JPH0368583A - 新規微生物変換物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規免疫抑制剤Ｌ−６８２，９９２およびその
製造を目的とした微生物アクチノプラナセードｇ　ｐ　
１（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ　ｓｐ、）（ＭＡ
６５５９）ＡＴＣＣＮｏ、５３７７１を利用した新規な
発酵工程に関するものである。この工程はＬ−６７９，
９３４のＣ−１３位と３１位のメトキシ基の脱メチル化
が起こり、その結果テトラヒドロピラン環のテトラヒド
ロフラン環への構造変化が起こるような条件下で微生物
とＬ−６７９，９３４を培養することを含む、また、ヒ
トにおける自己免疫疾患、感染性疾患の治療および／ま
たは組織移植に対する拒絶反応の防止を目的としたヒト
における使用法も開示する。

１９８３年、ＵＳ　　ＦＤＡはシクロスポリンを認可し
、この非常に強力な抗−拒絶反応薬は組織移植手術分野
を御所させた。その作用機作は、免疫系が移植片の外来
タンパク質を拒絶するために生来そなわる膨大な防御担
当細胞に動員をかけることを阻止することにある。

この薬剤が組織移植拒絶反応を抑える効果が強ければ強
いほど、多くのケースで重篤な腎障害、肝臓障害、潰瘍
をひきおこすという欠点がある。

引用することによりここにその内容を組み入れるフジサ
ワのＥＰＯ公開Ｎｏ、０１８４１６２において、シクロ
スポリンより１００倍効力が強いといわれる新規マクロ
ライド免疫抑制剤ＦＫ−５０６が記載されている。この
マクロライドはストレプトミセス・ツクバエンシスの特
定の菌株が発酵生産するものである。

また、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス亜種ヤクシ
マエンシスが生産する近縁のマクロライド免疫抑制剤Ｆ
Ｋ−５２０についても記載されている。

Ｔ、アライのＵＳＰ３，２４４，５９２にはストレプト
ミセス・ヒグロスコピクスの変種アスコミセチクスを培
養して抗真菌剤“アスコマイシン”を生産することが記
載されている。

しかしながら、シクロスポリン型の副作用が実質的にな
いといえる免疫抑制剤の生産については全く報告がない
、より新しく、副作用が少なくてより安全な薬剤がこの
分野において日夜探求されている。

微生物のアクチノプラナセートｓｐ、ＡＴＣＣＮｏ、５
３７７１をマクロライド免疫抑制剤Ｌ−６７９，９３４
　　とともに窒素栄養源を含む炭水化物培地中で好気的
に深部液体培養し、Ｌ−６７９，９３４のＣ−３１位と
Ｃ−１３位の選択的脱メチル化のためにｐＨ７付近で操
作することにより、新しい免疫抑制剤Ｌ−６８２，９９
２　　が発酵生産されることが見出されている。

一般的に約２７℃で２４時間を超える長時間発酵を行な
わせると、Ｌ−６８３，９９２即ち、ＦＫ−５０６のＣ
−１３とＣ−３１位の２つの脱メチル化により環の再構
成が起こった所期の産物が得られるが、この産物は培養
液中では少量で、大部分はＦＫ−５０６のＣ−３１位が
脱メチルされたＬ−６８２，９９３である。この物質は
継続中の米国特許出願Ｎｏ、２１３，０６３　（案件番
号Ｎｏ、１７７５４、登録１９８８年６月２９日、Ｓ、
Ｔ、Ｃｈｅｎ、　Ｅ。

Ｓ　、Ｉｎａｍｉｎｓ、　Ｂ　、Ｈ，Ａｒ１５ｏｎ、　
Ｌ　、　Ｓ　、　Ｗｉｃｋｅｒ。

メルクに譲渡）に開示されており、ここに引用すること
によりその内容を組み入れた。

このＬ−６８２，９９２は免疫抑制作用を示す、即ち、
本文中で“Ｔ細胞増殖アッセイ”というカルシウムイオ
ンフォア（イオノマイシン）とホルボールミリステート
アセテート（ＰＭＡ）を誘発剤とするＴ細胞刺激アッセ
イにより示されるＴ細胞活性化阻害が陽性である。

このアッセイの原理はイオノマイシンとＰＭＡの組合わ
せでＴ細胞を刺激し、その増殖を測定するものである。

このアッセイで陽性なサンプルとはＴ細胞増殖を阻害す
るものであり、阻害はトリチウムラベルしたチミジンの
取込み減少で示される。

本発明によれば、アクチノプラナセート種の工菌株ＭＡ
６５５９をＬ−６７９，９３４とともに窒素栄養源を含
む炭水化物液体培地中で産物Ｌ−６８２，９９２　　が
つくられるのに十分な時間好気的に深部培養するステッ
プを含む、Ｌ−６８２，９９２として同定される免疫抑
制剤の製造方法が提供される。

さらに上記工程で製造され、Ｔ細胞増殖試験においてＴ
細胞活性化阻害が陽性を示し、図１において同定される
とおりの陽子核磁気共鳴スペクトルを示す、新規な免疫
抑制剤Ｌ−６８２，９９２が提供される。

また治療上有効量のＬ−６８２，９９２を含み、薬学的
に許容し得る。実質的に毒性のないキャリヤーあるいは
賦形剤と組合わせた製薬配合物が提供される。

さらに、ヒトにおける組織移植拒絶反応や、自己免疫疾
患あるいは感染性疾患の治療のために、治療有効量のＬ
−６８２，９９２を投与することを含む使用法が提供さ
れる。

本発明はＬ−６８２，９９２を生産するためにアクチノ
プラナーセト種ＭＡ６５５９にＬ−６７９，９３４存在
下で発酵を行なわせることを含むものである。本微生物
は現在アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ）　（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、　Ｐａｒｋｌａｖｎｄｒｉｖｅ１２３０１）にＡＴＣ
ＣＮｏ、５３７７１として、およびメルクカルチャーコ
レクション（Ｍｅｒｋ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ）にュージャージー州、　Ｒａｈｗａｙ）にＭ
Ａ６５５９として限定寄託しである。形態学的、培養、
生物学的および生理学的特徴を含む物理的特徴と分類学
について以下簡単に記載する。

これまでに行なわれた分類学的解析に基づき、本菌株は
仮りにアクチノミセス目、アクチノプラナセス科に属す
とされている最終的に本菌の属と種を決定するために更
に詳細な分類学的特徴を調査中である。

本菌はトリプチケースソイ寒天培地（２８℃および３７
℃）、酵母・麦芽エキス寒天培地、グリセリン・アスパ
ラギン寒天培地、無機塩・デンプン寒天培地、オートミ
ール寒天培地、ツアペックドックス寒天培地、ツアペッ
ク溶液寒天培地、ツアペック溶液・ペプトン寒天培地、
ベネット寒天培地（以上２８℃）を含む通常の培地によ
く生育する。

星豊　　本菌は直径０．２〜０．４μｍの分校した糸状
菌糸形で発育する。コロニーは不透明で隆起し、不規則
形である。コロニーのテクスチュアは酵母麦芽エキス寒
天培地上ではゴム状であるが、菌糸の顕著な断片化がｗ
ｔ察される他の培地上ではバター状になる傾向がある。

コロニーの表面外観は粉状となる傾向がある。拡散性の
色素産生は認められない。

ｍ　　胞子嚢は主として球形で大きさは直径４〜２５μ
ｍの範囲である。胞子嚢はグリセリン・アスパラギン寒
天培地上では通常２１日までには肉眼で認められるよう
になる。

胞子は両端が丸い桿状（０，７６Ｘ　１．９８μｍ）で
、運動性は無く、長さ１５０μｍの、長い分枝しない鎖
状をなす。

栄養発育の色は無色から黄色であり、気菌糸は２４〜７
２時間で形成され、色は鈍黄色からローズピンク、外観
は粉状である１発育の裏面は黄褐色から赤みの茶色であ
る。

オートミール寒天　地　ＩＳＰ　　地３）発育の色は無
色から黄色で１発育の裏面は無色から黄褐色である。気
菌糸の色は白色〜明るいローズ−ベージュであり、外観
は粉状である。

虹　塩・でんぷん寒天　地　ＩＳＰ培地４）生育は薄く
、気菌糸形成は少ない、栄養菌糸は無色で、断片化がは
なはだしい、コロニーの周囲のでんぷんの透明化は培養
７日までに起こる。

グリセリン・アスパラギン　天培地（ＩＳＰ星里５） 栄養発育は無色〜黄色を呈し１発育の裏側は無色〜肉桂
色である。気菌糸は粉状で白色〜ローズピンクを呈する
。

ペプチド−−母エキス寒天　地　ＩＳＰ亙里旦） 栄養発育は黄褐色を呈する。気菌糸の形成は認められず
、メラニン様色素は生産されない。

チロシン　天培地　ＩＳＰ　　地７） 栄養発育は黄褐色から培養が古くなるにつれ濃い赤紫色
を呈する。気菌糸はビロード状で灰色がかったローズベ
ージュ色を呈する。

ツアペック・ドックス寒天　地 栄養菌糸の生育は黄褐色で、培養が古くなるにつれてピ
ンク色を帯びる。気菌糸は短くてもつれ、分泌物の多い
外観を呈する。

本発明の方法はアクチノプラナセートｓｐ。

でＬ−６８２，９９２を生産する菌株すべてに用いるこ
とができるが、特に好ましいのはＡＴＣＣＮｏ、５３７
７１株である。

一般に、資化性の炭素源と窒素源を含む液体培地中で、
できれば好気的深部培養条件下（例、振盪培養、深部培
養など）でＬ−６８２，９９２生産性の菌株をＬ− ６７９，９３４と共に培養する（発酵させる）ことによ
り、Ｌ−６８２，９９２を生産することができる。液体
培地は発酵開始時と終了時（取り入れ）においてＰＨが
約７に保たれていることが望ましい。ｐＨが高くなると
産物が相当量および／または完全に失われることになる
。所望のＰＨはモルフォリノエタンスルフォン酸（ＭＥ
Ｓ）、モルフォリノプロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）
、その他の緩衝剤を用いて保つか、あるいは以下に記す
ような生産用培地のように元来緩衝能のある栄養源を用
いることによって保つことができる。

栄養培地の炭素源として好ましいものは。

グルコース、キシロース、ガラクトース、グリセリン、
デンプン、デキストリンなどである。他にマルトース、
ラムノース、ラフィノース、アラビノース、マンノース
、サリシン、コハク酸ナトリウム等も炭素源とすること
ができる。

窒素源として好ましいものは、酵母エキス。

肉エキス、ペプトン、グルテンミール、コツトンシード
ミール、大豆ミール、その他の植物性ミール（部分的ま
たは完全に脱脂されたもの）、カゼイン加水分解物、大
豆加水分解物、酵母加水分解物、コーンステイープリカ
ー、乾燥酵母、麦芽、フェザ−ミール、粉末ビーナツツ
、ジスチラース・ソリューブルスである。アンモニア塩
（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等）、尿素、アミノ酸などの無機および有
機窒素化合物も同様に好ましい。

炭素源および窒素源は組合わせて使用するのが有利では
あるが、純品として用いる必要はない。微量の生長因子
や無機栄養素を相当量含んでいる純度の低いものも十分
使用することができるからである。必要がある場合は培
地に炭酸ナトリウムまたはカルシウム、リン酸ナトリウ
ムまたはカリウム、ヨウ素、マグネシウム塩、銅塩、コ
バルト塩、などの無機塩を添加することができる。

もし必要ならば、特に培養液が激しく発泡する場合には
、流動パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、あるいは
シリコーンのような消泡剤を添加できる。

出発物質のＬ−６７９，９３４を得る方法としては、こ
こに引用することによりその内容を組み入れたフジサワ
のＥＰＯ公告Ｎ　ｏ。

０１８４１６２に記載されているようにＳ。

ｔｓｕｋｕｂａｓｎｓｉｓにＦＲ−９００５０６即ち“
ＦＫ−５０６”（これはＬ−６７９，９３４と同一物で
ある）の発酵生産を行なわせる、あるいはＥＰＯ公開Ｎ
ｏ、０１８１６２に記載されたＰＲ−９００５０６生産
法と同一の条件下でアクチノプラナセートｓｐ、（メル
クカルチャーコレクションＭＡ６５４８）ＡＴＣＣＮｏ
、５３７７０（アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅに制限寄託）
に発酵を行なわせる方法がある。

上に言及された培養菌ＭＡ６５４８の分類学的特徴の摘
要は以下のとおりである：この菌はトリプチケース・ソ
イ寒天培地（２７℃および２８℃培養）＃母麦芽エキス
寒天培地、無機塩・でんぷん寒天培地、グリセリン・ア
スパラギン寒天培地、オートミール寒天培地、ツアペッ
クドックス寒天培地、ツアペック溶液・寒天培地、ペプ
トン・ツアペック溶液寒天培地、ベネット寒天培地（以
上は全て２８℃培養）を含む通常の培地によく生育する
。

ＩＬ−この菌は直径０．２〜０．４μｍの分枝した糸状
菌糸形で発育する。この菌のコロニーは不透明で隆起し
、不規則形でテストを行なった全培地においてテクスチ
ャーはゴム状である。コロニーの表面は粉状を呈す傾向
があり、特に気菌糸の発達が密な箇所ではその傾向は顕
著である。４８−７２時間以内に生育が肉眼で認められ
るようになる。テストした培地のすべてにおいて拡散性
色素の産生は認められなかった。

ｌ嚢−胞子嚢は主に直径１０〜４０μｍの球形である。

生育が密である箇所においては胞子嚢は合体して不定形
の塊りを形成する傾向がある。胞子は両端が丸い桿状（
０，８ＸＯ０８μｍ）で、運動性はなく、長い分枝しな
い鎖状をなす。

エキス　天　地　接種後４８時間 以内に黄色から黄みの緑色の栄養菌糸の生育が肉眼で認
められる。気菌糸の白い房は７２−９６時間後に形成さ
れる。裏側は黄色味を帯びた茶色である。

グツセリン・アスパラギン寒天　地　発育の色は黄色か
らオリーブグリーンで、ごく小さい点状の白から黄色の
気菌糸発育箇所がある。裏面は無色から黄褐色である。

学　塩・でんぷん　天　地　栄養菌糸・気菌糸の発育は
ともに黄色から黄みの緑色である。裏面は無色から黄褐
色である６ オートミール寒天培地　栄養菌糸の発育は黄色から緑色
である。表面はからみあっており、気菌糸の発育は限ら
れている。裏面は無色から明るい茶色である。

Ｌ−６８２，９９２を大量に生産するための条件として
は深部好気培養条件が好ましい、少量生産するためには
フラスコあるいはボトル中での振盪あるいは表面培養が
用いられる。さらに大型タンク中で発育を行なわせる場
合は、Ｌ−６８２，９９２生産工程での生育の遅滞を避
けるために生長状態にある菌を生産タンクに接種するこ
とが望ましい、従ってまずはじめに斜面培養管中の胞子
あるいは菌糸を比較的少量の培地に植菌し、“種培地”
とも言われるこの植菌した培地を培養することにより生
長状態にある接種用菌を調製した後、これを無菌的に大
型タンクに移すことが望ましい、接種用画調製用の発酵
培地は本質的にはＬ−６８２，９９２生産に用いる培地
と同じあるいは異なったものであり、通常培地は植苗前
にオートクレーブ滅菌を行なう。培地のｐＨは通常オー
トクレーブ前に酸またはアルカリによって７．０　付近
に調製するが、緩衝液の状態であることが望ましい。

培養混合物の撹拌および通気は多様な方法で行なうこと
ができる。撹拌は、プロペラあるいは同様な機械的撹拌
装置、発酵槽の回転または振盪、種々のポンプ装置、あ
るいは培地中に無菌空気を通すことで行なうことができ
る。通気は無菌空気を発酵混合物に通すことにより行な
うことができる。

発酵は通常約２０℃と４０℃の間で行なわせるが、望ま
しいのは２５℃〜３５℃である０発酵の期間は約２０か
ら２４時間であるが、発酵条件と規模によって変えるこ
とができる。このように発酵時間を長くするのはＬ−６
７９，９３４の本質的な二重脱メチル化を確実にするた
めである。生産用培養はロータリーシェーカー上２２０
　ｒｐｍで２７℃、約２４時間行ない１発酵培地のｐＨ
は集液時（終了時）まで７．０に保つことが望ましい。

発酵を行なわせるための望ましい培養／生産培地は以下
の培地を含むものとするニー里隻里Δ−」し勺ヒ グルコース　　　　　　　　　　１．０デキストリン　
　　　　　　　１０．０ビーフエキス　　　　　　　　
　３．０アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎｅ）　ｐＨ５、Ｏ
ＮＺアミンタイプＥ　　　　　５．Ｏ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０５ に、ＨＰＯ４０，３７ ＰＨ７，１に調整 ＣａＣＯ３０，５ｇ／Ａを加える 一変１四υ色熱」−−ＬＺ」ニ ゲルコース　　　　　　　　　　　１０ハイケースＳＦ
　　　　　　　　　２ ビーフエキス　　　　　　　　　　　１コーンステイー
プリカー　　　　　３ ｐ８７．０に調整 生産されたＬ−６８２，９９２は他の既知の生物活性物
質を回収するのに通常用いられる方法で培養液中から回
収することができる。

生産されたＬ−６８２，９９２は培養菌体と炉液中に存
在し、従って、培養液を濾過あるいは遠心分離すること
により得られる菌体と炉液から、減圧下濃縮、凍結乾燥
、メタノール等の通常用いられる溶媒による抽出、ｐＨ
調整１通常用いられる樹脂（例えば陽イオンあるいは陰
イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等）のどれかによ
る処理、通常用いられる吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸
、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）のどれかによ
る処理、結晶化、再結晶化などの従来法により分離精製
することができる。望ましい方法は溶媒抽出、特にメタ
ノールを用いた溶媒抽出である。

発酵生産物Ｌ−６８２，９９２は　“Ｔ細胞増殖アッセ
イ”において免疫抑制活性陽性であり、これに基づく有
用性を有する。

生産物Ｌ−６８２，９９２は以下のような物理的性質を
有する： １、白色不定形粉末 ２、メタノール溶解性 ３、ＦＡＢマススペクトルにより決定された分子量は７
７５であり、これは図３ で与えられた分子構造と一致する。

上述した発酵工程によって得られたＬ−６８２，９９２
は、従来法１例えば抽出、沈澱、分別結晶、再結晶、ク
ロマトグラフィその他により分離精製することができる
。

本物質の適当な調合物は、生分解性があり、かつ従来の
薬学的許容し得る　Ｌ−６８３，７５６のエステル類を
含む。このエステル類は酢酸、トリクロル酢酸などの分
子の水酸基を介して形成されるものである。

前述の発酵反応および発酵混合物の後処理においてＬ−
６８２，９９２の非対称炭素原子あるいは二重結合によ
る構造異性体および／または立体異性体は、しばしば別
の構造および／または立体異性体に変換する可能性があ
り、そのような場合も本発明の範囲に含まれることを付
言しておく。

本発明のＬ−６８２，９９２は免疫抑制活性、抗微生物
活性等の薬理活性を有し、従って心臓、腎臓、肝臓、骨
髄、皮膚などの器官あるいは組織移植に対する拒絶反応
、骨髄移植による宿主−移植片（不適合）疾患、リュー
マチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎
、多発性硬化症１重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜
炎等の自己免疫疾患の治療および予防に有用である。

本発明の製薬配合物は、外用、経腸管、非経口の投与形
態に適した無機あるいは有機のキャリヤーあるいは賦形
剤と混合した形で本発明のＬ−６８２，９９２を活性成
分として含有する固体、準固体あるいは液体の製剤形で
使用できる。活性成分は錠剤、顆粒、カプセル、生薬、
溶液、乳剤、懸濁液その他の使用に適した形態とするた
めに、毒性がなく薬学的に許容し得る通常用いられるキ
ャリヤーと配合することができる。使用できるキャリヤ
ーは水、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラ
チン、マニトール、でんぷんのり、マグネシウム三ケイ
酸塩、タルク、コーンスターチ、ケラチン、ケイ酸コロ
イド、バレイショでんぷん、尿素、その地固形、拳固形
、液状の製剤製造に用いられるキャリヤーであり、さら
に補助剤、安定剤、増粘剤、着色剤、芳香剤を用いるこ
とができる。本薬学的配合物中には疾患の状態や進行に
所期の幼果をもたらすに十分量の活性物質を含む。

本配合物をヒトに適用するには非経口あるいは腸管投与
が望ましい、治療上有効量のＬ−６８２，９９２の投与
量は治療を受ける患者により異なり、また患者の年齢や
状態によっても変るものであるが、一般に疾患治療のた
めには活性成分０．０１−１０００ｍｇ、好ましくは０
．１〜５００ｗＲｇ、さらに好ましいのは０．５〜１０
０ｍｇを日用量（体重７０ｋｇの男性を基に算出）とし
て投与する。工回当りの投与量としては約０．５，１，
５，１０゜５０．１００，２５０および５００ｍｇが一
般に用いられる。

以下の実施例は本発明を解説する目的で記載されるもの
であり、本発明の範囲に対する限定と解釈してはならな
い。

失蓋妻二り 生物および培養条 凍結乾燥し、たＡＴＣＣＮｏ、５３７７１の培養菌を２
５０　ｍ　Ｑ容の限流型振盪フラスコ中の種培地Ａ５０
ｍＱに接種した。この種培地Ａはデキストリン１０．０
、グルコース王、Ｏ、ビーフエキス３．０、アルダミン
ＰＨ（ＹｅａｓｔＰ　ｒｏｄｕｃｔ社）５．０．Ｎ−Ｚ
アミンタイプＥ５．０．　　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，
０５゜ＫＨ，ＰＯ４０，３７、ＣａＣ○、０．５（以上
単位はｇ　／　Ｑ　）から成る。種培地はオートクレー
ブする前にＰＨを７．１に調整し、植菌した種培地は２
７℃で２４時間、ロータリーシェーカー上で２２０回転
／分で培養を行なった。

別の方法として凍結した栄養増殖菌体あるいは斜面培養
菌体を用いる場合は、菌を種培地中で２７℃、２４時間
２２０回転／分で培養した後、その２．５ｍ１２　　を
用いて、２５０ｍｇ容の阻流壁でない振盪フラスコ中の
オートクレーブした（滅菌した）産生用培地Ｂ５０ｍｋ
に植菌した。

Ｌ−６７９，９３４はジメチルスルホキシドに溶かし、
終濃度が０−１ｍｇ／ｍＡとなるように添加した。振盪
フラスコの内容物はさらに２４時間、２７℃で２２０回
転／分のロータリーシェーカー上で培養を続けた後、以
下に述べる方法に従って抽出を行なった。

の　　　　　　　法 産生培地Ｂによる培養液全体（１００ｍｇ）をメチレン
クロライドで３回抽出した（３×１００ｍＡ）−メチレ
ンクロライド抽出物は合して無水硫酸ナトリウムで乾燥
した後真空下で濃縮し、油状の残渣を得た。残渣はアセ
トニトリルに溶解し、高速液体クロマトグラフィ　（Ｈ
ＰＬＣ）による精製を行なった。

ＨＰＬＣは、ワットマンパーティシル （Ｗｈａｔ＋ｓａｎ　Ｐａｒｔｉｓｉｌ　１００　Ｄ　
Ｓ　−３，９，４ｍｍＸ２５ｃｍのカラムを用い、モニ
ターは６０℃で２Ｑ５ｎｍと２２５ｎｍにおいて行なっ
た。

カラムは流速３ｍｎ／分、０．１％Ｈ，ＰＯ４水溶液＝
アセ水溶液リアセトニトリル４から２０：８０の直線濃
度勾配を用い４０分かけて展開した。上記の抽出物をく
りかえし注入して目的物質を集めた。保持時間１１．５
分の分画を合してｐＨを６．５に調整し、アセトニトリ
ルを蒸発により除いた。目的物質はさらにセップパック
Ｃ１，（Ｃ１，ＳｅＰ　　Ｐａｋ）（Ｗａｔｅｒｓ社）
とアセトニトリル−水の溶出溶媒を用いて精製し、１．
２ｍｇが得られた０本化合物はＬ−６８２，９９２であ
るとされた。

もしＬ−６８２，９９３が存在するならば１重税メチル
化されたＬ−６８２，９９３は極性がＬ−６８２，９９
２より小さいため保持時間がＬ−６８２，９９２より長
くなるはずである。

薯１迭 Ｌ−６８２，９９２はＮＭＲスペクトル分析で図１の陽
子ＮＭＲスペクトルを与えると特定された。与えられた
分子構造を図３に示す。

トヱ２５υｕ４艮 上述のＨＰＬＣでｍ製した精！ｌｉ！Ｌ−６８２．９９
２を無水エタノールに溶解して１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ
とした。

２、アッセイ Ｃ５７Ｂ　　ｌ／６　マウスの肺臓を無菌的に摘出し、
１０％熱不活化牛脂児血清（Ｇ　Ｉ　ＢＣ○）を添加し
て氷冷したＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ，ニュ
ーヨーク、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）中で分散させた
。細胞を１５０Ｏｒｐｍ８分間遠心してペレットとした
。混入する赤血球はペレットを４℃で２分間溶解用塩化
アンモニウム緩衝液（ＧＩＢＣＯ）で処理して除いた。

冷培地を加えて細胞を再度１５００ｒｐｍ８分間遠心し
た。細胞懸濁液は以下のようにナイロンウールカラムに
かけて分離し、Ｔ−細胞を単離した。ナイロンウールカ
ラムは洗浄した乾燥したナイロンウール約４ｇを２０ｍ
Ｑのプラスチックシリンジに詰めてｌｉ製した。カラム
は１２１’Ｃ３０分間オートクレーブ滅菌した。ナイロ
ンウールカラムは温培地（３７℃）で湿らせ、同じ培地
でゆすいだ、洗浄した肺臓細胞は温めた培地に再懸濁し
、ゆっくりとナイロンウールに注ぎこみ、カラムを立て
たまま３７℃で１時間インキュベートした。接着性のな
いＴ細胞は温かい培地によってカラムから溶出される。

この細胞懸濁液は上記のように遠心分離にかけた。

精製したＴ細胞は、２．５　Ｘ　１０’コ／ｍ　Ｑとな
るよう完全培地に再懸濁した。この完全培地はＲＰＭＩ
　１６４０培地に１０％熱不活化牛脂児血清−１００ｍ
Ｍグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２Ｘ１０
−”Ｍ２−メルカプトエタノールを加えたもので５０％
ｇ／ｍＱのゲンタミシン、２５０ｎｇ／ｍＱのイオノマ
イシン、Ｌｏｎｇ／ｍ氾のＰＭＡを含んでいた。Ｈｉ胞
懸濁液は直ちに平底の９６孔のミクロ培養プレート（Ｃ
ｏｓｔａｒ）にウェル当り２００μａを分注した。試験
薬剤抜きの培地を対照として、試験するサンプル（上記
のＬ−６８２，９９２）を下に述べるように様々に希釈
したものをウェル当り　２０μＱ３連分注した。Ｌ−６
７９，９３４を標準物質として用いた。培養プレートは
３７℃で、加湿した炭酸ガス５％−空気９５％の環境下
で４４時間培養した。Ｔ−細胞の増殖はトリチウムラベ
ルチミジンの取込みを測定することにより判定した。４
４時間の培養後、細胞を１ウェル当り２μＣｉのトリチ
ウムラベルチミジン（ＮＥＭ、マサチューセッツ、Ｃａ
ｍ−ｂｒｉｄｇｅ）でパルスラベルした。さらに４時間
培養後、マルチサンプルハーベスタ−を用いグラスファ
イバーフィルター上に培養細胞を集めた。各ウェルに相
当するフィルターディスクの放射能活性を標準的な緑体
シンチレーション計測法（ベータカンランター）で測定
した。１分当りのカウントを重複するウェル間で平均し
て算出し、結果はトリチウムチミジンのとりこみ（増殖
）の％阻害として下に表わした。

種々の濃度におけるＬ−６８２，９９２の％阻害の結果
を次の表に示す。

ＪＬ Ｌ−６８２ ９９２によるＴ−細　増 Ｌ−６８２，９９２（ｎｇ／＋ｏｎ）　　　　％阻害５
００　　　　　　　　　　　　　１００１３３　　　　
　　　　　　　　　　　９８８８　　　　　　　　　　
　　　　９５５９　　　　　　　　　　　　　　９２４
０　　　　　　　　　　　　　９１ ２６　　　　　　　　　　　　　　７４１８　　　　　
　　　　　　　　　２８１２　　　　　　　　　　　　
　　　　０８　　　　　　　　　　　　　　　０ 注＝１．培養マウスＴ−細胞は４８時間目で細胞を集め
る４時間前からトリチウ ムチミジンでパルスラベルした。

２、標準物質Ｌ−６７９，９３４（１０ｍｇ／　ｍ　Ｑ
　）は９９％阻害を与えた。

３、Ｌ−６８２，９９２のＩＣ，。は１８．８Ｈｇ／ｍ
Ｑ＝２４．５ｎＭで、一般に ２０〜６０Ｘ１０−’Ｍの範囲であっ た。

４、Ｌ−６８２，９９２によるＴ細胞増殖の阻害は培養
開始時に組換えヒト ＩＬ−２を５０単位／　ｍ　Ｑ加えることにより打ち消
された。

【図面の簡単な説明】

ｉ１１！ｌはＣＤＣＱ３中、４００ＭＨｚで測定された
Ｌ−６８２，９９２の１Ｈ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペ
クトルである。 ヤ２：ｒｇはＣＤＣｆ１．中、４００ＭＨｚで測定され
たＬ−６７９，９３４の”Ｈ−ＮＭＲスペクトルである
。 沼う、のはＬ−６８２，９９２の与えられた分子構造で
ある。 図面の浄書（内容に変更なし） 手続補正書Ｃ所人） （１）別紙の通り、 正式図面１通を提出致します。 平成２年８月２１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アクチノプラナセートｓｐ．をＬ− ６７９，９３４とともに、窒素栄養源を含む炭水化物培
   養液中でＬ−６８２，９９２の生産に十分な期間、好気
   的に深部培養することを特徴とする免疫抑制剤Ｌ−６８
   ２，９９２の製造方法。 ２、前記微生物がＡＴＣＣ　Ｎｏ．５３７７１である請
   求項１記載の製造方法。 ３、前記培地がグルコース、ハイケース ＨＦ、ビーフエキス、コンスティープリカーを含む『培
   地Ｂ』発酵用培地である請求項１記載の製造方法。 ４、請求項１記載の製造法によって生産 されたＬ−６８２，９９２を含む培養液。 ５、前記請求項１記載の製造方法によっ て製造された免疫抑制剤製品。 ６、Ｔ細胞増殖アッセイにおいてＴ細胞 賦活化に対し阻害作用が陽性を示し（ＩＣ＿５＿０約２
   ０〜６０×１０＾−＾９Ｍ）、図１に示す陽子核磁気共
   鳴スペクトルを有する免疫抑制剤Ｌ−６８２，９９２。 ７、図３に示した分子構造を有する免疫 抑制剤Ｌ−６８２，９９２。 ８、治療上有効な量のＬ−６８２，９９２ を薬学的に許容し得る、実質的に毒性がないキャリヤー
   または賦形剤と組合わせた薬学的配合物。 ９、ヒトホストにおける組織移植拒絶反 応を防ぎ、あるいは自己免疫疾患または感染性疾患を治
   療するために前記ホストに治療上有効量のＬ−６８２，
   ９９２を投与することを特徴とする使用法。