amely egy Mitsubishi Chem., Ind., Japán gyártmányú, polisztirol-divinil-benzol-kopolimer bázisú, nagy porozitású gyanta) vagy Amberlite XAD márkanevű terméket (amely egy Rohm and Haas Co., USA gyártmányú, polisztirol-akrilsavészter-bázisú, porózus gyanta). Előnyös adszorbens a Diaion HP-20. A balhimicin adszorbensről való eluálását valamilyen mozgó fázissal, mint például vízzel, metanollal, acetonnal, acetonitrillel vagy ezek megfelelő kombinációival végezzük. Előnyös eluálószer a metanol vagy az aceton.
A fentiek szerint kapott, balhimicintartalmú aktív eluátum koncentrálható és különböző eljárásokkal tovább tisztítható. A további tisztítást végezhetjük például ismételt adszorbeálással és eluálással, aktív szén, Amberlite XAD-4 és -7 és Diaion HP-20 adszorbensek alkalmazásával; gélszűréssel, Sephadex LH-20 vagy G sorozatú gélek (Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) és víz, metanol, aceton és ezek megfelelő kombinációit tartalmazó eluálószerek alkalmazásával, ioncserélő kromatográfiás eljárással, IRC-50 (H+), pH = 6,5-8,5 és 0,1 n sósav eluálószer alkalmazásával; vagy közepes nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (MPLC), megfelelő adszorbens, mint például szilícium-oxid, módosított, mint például fordított fázisú szilícium-oxid, például oktadecil-dimetil-szililezett szilícium-oxid (RP-18) vagy semleges alumíniumoxid alkalmazásával. A tisztítást végezhetjük ellenáramú kromatográfiás eljárással, egy adott többkomponensű oldószerrendszer alkalmazásával is. Az előnyös tisztítási eljárás az ismételt MPLC-eljárás RP-18 és megfelelő adalékanyagokat, mint például sót vagy savat tartalmazó vizes metanol vagy acetonitril alkalmazásával.
A balhimicin gyógyászatilag alkalmazható sókká átalakítható. A sóképzést valamilyen ismert eljárással, szervetlen vagy szerves savakkal, mint például sósavval, kénsavval, citromsavval, tejsavval, borostyánkősavval, ecetsavval vagy trifluor-ecetsavval végezzük.
A balhimicin fiziko-kémiai és spektrális tulajdonságait az 1. táblázatban foglaljuk össze.
HU 215 146 Β
1. táblázat
Balhimicin (mint trifluor-acetát-só) fiziko-kémiai és spektrális tulajdonságai
Külalak: fehér por
Kémiai típus: a vankomicin osztályba sorolható bázikus glikopeptid
Oldhatóság: víz, dimetil-szulfoxid
Olvadáspont: > 300 °C (bomlik) [a]2D2: -23,2±2° (e=5, H2O)
Nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzés (HPLC) Retenciós idő: 4,2 perc; 4 χ (250+ 30) mm 10 pm „ODS Hypersil” kolonna; eluálószer: 0,1 tömeg% TFA-tartalmú, 18 tömeg% aceton-víz elegy; áramlási sebesség 2 ml/perc; detektálás: 220 nm; szalagsebesség: 10 mm/perc; a kromatogramot az 1. ábrán mutatjuk be.
Összegképlet: C66H73C12N9O24, nagy felbontású tömegspektrométeres meghatározással (M”H+ mért m/z: 1446, 4204 számolt m/z: 1446, 4205, 12C66'H7435Cl2i4N9i6O24 képletre)
UVmax (H2O)= 208,285 nm.
H-NMR (400 MHz, D2O, 300 K): a felvételt a 2. ábrán mutatjuk be.
A balhimicin és gyógyászatilag alkalmazható sói például szájon át való, intramuszkuláris vagy intravénás kezelésre alkalmazhatók.
A hatóanyagként balhimicint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása is a találmány oltalmi köréhez tartozik. A gyógyszerkészítményeket úgy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot összekeverjük egy vagy több gyógyászatilag elfogadható segédanyaggal és/vagy kötőanyaggal, mint például töltőanyaggal, emulgeálószerrel, csúsztatószerrel, ízesítőszerrel, színező- vagy pufferanyagokkal, és a keveréket megfelelő gyógyszerkészítménnyé, mint például tablettává, drazsévá, kapszulává vagy parenterális kezelésre alkalmas szuszpenzióvá vagy oldattá alakítjuk át.
Segédanyagként és/vagy kötőanyagként alkalmazhatunk tragakantmézgát, laktózt, talkumot, agar-agart, poliglikolokat, etanolt vagy vizet. Parenterális alkalmazásra előnyösek a vizes szuszpenziók vagy oldatok. A hatóanyag hordozó- vagy hígítószer nélkül, önmagában, például kapszulában is alkalmazható.
A kezelésre alkalmazott, találmány szerinti vegyület vagy fiziológiailag alkalmazható savaddíciós sói egy körülbelül 60 kg testtömegű felnőttre számolt mennyisége 0,1-20 g/nap, előnyösen 0,5-4 g/nap.
Az alkalmazás történhet egy vagy általában több adagban. Az egy adag hatóanyag-tartalma 50-4000 mg, előnyösen 500-2000 mg.
A következő példákat a találmány részletesebb ismertetésére mutatjuk be, az oltalmi kör korlátozása nélkül.
1. példa
Az Y-86.21022 kultúra talajból való izolálása
| Az izoláló tápközeg összetétele | |
| kukoricakeményítő: | 10,0 g |
| kazein: | 1,0 g |
| pepton: | 1,0 g |
| élesztőkivonat: | 1,0 g |
| dikálium-hidrogén-foszfát: | 0,5 g |
| agarpor: | 13,0 g |
| ionmentesített víz: | 1,0 liter |
| ionmentesben víz: | 1,0 liter |
| pH: | 7,5 |
| Talaj lemezelés és -izolálás | |
| 10 g, indiai Himalája Thamu erdőségben vett talaj- |
mintát egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 90 ml sterilizált, ionmentesített vízhez adunk, és az így kapott elegyet 2 órán át, 220 fordulat/perc sebességű forgó-rázó berendezéssel rázzuk. Ebből a talaj szuszpenzióból 10-10 5 hígítássorozatot készítünk. Az utolsó hígítás 1 ml-ét 15 cm átmérőjű steril üveg Petri-csésze közepére öntjük, és erre 50 ml 25 mg/ml amphotericin B gombaölő szerrel kiegészített, fenti izolálóközeget öntünk. Az egészet 45 °C hőmérsékletre hűtjük, és a lemezen lévő anyagokat alaposan felkavarjuk. A közeg- és talajszuszpenzió-keveréket hagyjuk leülepedni, és 28 °C (±1 °C) hőmérsékleten inkubáljuk 7 napig. A Petri-csészét időszakonként ellenőrizzük, és a növekvő mikroorganizmusok közül az Y-86.21022 kultúrát elválasztjuk.
2. példa
Az Y-86.21022 kultúra fenntartása Fenntartó közeg
Az. Y-86.21022 számú kultúrát a következő összetételű közegben tartjuk fenn.
| malátakivonat: | 10,0 g |
| élesztőkivonat: | 4,0 g |
| glükóz: | 4,0 g |
| agarpor: | 13,0 g |
| ionmentesített víz: | 1,0 liter |
| pH: | 7,0 |
| Az összetevőket melegítéssel feloldjuk, majd az így |
kapott elegyet szétosztjuk a vizsgálócsövekbe, és ez után 121 °C hőmérsékleten, 20 percig sterilizáljuk. A vizsgálócsöveket lehűtjük, és tartalmukat ferde helyzetben hagyjuk megszilárdulni. A ferde agarakat egy dróthurok segítségével becsíkozzuk az Y-86.21022 kultúrával, és 28 °C (± 1 °C) hőmérsékleten jól fejlett állapotig inkubáljuk. A jól fejlett kultúrákat hűtőszekrényben, +8 °C hőmérsékleten tartjuk.
3. példa
Az Y-86.21022 kultúra rázólombikokban való fermentálása
Az I oltóközeg összetétele glükóz: 15,0 g szójaliszt: 15,0g kukoricaáztató lé: 5,0 g kalcium-karbonát: 2,0 g ionmentesített víz: 1 liter pH: 7,0
A fenti oltóközeget 80 ml-es adagokban 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percig autoklá3
HU 215 146 Β vozzuk. A lombikokat szobahőmérsékletre hűtjük, majd mindegyik lombikot beoltjuk egy huroknyi, 2. példa szerinti jól fejlett kultúrával, és 72 órán át, 29 °C (±1 °C) hőmérsékleten, 240 fordulat/perc sebességgel forgó-rázó berendezéssel rázzuk.
| A termelőközeg összetétele | |
| glicerin: | 15,0 |
| szójaliszt: | 10,0 g |
| kalcium-karbonát: | 1,0 g |
| nátrium-klorid: | 5,0 g |
| kobalt-klorid: | 0,001 g |
| ionmentesített víz: | 1 liter |
| pH: | 7,0 |
| A termelőközeget 60 ml-es | adagokban 500 ml-es |
Erlenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percig, 121 °C hőmérsékleten autoklávozzuk. A lombikokat ez után lehűtjük, és a fenti oltókultúrával beoltjuk (1 térfogat%). A fermentálást 240 fordulat/perc sebességű forgó-rázó berendezéssel, 29 °C (±1 °C) hőmérsékleten, 68 órán át végezzük.
Az antibiotikumtermelést HPLC-eljárással, az S. aureus 3066 elleni bioaktivitást az ismert lyukdiffúziós eljárással mérjük. A betakarítás után a tenyészközeget kicentrifugáljuk, és a tényészszűrletből a balhimicint izoláljuk, majd a 4. példa szerinti eljárással tisztítjuk.
4. példa
Az Y-86.21022 kultúra fermentorokban való tenyésztése
Oltókultúra előállítása rázólombikban
A 3. példa szerinti oltóközeget 160 ml-es adagokban 1 literes Erlenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percig autoklávozzuk. Az oltókultúrát ezekben a lombikokban tenyésztjük a 3. példa szerint.
| Üzemi méretű fermentálás | |
| A termelőközeg összetétele | |
| glicerin: | 15,0 g |
| szójaliszt: | 10,0 g |
| kalcium-karbonát: | 1,0 g |
| nátrium-klorid: | 5,0 g |
| ionmentesített víz: | 1 liter |
| pH: | 6,8 |
| 150 literes Marubishi fermentorban 100 liter terme- |
lőközeget és 30 ml Desmophen habzásgátló szert sterilizálunk in situ 24 percen keresztül, 121 °C hőmérsékleten, majd 29 °C (± 1 °C) hőmérsékletre hűtjük, és beoltjuk 3 liter, fentiek szerinti oltókultúrával.
A fermentálást a következő paraméterek mellett végezzük.
hőmérséklet: 29°C(±1°C) keverés: 110-120 fordulat/perc levegőzés: 90-100 epm betakarítás ideje: 69-72 óra
Az antibiotikumtermelést az S. aureus 3066 elleni bioaktivitásméréssel követjük. A fermentáció megszakításakor a tenyészközeg pH-ja 6,0-7,0. A leszedés után a tenyészközeget kicentrifugáljuk, és a tenyészszűrletből a balhimicin antibiotikumot a következő eljárással izoláljuk és tisztítjuk.
Balhimicinizolálás és -tisztítás:
A 4. példa szerinti eljárással kapott (leszedett) tápközeg 100 literét a micélium elválasztására kicentrifugáljuk. A kapott 6,5 pH-jú, 80 liter tápszűrletet egy 5 literes Diaion HP-20 kolonnán hajtjuk át víz segítségével. A kolonnát 40 liter ionmentesített vízzel mossuk a mosófolyadék elszíntelenedéséig. A kolonnát ez után 8 liter 1 mol/l vizes nátrium-klorid-oldattal, majd 10 liter ionmentesített vízzel mossuk. Ezt a folyamatot még egyszer megismételjük. A kolonnát ez után 9 liter 30 tömeg%-os vizes metil-alkohol-oldattal mossuk, és végül 51 liter 75 tömeg%-os vizes metil-alkohol-oldattal eluáljuk, és 1 literes frakciókat szedünk. Az eluátumok balhimicintartalmát a meticillinrezisztens Staphylococcus aureus 3066 mikroorganizmus elleni aktivitásának mérésével figyeljük.
Az egyesített eluátumokat vákuumban, 40-45%-on körülbelül 1 literre koncentráljuk, majd liofilizáljuk, és így 38 g por alakú, nyers balhimicint kapunk.
Ezt a nyersterméket 10 g-os részletekben közepes nyomású folyadékkromatográfiás (MDLC) eljárásnak vetjük alá. A kromatografálást egy 1,2 liter ágytérfogatü, 6,5x55 cm-es üvegkolonnába töltött RP-18 tölteten végezzük. A kolonnát 2 liter 0,1 tömeg%-os, vizes trifluor-ecetsav- (TFA) oldattal, majd 4 liter 5 tömeg%os, vizes acetonitriloldattal 9 liter 7,5 tömeg%-os, vizes acetonitriloldattal, és 24,5 1 10 tömeg%-os, vizes acetonitriloldattal eluáljuk, amelyek 0,1 tömeg% TFA-at tartalmaznak. A balhimicin a 10 tömeg%-os acetonitriloldatban eluálódik, az eluátumokat 500 ml-es frakciókban szedjük, és tartalmukat in vitro antibiotikus aktivitásméréssel követjük.
Az egyesített aktív eluátumokat nagyvákuumban, 40 °C hőmérsékleten koncentráljuk, majd liofilizáljuk. így 2,1 g halványsárga, por alakú balhimicint kapunk. Az összesen 30 g nyerstermékből összesen 6,3 g féltiszta balhimicint kapunk.
A 6,3 g féltiszta terméket 2,1 g-os részletekben egy 500 ml ágytérfogatú, 6,0x45 mm-es üvegkolonnába töltött RP-18 tölteten MPLC eljárással tovább tisztítjuk.
A kolonnát 1 liter 0,1 tömeg%-os, vizes TFAoldattal, majd 2 és 1,5 liter 5, illetve 7,5 tömeg%-os, 0,1 tömeg% TFA-at tartalmazó vizes acetonitriloldattal eluáljuk. A balhimicin a 10 tömeg%-os, 0,1 tömeg% TFA-at tartalmazó vizes acetonitriloldatban eluálódik, az eiuátumot 250 ml-es frakciókban szedjük, és tartalmukat 220 nm hullámhosszon mérő UV-detektorral és in vitro antibiotikus aktivitásméréssel követjük. Az összesen 8 liter aktív eiuátumot nagyvákuumban, 40 °C hőmérsékleten koncentráljuk, majd liofilizáljuk. így 600 mg, fehér, por alakú, trifluor-acetát formájú balhimicint kapunk.
A 6,3 g féltiszta termékből így 1,8 g tiszta balhimicint állítunk elő.
A balhimicin biológiai tulajdonságai
A balhimicin különböző baktériumok szaporodásának gátlásához szükséges, MIC-értékben megadott mennyiségét a 2. táblázatban foglaljuk össze.
HU 215 146 Β
2. táblázat
Balhimicin-trifluor-acetát minimum gátló koncentrációja (minimum inhibiting concentrations=MIC)
| Vizsgált mikroorganizmus | MIC (mg/ml) |
| S. aureus 209 P | 0,39 |
| S. aureus (MethR) | 0,39 |
| S. aureus 3066 (MethR) | 0,78 |
| S. aureus E 690 (MethR) | 0,39 |
| Streptococcus faecalis ATCC 29212 | 1,56 |
| S. faec. D 21777 | 0,78 |
| S. faec. D Endococcen | 0,78 |
| S. faecium D-59 | 1,56 |
| S. faecium D-65 | 0,78 |
| Staph. epidermidis 178 | 1,56 |
| S. epi. 825 | 3,12 |
| S. epi. 823 (Teicoplanin) | 12,5 |
| Staph. haemylyticus 712 | 1,56 |
| S. haemo. 809 (Teicoplanin) | 6,25 |
| E. coli 9632 | >100 |
| P. vulgáris | >100 |
| Ps. aeruginosa | >100 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás az (I) képletű és C66H73C12N9O24 összegképletű balhimicin előállítására, azzal jellemezve, hogy az Y-86.21022 számú Actinomycetes fajt (DSM 5908), mutánsait és/vagy variánsait aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, majd a képződött balhimicint a tápközegből ismert módon elválasztjuk és tisztítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 28-32 °C hőmérsékleten, pH = 6-8 értéken végezzük.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 29 °C (± 1 °C) hőmérsékleten és körülbelül pH=7 értéken végezzük.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 68-72 óráig végezzük.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást elárasztásos fermentálással végezzük.
- 6. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított vegyületet gyógyszerészeti hordozóanyaggal és adott esetben gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük, és a keveréket adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90114471 | 1990-07-27 | ||
| EP90119883 | 1990-10-17 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU912516D0 HU912516D0 (en) | 1992-01-28 |
| HUT61606A HUT61606A (en) | 1993-01-28 |
| HU215146B true HU215146B (hu) | 2000-03-28 |
Family
ID=26125378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU516/91A HU215146B (hu) | 1990-07-27 | 1991-07-26 | Eljárás új balhimicin antibiotikum és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0468504B1 (hu) |
| JP (1) | JP3119680B2 (hu) |
| KR (1) | KR100221687B1 (hu) |
| AT (1) | ATE159261T1 (hu) |
| AU (1) | AU648570B2 (hu) |
| CA (1) | CA2047997C (hu) |
| CY (1) | CY2114B1 (hu) |
| CZ (1) | CZ282296B6 (hu) |
| DE (1) | DE69127935T2 (hu) |
| DK (1) | DK0468504T3 (hu) |
| ES (1) | ES2108022T3 (hu) |
| FI (1) | FI101402B (hu) |
| GR (1) | GR3025433T3 (hu) |
| HR (1) | HRP940710B1 (hu) |
| HU (1) | HU215146B (hu) |
| IE (1) | IE912643A1 (hu) |
| IL (1) | IL98958A0 (hu) |
| IN (1) | IN171883B (hu) |
| NO (1) | NO305132B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ239130A (hu) |
| PT (1) | PT98444B (hu) |
| RU (1) | RU2043418C1 (hu) |
| YU (1) | YU48601B (hu) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078223B2 (en) | 1999-02-03 | 2006-07-18 | Teva Gyógyszergyár Zártkörüen Müködö Részvénytársaság | Process for the preparation of pseudomonic acid a antibiotic by microbiological method |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5721208A (en) * | 1991-06-29 | 1998-02-24 | Hoechst Aktiengesellschaft | Glycopeptides a process for their preparation and their use |
| TW213468B (hu) * | 1991-06-29 | 1993-09-21 | Hoechst Ag | |
| DE19523394A1 (de) * | 1995-06-28 | 1997-01-09 | Hoechst Ag | Verwendung von Balhimycin zur Leistungssteigerung bei Tieren sowie leistungssteigernde Mittel |
| DE19926770A1 (de) | 1999-06-11 | 2000-12-14 | Basf Ag | Nukleinsäurefragment und Vektor, enthaltend eine Halogenase, sowie ein Verfahren zur Halogenierung chemischer Verbindungen |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3067099A (en) * | 1955-09-16 | 1962-12-04 | Lilly Co Eli | Vancomycin and method for its preparation |
-
1989
- 1989-12-22 IN IN353/BOM/89A patent/IN171883B/en unknown
-
1991
- 1991-07-22 YU YU128491A patent/YU48601B/sh unknown
- 1991-07-25 CZ CS912334A patent/CZ282296B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-25 NZ NZ239130A patent/NZ239130A/xx unknown
- 1991-07-25 AT AT91112517T patent/ATE159261T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-25 KR KR1019910012751A patent/KR100221687B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-25 DK DK91112517.7T patent/DK0468504T3/da active
- 1991-07-25 DE DE69127935T patent/DE69127935T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-25 ES ES91112517T patent/ES2108022T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-25 PT PT98444A patent/PT98444B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-25 RU SU5001142/13A patent/RU2043418C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-07-25 EP EP91112517A patent/EP0468504B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-25 IL IL98958A patent/IL98958A0/xx unknown
- 1991-07-25 FI FI913569A patent/FI101402B/fi active
- 1991-07-26 NO NO912931A patent/NO305132B1/no unknown
- 1991-07-26 HU HU516/91A patent/HU215146B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-07-26 CA CA002047997A patent/CA2047997C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-26 AU AU81453/91A patent/AU648570B2/en not_active Ceased
- 1991-07-26 JP JP03186782A patent/JP3119680B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-26 IE IE264391A patent/IE912643A1/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-10-20 HR HRP-1284/91 patent/HRP940710B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-11-19 GR GR970403078T patent/GR3025433T3/el unknown
-
1998
- 1998-09-29 CY CY9800031A patent/CY2114B1/xx unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078223B2 (en) | 1999-02-03 | 2006-07-18 | Teva Gyógyszergyár Zártkörüen Müködö Részvénytársaság | Process for the preparation of pseudomonic acid a antibiotic by microbiological method |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0763387B2 (ja) | テイコプラニン‐様誘導体 | |
| HU215146B (hu) | Eljárás új balhimicin antibiotikum és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására | |
| US8007789B2 (en) | Antibiotics GE 81112 factors A, B, B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
| EP1129208B1 (en) | Vancoresmycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical | |
| US5451570A (en) | Antibiotic, balhimycin, a process for its production and its use as pharmaceutical | |
| EP0818464B1 (en) | Methylsulfomycin l, a process for its production and its use | |
| KR860001497B1 (ko) | 항생제 a51568 인자 a 및 b의 제조방법 | |
| US5459141A (en) | Compounds 31668P and 31668U, a process for their production and their use | |
| US4895864A (en) | Antibiotic TAN-950A, its production and use | |
| EP0356894A1 (en) | A novel glycopeptide antibiotic Decaplanin, a process for its production and its use as medicament |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |