NO305132B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av Balhimycin og biologisk ren kultur - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av Balhimycin fra en Actinomycete-kultur nr. Hoechst Lndia Y-86.21022 og en biologisk ren kultur. Balhimycin kan bli beskrevet som et antibakterielt antibiotika som hører til glykopeptidklassen. Glykopeptid-antibiotika er sneverspektrede antibiotika som hovedsakelig virker mot gram positive bakterier. Deres aktivitet overfor methicillinresistente S. aureus (MRSA) stammer gjør dem til et verdifullt medikament for behandling av infeksjoner forårsaket av MRSA. De er også nyttige som vekstpromotere innen veterinærområdet. Glykopeptidantibiotika er beskrevet av Topics in Antibiotic Chemistry, vol. 5, side 119 (1980), Journal of Antibiotics, vol. 38, side 561 (1985), Journal of Antibiotics vol. 40, side 924 (1987), Journal of Organic Chemistry, vol. 54, side 983 (1989).

Balhimycin beskrevet heri, er forskjellig fra alle kjente glykopeptid-antibiotika i molekylær formel. En "Chemical Abstracts on-line search" utført med granskning på molekyl-vekt og molekylær formel, bekrefter nyheten til forbindelsen.

Mikroorganismen, kultur nr. Hoechst India Limited, Y-86.21022, nedenfor betegnet Y-86.21022, anvendt for produksjon av Balhimycin, ble isolert fra en jordprøve tatt fra skogen Thamu, Himalaya, India. Mikroorganismen, Y-86.21022, hører til ordenen Actinomycetales. Mikroorganismen Y-86.21022, er blitt deponert til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under betingelsene ifølge Budapest-avtalen av 6. april 1990, og mottok nr. DSM 5908.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av Balhimycin, en forbindelse med molekylær formel C^^<H>73Cl2<N>g<0>24med strukturformel

og med følgende fysikalske data:

Beskaffenhet : Hvitt pulver

Kjemisk type : Basisk glykopeptid fra vancomycingassen Oppløselighet : Vann, dimetylsulfoksid

Sm.p. : 300°C (dekomposisjon)

[a]g<2>: -23,2 ± 2°C (C = 5, H20)

Høytrykks-

væskekromatograf i

Kromatografi (HPLC)

Retensjonstid: 4,2 minutter, 4 x (250 + 30 ) mm 10p "ODS-•Hypersil"-kolonne, elueringsmiddel 18% acetonitril i vann, inneholdende 0,1$ TFA, strømningshastighet 2 ml/minutt, deteksjon 220 nm, karthastighet 10 mm/minutt, figur 1 til vedlagte tegninger Molekylær formel : C5^H73Cl2Ng024

bestemt ved høyresolusjons-FAB-masse-spektrometri (M + H+ målt m/z 1446.4204, beregnet m/z 1446,4205

for 12C66<lH>74<35>cl2<1>4Ng16o24)

U<V>max (H20):208, 285 nm

<!>h NMR (400 MHz D20,

300K) : Figur 2,

kjennetegnet ved at den omfatter Actino-mycete-art Y-86.21022 (DSM 5908) eller mutanter derav med vesentlig samme morfologiske og biologiske egenskaper, dyrkes under aerobe betingelser i et naeringsmedium som inneholder kilder av karbon og nitrogen, uorganiske næringssalter og sporelementer, idet dyrkingen utføres ved et temperaturintervall på 28-32° C og ved en pH på 6-8, og forbindelsen blir isolert og renset fra kulturkraften på vanlig måte.

Det er også beskrevet en biologisk ren kultur kjennetegnet ved at den er den er Actinomycete-stammen Y-86.21022 (DSM 5908).

Nevnte fremgangsmåte omfatter følgelig dyrking av kulturen Y-86.21022, mutanter og varianter under aerobe betingelser i et næringsmedium inneholdende kilder av karbon og nitrogen, uorganiske næringssalter og sporelementer og isolering og rensing av nevnte antibiotika fra kulturkraften. Karbonkilde-ne kan være stivelse, glukose, sukrose, dekstrin, fruktose, molasse, glycerol, laktose eller galaktose. Foretrukket karbonkilde er glyserol. Nitrogenkilder kan være soya-bønnemel, pianøttmel, gjærekstrakt, biffekstrakt, pepton, maltekstrakt, maisuttrekksvæske, gelatin eller kasaminosyrer. Den foretrukne nitrogenkilden er soyabønnemel. Uorganiske næringssalter kan være natriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogen-fosfat, natriumklorid, kalsiumklorid, kalsiumkarbonat, kaliumnitrat, ammoniumsulfat eller magnesiumsulfat. Sporelementer kan være salter av jern, mangan, kobber, sink eller kobolt eller andre tungmetaller.

Dyrkning av kultur nr. Y-86.21022 blir fortrinnsvis utført ved temperaturer mellom 28 og 32° C og pH mellom 6,0 og 8,0. Kultur nr. Y-86.21022 blir fortrinnsvis dyrket ved 29°C (24± 1°C) og pH omtrent 7,0.

Fermenteringen blir fortrinnsvis utført i 60 til 72 timer når optimalt utbytte av antibiotika blir oppnådd. Fermenteringen blir spesielt utført i 68-72 timer under nedsenkende betingelser i risteflasker samt i laboratorie-fermentorer. Om ønskelig, kan et antiskum-middel så som Desmophen® (Polyols,

Bayer-AG Leverkusen) West Germany) anvendt i fermentorene.

i Forløpet av fermenteringen og dannelsen av forbindelsen kan bli detektert ved høytrykks væskekromtografi (HPLC) og ved måling av bioaktiviteten til kulturkraften overfor Staphylococci-arter ved hjelp av den kjente mikrobielle agarskål-diffusjonsanalysemetoden. Den foretrukne kulturen er Staphylococcus aureus 3066, kjent for å være resistent overfor Methicillin, et beta-laktam-antibiotika beskrevet i 1 itteraturen.

Balhimycin kan for eksempel bli isolert fra kulturkraften ved direkte adsorpsjon på egnede adsorberingsmidler som aktivert karbon, Diaion HP-20" (harpiks med høy porøsitet basert på en polystyren-divinylbenzen-kopolymer, Mitshubishi Chemical Industries, Japan) eller Amberlite °XAD (porøs harpiks basert på polystyren-akrylsyre-ester, Rohm & Haas Co., U.S.A.). Det foretrukne adsorberingsmidlet er Diaion HP-20. Balhimycin kan bli eluert ut av disse adsorberingsmidlene ved anvendelse av mobile faser så som vann, metanol, aceton, acetonitril eller egnede kombinasjoner derav. Foretrukne elueringsmidler er vandig metanol eller aceton.

Overnevnte aktive eluater inneholdende Balhimycin kan bli konsentrert, og kan bli ytterligere renset på et antall måter. For eksempel readsorpsjon og elueringsprosesser med aktivert trekull, Amberlite XAD-4 og 7, Diaion HP-20; gelfiltrering med Sephadex LH-20", eller G seriedeler (Pharmacia Fine Chemicals AB, Sverige) ved anvendelse av vann, metanol, aceton eller hensiktsmessige kombinasjoner derav som elueringsmidler; ionebytte-kromatografi med IRC-50 (H<+>) ved pH-område 6,5-8,5 ved anvendelse av 0,1 N HC1 som elueringsmiddel; eller middels trykk væskekromtografi (MPLC) på egnede adsorberingsmidler som silika, modifisert silika så som revers-fase-silika, for eksempel oktadecyldimetylsilylert silika (RP-18), nøytral aluminiumoksid. Videre kan motstrøms-kromatografi med et gitt multikomponent oppløsningsmiddel-system også bli anvendt for dette. Foretrukket rensingsmetode omfatter gjentatt MPLC på RP-18 ved anvendelse av vandig metanol eller acetonitril inneholdende egnede tilsetningsstoffer så som salt eller syre, som elueringsmiddel.

Balhimycin kan bli omdannet til farmakologisk akseptable salter derav, for eksempel med uorganiske og organiske syrer så som HC1, H2SO4, sitronsyre, melkesyre, ravsyre, eddiksyre, trifluoreddiksyre på kjent måte.

Fysisk-kjemiske og spektrale egenskaper til Balhimycin er vist i tabell 1 nedenfor.

Balhimycin og fysiologisk tolererte salter derav kan for eksempel bli administrert oralt, intramuskulært eller intravenøst. Farmasøytiske stoffer som inneholder Balhimycin som aktiv forbindelse er også gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse. De kan bli fremstilt ved å blande nevnte forbindelse med en eller flere farmakologisk tolererte hjelpestoffer og/eller tilsetningsstoffer så som for eksempel fyllstoffer, emulgeringsmidler, smøremidler, maskerende smakstoffer, farvestoffer eller bufferforbindelser og omdannet til en egnet farmasøytisk form så som for eksempel tabletter, belagte tabletter, kapsler eller en suspensjon eller oppløsning egnet for parenteral administrasjon.

Eksempler på hjelpestoffer og/eller tilsetningsstoffer som kan bli nevnt, er tragakant, laktose, talk, agar-agar, polyglykoler, etanol og vann. Egnet og foretrukket for parenteral administrasjon er suspensjoner eller oppløsninger i vann. Det er også mulig å administrere de aktive for-bindelsene som de er uten bærere eller fortynningsmidler i en egnet form, for eksempel i kapsler.

Egnede doser av forbindelsen eller fysiologisk tolererte syreaddisjonssalter er omtrent 0,1 til 20 g/dag, fortrinnsvis 0,5 til 4 g/dag, for en voksen med kroppsvekt på omtrent 60 kg.

Det er mulig å administrere enkeltdoser eller generelt multiple doser, idet det er mulig for den enkelte dosen å inneholde den aktive forbindels i en mengde på omtrent 50 til omtrent 4.000 mg, fortrinnsvis omtrent 500 til 2.000 mg.

EKSEMPEL 1

Isolering av kulturen Y- 86. 21022 fra lord

a) Sammensetning av næringsisolasjonsmedium

b) Jordutsåing og isolering

10 g jord samlet fra skogen Thamu, Himalaya, India, ble

tilsatt til 90 ml sterilisert demineralisert vann i en 250 ml Erlenmeyer-flaske som ble ristet i 2 timer på en roterende rister (220 rpm). Ovennevnte jordsuspensjon ble deretter fortynnet i serie i trinn på 10 opptil (IO-<5>). Fra den siste fortynningen ble 1 ml suspensjon plassert i midten av en steril glass-petriskål (15 cm diameter) hvor det deretter ble helt omtrent 50 ml av ovennevnte isoleringsmedium supp-lementert med 25 mcg/ml amfotericin B som antisoppmiddel og avkjølt til 45°C og skålen ble grundig snurret. Blandingen av oljesuspensjon og medium ble latt stå og inkubert ved 28°C (± 1 °C) i 7 dager. Petri-skålen ble observert periodisk og kulturen nr. Y-86.21022 ble isolert fra de dyrkende mikroor-ganismene .

EKSEMPEL 2

Opprettholdelse av kultur Y- 86. 21022 Sammensetning av opprettholdelsesmediet

Kultur nr. Y-86.21022 ble opprettholdt i følgende medium

Etter oppløsning av ingrediensene grundig ved oppvarming, ble de fordelt i reagensrør og deretter sterilisert ved 121°C i 20 minutter. Reagensrørene ble avkjølt og tillatt stivnet i en hellende posisjon. Den hellende agaren ble utstrøket med veksten av kultur nr. Y-86.21022 ved hjelp av en ståltrådløk-ke og inkubert ved 28° C (± 1°C) helt til god vekst ble observert. De godt voksende kulturene ble lagret i kjøleskap ved + 8°C.

EKSEMPEL 3

Fermentering av kultur Y- 86. 21022 i risteflasker Sammensetning av såmedium I

Ovennevnte såmedium ble fordelt i mengder på 80 ml i 500 ml Erlenmeyer-flasker og autoklavert i 20 minutter. Flaskene ble avkjølt til romtemperatur og hver flaske ble deretter inokulert med en full løkke av ovennevnte voksende kultur ifølge eksempel 2 og ristet på en roterende rister i 72 timer ved 240 rpm ved 29°C (± 1°C) for å tilveiebringe såkultur.

Sammensetning av produksjonsmediet

Produksjonsmediet ble fordelt i mengder på 60 ml i 500 ml Erlenmeyer-flasker og autoklavert ved 121°C i 20 minutter. Flaskene ble avkjølt og deretter inokulert med overnevnte såkultur (1$ v/v). Fermenteringen ble utført på en roterende rister ved 240 rpm og ved en temperatur på 29 °C (± 1 °C) i 68 timer.

Produksjonen av antibiotika ble bestemt ved HPLC og ved testing av bioaktiviteten av S. aureus 3066 ved anvendelse av brønndiffusjonsmetoden på en kjent måte. Etter høsting ble kulturkraften sentrifugert og Balhimycin isolert fra kulturfiltratet og renset som beskrevet i eksempel 4.

EKSEMPEL 4

Dyrking av kulturen nr. Y- 86. 21022 i fermentorer

Preparering av såkultur i risteflasker

Såmediet ifølge eksempel 3 ble fordelt i 160 ml mengder ill Erlenmeyer-flasker og autoklavert i 20 minutter. Såkulturen ble dyrket i disse flaskene som beskrevet i eksempel 3.

Fermentering i stor skala

Sammensetning av produksjonsmediet

100 liter av produksjonsmediet i 150 liter Marubishi-fermentor sammen med30mlDesmophen som antiskummiddel, ble sterilisert in situ i 24 minutter ved 121 'C, avkjølt til 29°

± rc og tilsådd med 3 liter såkultur nevnt ovenfor.

Fermenteringen ble utført med følgende parametere:

Produksjon av antibiotika ble registrert ved bioaktiviteten overfor S. aureus 3066. Når fermentasjonen ble avsluttet, var pH til kulturkraften 6,0-7,0. Kulturkraften ble sentrifugert etter høsting og antibiotikaet Balhimycin ble isolert og renset fra kulturfiltratet som beskrevet nedenfor.

Isolering og rensing av Balhimycin

Omtrent 100 1 av den høstede kraften, oppnådd i eksempel 4, ble separert fra mycelet ved sentrifugering. Det resulterende kraftf iltratet (80 1, pH 6,5) ble sendt igjennom en 5 1 kolonne av 1 Diaion HP-20, i vann. Kolonnen ble vasket med 40 1 demineralisert vann, hvorpå vaskingene var farveløse. Kolonnen ble deretter vasket med 8 1 1 M vandig NaCl etterfulgt av 10 1 demineralisert vann. Denne fremgangsmåten ble gjentatt én gang. Kolonnen ble deretter vasket med 9 1 30$ MeOH i vann og til slutt eluert med 51 1 85$ MeOH i vann oppsamlet i fraksjoner på 1 1. Tilstedeværelse av Balhimycin i disse eluatene ble registrert ved dets aktivitet overfor Staphylococcus aureus 3066 som er en methicillin-resistent organisme. De kombinerte aktive eluatene ble konsentrert under vakuum ved 40-45° C til omtrent 1 1 som deretter ble lyofilisert for å tilveiebringe 38 g rå Balhimycin som et pulver.

Overnevnte råmateriale ble deretter utsatt i tre batcher med 10 g hver for middels trykk væskekromatografi (MPLC) på RP-18 pakket i en 6,5 x 55 cm glasskolonne som har et sjiktvolum på 1,2 1. Kolonnen ble eluert med 2 1 vann inneholdende 0,1$ trifluoreddiksyre (TFA), etterfulgt av eluering med 5% acetonitril (4 1), 7,5$ acetonitril 9 og 10% acetonitril (24,5 1) i vann inneholdende 0,1$ TFA. Balhimycin eluerte ut i 10% acetonitrileluater som ble samlet 1 fraksjoner på 500 ml og registrert ved in vitro antibiotika-aktivitet. De kombinerte aktive eluater ble konsentrert under høyt vakuum ved 40°C og deretter lyofilisert for å tilveiebringe 2,1 g Balhimycin som et svakt gult pulver. Tre slike prosesser ga totalt 6,3 g semi-rent Balhimycin fra 30 g råmateriale.

6,3 g semi-ren Balhimycin oppnådd på denne måten, ble til slutt renset ved å utsettes i tre batcher med 2,1 g hver for MPLC på RP-18 i en 6,0 x 45 mm glass-kolonne med et sjiktvolum på 500 ml . Kolonnen ble vasket med 1 1 vann inneholdende 0, 1% TFA, etterfulgt av 2 1 og 1,5 1 556 og 7, 5% acetonitril i vann inneholdende 0, 1% TFA. Balhimycin eluerte ut i 10$ acetonitril i vann inneholdende 0, 1% TFA, fraksjoner hver på 250 m,l ble registrert både ved en UV-detektor ved 220 nm og ved in-vitro antibiotisk analyse. Totalt 8 1 aktive eluater ble konsentrert under høyt vakuum ved 40°C etterfulgt av lyofilisering for å tilveiebringe 600 mg Balhimycin som et trifluoracetatsalt i form av hvitt pulver. Fra 6,3 g semi-rent Balhimycin ble 1,8 g ren Balhimycin produsert.

Biologiske egenskaper til Balhimycin

Den antibakterielle aktiviteten til Balhimycin som MIC-verdier nødvendig for å inhibere veksten av forskjellige bakterier, er vist i tabell II.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av Balhimycin, en forbindelse med molekylær formel C^HysC^NgC^ med strukturformel

og med følgende fysikalske data: Beskaffenhet : Hvitt pulver Kjemisk type : Basisk glykopeptid fra vancomycingassen Oppløselighet : Vann, dimetylsulfoksid Sm.p. : 300°C (dekomposisjon) [a]g2 : -23,2 ± 2°C (C = 5, H20) Høytrykks- væskekromatograf i Kromatografi (HPLC) Retensjonstid: 4,2 minutter, 4 x (250 + 30) mm IOjj "ODS- •Hypersil"-kolonne, elueringsmiddel 18% acetonitril i vann, inneholdende 0, 1% TFA, strømningshastighet 2 ml/minutt, deteksjon 220 nm, karthastighet 10 mm/minutt, figur 1 til vedlagte tegninger Molekylær formel : C5£,Hy3Cl2Ng024 bestemt ved høyresolusjons-FAB-masse spektrometri (M + H+ målt m/z 1446.4204, beregnet m/z 1446,4205 for 1<2>C66<l>H74<35>cl21<4>N9<160>2<4>)<uv>max(H2°) : 208• 285 nm XE NMR (400 MHz D20, 300K) : Figur 2, karakterisert vedat den omfatter Actino-mycete-art Y-86.21022 (DSM 5908) eller mutanter derav med vesentlig samme morfologiske og biologiske egenskaper, dyrkes under aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder kilder av karbon og nitrogen, uorganiske næringssalter og sporelementer, idet dyrkingen utføres ved et temperaturintervall på 28-32° C og ved en pH på 6-8, og forbindelsen blir isolert og renset fra kulturkraften på vanlig måte.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at dyrkingen utføres ved 29° C (± 1°C) og en pH på omtrent 7,0.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat fermenteringen utføres i 68 til 72 timer.

4 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat fermenteringen utføres som nedsenket fermentering.

5. Biologisk ren kultur,karakterisert vedat den er Actinomycete-stammen Y-86.21022 (DSM 5908).