JPS63297398A - 新規生理活性物質ｋｓａ−９３４２又はその塩、及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規生理活性物質ＫＳＡ−９３４２又はその塩
ならびにそれらの製造法に関する。

〔従来の技術〕

農業用薬剤は高い収穫を安定的に維持する上で必要不可
欠なものであることは言及の余地はないが、作物への残
留を通しての人体に対する毒性や環境汚染の問題等を引
き起こす可能性も否定できない。本発明者らはより安全
な農薬を求めるため自然環境下で容易に分解し残留性の
少ない天然物とりわけ微生物生産物に着目して農薬とし
て開発利用することを目的にした研究を行ってきた。こ
れまで微生物産生物質として農薬利用されているものは
抗生物質プラストサイジン８１カスガマイシン、ポリオ
キシン他数種の薬剤があるが何れも自然環境の汚染には
全く問題がない極めて理想的な農薬としての実績もつま
れている。

また、本発明に係わる生理活性物質ＫＳＡ−９３４２と
分子量が近似する物質としてはニジマイシンＤｚ　（Ｅ
ｚｏｍｙｃｉｎ　Ｄ、、テトラヘドロン・レターズ、３
１９１〜３１９４頁、１９７５年）が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、さらに新規な微生物産生生理活性物質を見出
すことを目的とするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、新規な微生物産生生理活性物質の検索を
目的として種々の土壌から菌株を分離し、その産生ずる
代謝産物について研究を続けた結果、新たに土壌より分
離したＫＳＡ−９３４２菌株の培養物中にキュウリ灰色
カビ病原菌であるボトリチス　シネレア（Ｂｏｔｒｙｔ
ｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）にのみに強力な生育阻止作用を
有するものの、諸種の細菌、酵母ならびに糸状菌には全
く抗菌作用を示さない物質が生産されることを見い出し
、その有効物質を採取することに成功した。さらに本発
明者らは、この有効物質を単離、精製してその性質を検
討した結果、既知の物質とは異なる新規抗生物質である
ことが判明したので、この有効物質をＫＳＡ−９３４２
と命名した。

即ち本願の第１の発明は、下記の構造式を有する新規生
理活性物質ＫＳＡ−９３４２ 又はその塩に関するものである。

本願の第２の発明は、ストレプトバーチシリウス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、生理
活性物質ＫＳＡ−９３４２生産性を有する微生物を培養
し、その培養物から生理活性物質ＫＳＡ−９３４２又は
その塩を採取することを特徴とする生理活性物質ＫＳＡ
−９３４２又はその塩の製造法に関するものである。

ＫＳＡ−９３４２の理化学的性質を既知抗生物質のそれ
と比較し調査した結果、核酸系抗生物質の中でＫＳＡ−
９３４２と同一の分子量５４９を有する物質としてニジ
マイシンＤｚ　（Ｅｚｏｍｙｃｉｎ　Ｄ２％テトラヘド
ロン・レターズ、３１９１〜３１９４頁、　１９７５年
）が知られているが、ニジマイシンＤ２は分子式Ｃ＋ｑ
ＨｚｔＮｓＣ１ｚ”ｉｌｌ’ありＫＳＡ−９３４２の分
子式Ｃ２３Ｈ：１ｓＮ９０？と明らかに異なる。従って
ＫＳＡ−９３４２は新規物質であると判断された。

次いで本発明の詳細に付き以下記載する。

本発明の新規生理活性物質ＫＳＡ−９３４２はストレプ
トバーチシリウム属に属し、ＫＳＡ−９３４２生産性を
有する微生物を培養し、その培養物から生理活性物質Ｋ
ＳＡ−９３４２を採取することによって製造される。本
発明に使用されるＫＳＡ−９３４２の生産菌の一例とし
ては、本発明者らにより鳥取県米子市の土壌より新たに
分離されたＫＳＡ−９３４２株がある。ＫＳＡ−９３４
２株の菌学的性質は次の通りである。

本菌株の特徴づけは、国際ストレプトミセス計画（ＩＳ
Ｐ）の方法とワックスマン氏の方法に、その記載はｌ５
ＰＯ例に準じた。

（１）形態的性質 基生菌糸は分枝しながら伸長し、菌糸の分断は観察され
ない。基生菌糸から気菌糸を形成し、気菌糸はほぼ一定
間隔で輪生技が形成されている。

その先端に１０個前後の胞子からなる胞子鎖を着生する
。胞子鎖は通常直状または曲状、ときにはループ状を呈
する。胞子のう、菌核の形成は認められない。電子顕微
鏡で観察すると胞子の表面構造は平滑（ｓｍｏｏｔｈ）
で個々の胞子の形状は０．３−０．４Ｘ１．４　μｍの
長円形ないし円筒形である。本菌株の全菌体加水分解物
はＬＬ−ジアミノピメリン酸を含む。

（２）各種培地における生育状帳 培養３週間目の生育状態は第１表に示す通りである。

（木頁以下余白） 第　　１　　表 （３）生理的性質 ■生育温度範囲　　　　　　１５から４０℃最適温度範
囲　　　　　　２０から３０°Ｃ■ゼラチンの液化　　
　　　　　十 ■スターチの加水分解　　　　　十 ■脱脂牛乳の凝固　　　　　　　− ペプトン化　　　　　　　　　十 ■メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地　　　　　　　十 ペプトン・イースト・鉄寒天培地十 トリプトン、イースト・プロス　　　　　　　　　　　
　　＋■硝酸還元能　　　　　　　　　十 （４）各炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天
培地上） 同化する炭素源　　　　Ｄ−グルコース、　　ｉ　−イ
ノシトール上記の菌学的性質をインターナショナル　ジ
ャーナル　オブ　システマチック　バクテリオロジ−（
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）２
２巻３１０頁（１９７２年）を参照に同定を行った結果
、ＫＳＡ−９３４２株をストレプｉ・バーチシリウム・
カシュミレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌ　ｌ
ｉｕｍｋａｓｈｍｉｒｅｎｓｅ）に一致すると判定した
。ＫＳＡ−９３４２株は昭和６２年４月１８日付は微工
研菌第９３４２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９３４２）として
受託されている。尚、ＫＳＡ−９３４２株は他の放線菌
の場合にみられるように、その性状が変化しやすい。例
えば、ＫＳＡ−９３４２株の、またはこの株に由来する
突然変異株（自然発生または誘発性）、形質融合体また
は遺伝子組換え体であっても、ＫＳＡ−９３４２株にそ
の形質起源を依存しＫＳＡ−９３４２を生産するものは
総て本発明に使用できる。

ＫＳＡ−９３４２の製造法 本発明はＫＳＡ−９３４２株の培養と培養物からの精製
を主たる製造法としている。即ちＫＳＡ−９３４２生産
菌を通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で
培養する。栄養源としては、従来放線菌の概要に利用さ
れている公知のものが使用できる。例えば、炭素源とし
て、グルコース、グリセリン、マルトース、ラクトース
、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、動・植物油等を使
用できる。また窒素源として、ビースト、大豆粉、小麦
胚芽、コーンステイープリカー、落花生粉、綿実粉、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝
酸ソーダ、尿素等を使用できる。

その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、およ
びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添
加することは有効である。まｆコ、菌の発育を助け、Ｋ
ＳＡ−９３４２の生産を促進するような有機および無機
物を適当に添加することができる。培養法としては、好
気的条件下での培養法、特に深部タンク培養法が最も適
している。

培養に適当な温度は、１５〜３７℃であるが、多くの場
合、２６〜３０℃付近で培養する。ＫＳＡ−９３４２の
生産は、培地や培養条件により異なるが、振とう培養、
タンク培養とも２〜１０日の間でその培養が最高に達す
る。

かく生産されるＫＳＡ−９３４２は後記する理化学的性
質を有するので、その性質に従って培養物から抽出、精
製することが可能であるが、特に以下の方法により効率
的に抽出、精製できる。

即ち、ＫＳＡ−９３４２は大部分が培養ろ液中に生産さ
れるので、酸性もしくは中性でけい藻土等のろ過助剤を
加えてろ過するか遠心して菌体と分離し、活性炭、アル
ミナ、多孔性合成高分子樹脂、イオン交換樹脂等に吸着
させ、含水アセトン、含水メタノール、塩基性水、酸性
水等で溶出し、溶出液を減圧濃縮するか、またはアセト
ン、エタノール、メタノール等を使用して沈澱させる。

得られた粗精製物質は、さらに水溶性物質の精製に通常
用いられる公知の方法、例えばシリカゲル、セルロース
、ゲルろ過剤等の担体を適時組み合わせたカラムクロマ
トグラフィーによりＫＳＡ−９３４２を単離精製するこ
とができる。尚、製造工程で塩酸または酢酸のような酸
類を使用することによりＫＳＡ−９３４２の酸塩として
回収される。

尚、ＫＳＡ−９３４２の検定に当たっては、ボトリチス
・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）を検
定菌とする生物学的検定法あるいは高速液体クロマトグ
ラフィー法を定量法としてを用いることが出来る。

ＫＳＡ−９３４２の構゛告工゛ ＫＳＡ−９３４２の理化学的性質は下記の通りである。

■物質の色：酢酸塩　無色 ■元素分析値：　Ｃ５０，２７％、Ｈ６，３３％、Ｎ　
２２．９５％ ■分子式：　ＣｚｓＨ３ｓＮｑＣ）ｒ ■分子量：５４９（ＦＡＢＭＳ） ■融点：酢酸塩　１７５〜１８０℃（分解）■比旋光度
：酢酸塩（α）　”＝　−２２，３゜（ｃ＝ＩＨｚＯ） ■紫外線吸収スペクトル：酢酸塩は第１図のように、水
および０．０ＩＮの水酸化ナトリウム中でλ、、、ｎｍ
　（ＥｉＦ、　）　２１３（４００）、　２５８（２４
８）、０．０ＩＮの塩酸中で２１３（４００）、　２５
５（２４８）■赤外線吸収スペクトル：酢酸塩の臭化カ
リウム錠による赤外線吸収スペクトルを第２図に示す。

■核磁気共鳴スペクトル：酢酸塩のプロトン核磁気共鳴
スペクトルを第３図に示し、ＣＩ３核磁気共鳴スペクト
ルを第４図に示す。

［相］呈色反応ニジリカゲル薄層上でヨウ素反応、硫酸
反応、ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応に陽性
、塩化第二鉄反応および２．４−ジニトロフェニルヒド
ラジン反応に陰性■溶解性：水に易溶、メタノールに微
溶、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに
不溶 ＠シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：ブタノ
ール−酢酸−水（３：　１　：　２）で０．４１０塩基
性、酸性、中性の区分；塩基性 純化品の構造解析は以下の方法により行なった。

氷晶の分子量はＦＡＢＭＳにより得られたデータから分
子量５４９であると判明した。又”ＣＮＭＲから酢酸塩
由来のＣを除いて２３のＣ数が認められ、その内訳はメ
チルが３、メチレンが２、メチンが１１そして４級炭素
（カルボニルを含む）が７であることが解った。本物質
の加水分解物のアミノ酸分析によりアラニンとバリンが
検出され両アミノ酸の存在が確認された。一方、紫外部
吸収スペクトルからアデニンの存在が推察され、’ＨＮ
ＭＲならびに”ＣＮＭＲのピークからアデニンの存在が
確定出来た。更に２次元’ＨＮＭＲからアデニン、アラ
ニン及びバリンの他に第３のアミノ酸の部分構造の炭素
−水素骨格が決定できた。アミノ基ならびに水酸基の結
合部位の決定はアセチル化誘導物のＭＳならびにＮＭＲ
解析により行なった。

これら部分構造の組合せのためにアミノ酸配列について
はエドマン法を、アデニンの結合についてはアデノシン
の”ＣＮＭＲシフト位置との比較を行った。以上の結果
よりＫＳＡ−９３４２はＣ２３Ｈ３Ｓ　Ｎ　ｑ　Ｏ？の
分子式をもち、下記に示した平面構造を有するものと決
定された。

（本頁以下余白） ＮＨ２ Ｈ２Ｎ−Ｃ８−Ｃｏ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−
ＣＯＯＨＫＳＡ−９３４２（７）？””菌２性 ＫＳＡ−９３４２の寒天平板希釈法で測定した各種微生
物に対する最小発育阻止濃度を第２表に示す。

（本頁以下余白） 第　　　２　　　表 以下の実施例により本発明を具体的に示すが、これによ
り本発明が限定されるものではない。

〔実施例〕

５００ｍ１：三角コルベンに、グルコース３．０％、ペ
プトン０．５％、ピースＩ−１，０％、脱脂大豆粉１．
０％、燐酸−カリウム０．２％、塩化ナトリウム０．２
％、炭酸カルシウム０．３％を含む液体培地（ｐＨ６，
２）１００　ｍｌを分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅
菌し、これらに酵母エキス０．４％、麦芽エキス１．０
％、グルコース０．４％、寒天２．０％を含む寒天斜面
培地上で、２７℃で培養したＫＳＡ−９３４２株の斜面
培養より１白金耳ずつ植、菌し、回転式振とう培養機を
用い、２７℃で４日間振とう培養し種菌を得た。

４基の３０１容ジャーファーメンタ−に上記種菌培養と
同一培地を２０１仕込１２０℃で２０分間蒸気滅菌した
。それぞれに上記の種菌２本を移植し、攪はん速度４０
０ｒｐｍ、通気ＩＪｋ２０１２　／ｍｉｎの条件下で、
２７℃で７２時間通気攪はん培養した。培養終了後、培
養液に４％のけい藻土を加え、ろ過にて菌体と培養ろ液
に分別した。

得られたろ液６０７！に２．ＯＮの塩酸を加えｐＨを４
．５に調製した後、ダイヤイオンＷ　Ｋ　−１０（Ｎａ
′″）２、ＯｌＯカラムに吸着させる。水洗後０．５　
Ｎの塩　　′酸で溶出し活性画分を２．ＯＮの水酸化ナ
トリウムでｐＨ−５，ｏに調製し、ダイヤイオンＷＡ　
−１０（Ｃ１−）２．０１のカラムを通過させる。通過
液を２．ＯＮの水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調製
後、ダイヤイオンＨＰ−２０に吸着させ、水洗後４０％
メタノールで溶出させる。溶出液を減圧上濃縮乾固し、
次いでシリカゲル（３５０／２５０ｍｅｓｈ）　３００
ｒｎｌのカラムにてブタノール：酢酸：水＝５：１１の
展開溶媒を用いクロマトグラフィーを行い純度２５．７
％の粗精製物質１．８ｇを得た。これを２０ｄの０．０
５％の酢酸を含む５％メタノール水に溶解し、高速液体
クロマトグラフィー用分取逆相カラム（山村化学研究所
型：　Ｄ−００３−７）に１ｍｌチャージシし、０．０
５％の酢酸を含む５％メタノール水にて流速１０ｍｆ／
ｍｉｎで展開し活性画分を集め、減圧上濃縮乾固し、無
色無定形の活性物質ＫＳＡ−９３４２酢酸塩を３５０　
ｍｇを得た。

実施例により調製したＫＳＡ−９３４２酢酸塩を用いて
キュウリ灰色カビ病予防効果試験を実施した結果を試験
例に示すが、ＫＳＡ−９３４２は極めて高い防除効果を
有しており農業用殺菌剤として利用することが出来る。

（試験例）キュウリ灰色カビ病予防効果試験９　ｃｍ　
Ｘ　９　ｃｍの塩ビ製鉢にキュウリ種子（品種：相模半
白）を１２粒づつ播種し、室温内で７日間育成させた。

子葉が展開したキュウリ幼苗に所定濃度に調製した供試
液を１鉢あたり１０＋ｎ１散布した。

風乾後キュウリ灰色カビ病菌（ＢｏＬｒｙｔｉｓ　ｃｉ
ｎｅｒｅａ）の菌糸磨砕液を噴霧接種し、２０ないし２
３℃の温室内に入れ発病を行わせた。接種４日後の発病
程度を防除価で評価した結果を第３表に示した。尚、対
照薬剤としてポリオキシン八り水和剤を用いた。

（本頁以下余白） 第　　　３　　　表 尚、防除価の算出は下式により行った。

防除価（χ）＝（１−処理区の被害度／無処理区の被害
度）Ｘ１００ 〔発明の効果〕 本発明によれば新規な生理活性物質ＫＳＡ−９３４２又
はその塩が提供され、またこれはキュウリ灰色カビ病に
対して極めて高い防除効果を有し農業用殺菌剤として利
用できるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はＫＳＡ−９３４２酢酸塩の紫外線吸収スペクト
ル、第２図は同赤外線スペクトル、第３図は同プロトン
核磁気共鳴スペクトル、第４図は同１３Ｃ核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。 出願人　クミアイ化学工業株式会社 代理人　弁理士　　平　木　祐　軸 第１図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の構造式を有する新規生理活性物質ＫＳＡ−
   ９３４２ ▲数式、化学式、表等があります▼ 又はその塩。
2. （２）ストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅ
   ｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し、生理活性物質ＫＳＡ
   −９３４２生産性を有する微生物を培養し、その培養物
   から生理活性物質ＫＳＡ−９３４２又はその塩を採取す
   ることを特徴とする新規生理活性物質ＫＳＡ−９３４２
   又はその塩の製造法。