JPH0737478B2 - 新規生理活性物質ksa−9342又はその塩、及びその製造法 - Google Patents

新規生理活性物質ksa−9342又はその塩、及びその製造法

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JPH0737478B2
JPH0737478B2 JP13175687A JP13175687A JPH0737478B2 JP H0737478 B2 JPH0737478 B2 JP H0737478B2 JP 13175687 A JP13175687 A JP 13175687A JP 13175687 A JP13175687 A JP 13175687A JP H0737478 B2 JPH0737478 B2 JP H0737478B2
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彰 磯貝
伸光 澤井
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規生理活性物質KSA−9342又はその塩ならび
にそれらの製造法に関する。
〔従来の技術〕
農業用薬剤は高い収穫を安定的に維持する上で必要不可
欠なものであることは言及の余地はないが、作物への残
留を通しての人体に対する毒性や環境汚染の問題等を引
き起こす可能性も否定できない。本発明者らはより安全
な農薬を求めるため自然環境下で容易に分解し残留性の
少ない天然物とりわけ微生物生産物に着目して農薬とし
て開発利用することを目的にした研究を行ってきた。こ
れまで微生物生産物質として農薬利用されているものは
抗生物質ブラストサイジンS、カスガマイシン、ポリオ
キシン他数種の薬剤があるが何れも自然環境の汚染には
全く問題がない極めて理想的な農薬としての実績もつま
れている。
また、本発明に係わる生理活性物質KSA−9342と分子量
が近似する物質としてはエゾマイシンD2(Ezomycin
D2、テトラヘドロン・レターズ、3191〜3194頁、1975
年)が知られている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明は、さらに新規な微生物産生生理活性物質を見出
すことを目的とするものである。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、新規な微生物産生生理活性物質の検索を
目的として種々の土壌から菌株を分離し、その産生する
代謝産物について研究を続けた結果、新たに土壌より分
離したKSA−9342菌株の培養物中にキュウリ灰色カビ病
原菌であるボトリチス シネレア(Botrytis cinerea)
にのみに強力な生育阻止作用を有するものの、諸種の細
菌、酵母ならびに糸状菌には全く抗菌作用を示さない物
質が生産されることを見い出し、その有効物質を採取す
ることに成功した。さらに本発明者らは、この有効物質
を単離、精製してその性質を検討した結果、既知の物質
とは異なる新規抗生物質であることが判明したので、こ
の有効物質をKSA−9342と命名した。
即ち本願の第1の発明は、下記の構造式を有する新規生
理活性物質KSA−9342 又はその塩に関するものである。
本願の第2の発明は、ストレプトバーチシリウムス(St
reptoverticillium)属に属し、生理活性物質KSA−9342
生産性を有する微生物を培養し、その培養物から生理活
性物質KSA−9342又はその塩を採取することを特徴とす
る生理活性物質KSA−9342又はその塩の製造法に関する
ものである。
KSA−9342の理化学的性質を既知抗生物質のそれと比較
し調査した結果、核酸系抗生物質の中でKSA−9342と同
一の分子量549を有する物質としてエゾマイシンD2(Ezo
mycin D2、テトラヘドロン・レターズ、3191〜3194頁,1
975年)が知られているが、エゾマシンD2は分子式C19H
27N5O14でありKSA−9342の分子式C23H35N9O7と明らかに
異なる。従ってKSA−9342は新規物質であると判断され
た。
次いで本発明の詳細に付き以下記載する。
本発明の新規生理活性物質KSA−9342はストレプトバー
チシリウム属に属し、KSA−9342生産性を有する微生物
を培養し、その培養物から生理活性物質KSA−9342を採
取することによって製造される。本発明に使用されるKS
A−9342の生産菌の一例としては、本発明者らにより鳥
取県米子市の土壌より新たに分離されたKSA−9342株が
ある。KSA−9342株の菌学的性質は次の通りである。
KSA−9342株の同定 本菌株の特徴づけは、国際ストレプトミセス計画(IS
P)の方法とワックスマン氏の方法に、その記載はISPの
例に準じた。
(1) 形態的性質 基生菌糸は分枝しながら伸長し、菌糸の分断は観察され
ない。基生菌糸から気菌糸を形成し、気菌糸はほぼ一定
間隔で輪生枝が形成されている。その先端に10個前後の
胞子からなる胞子鎖を着生する。胞子鎖は通常直状また
は曲状、ときにはループ状を呈する。胞子のうち、菌核
の形成は認められない。電子顕微鏡で観察すると胞子の
表面構造は平滑(smooth)で個々の胞子の形状は0.3-0.
4×1.4μmの長円形ないし円筒形である。本菌株の全菌
体加水分解物はLL−ジアミノピメリン酸を含む。
(2) 各種培地における生育状態 培養3週間目の生育状態は第1表に示す通りである。
(3) 生理的性質 生育温度範囲 15から40℃ 最適温度範囲 20から30℃ ゼラチンの液化 + スターチの加水分解 + 脱脂牛乳の凝固 − ペプトン化 + メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地 + ペプトン・イースト・鉄寒天培地 + トリプトン・イースト・ブロス + 硝酸還元能 + (4) 各炭素源の同化性(プリドハム・ゴドリーブ寒
天培地上) 同化する炭素源 D−グルコース,i−イノシトール 上記の菌学的性質をインターナショナル ジャーナル
オブ システマチック バクテリオロジー(Internatio
nal Journal of Systematic bacteriology)22巻 310
頁(1972年)を参照に同定を行った結果、KSA−9342株
をストレプトバーチシリウム・カシュミレンス(Strept
overticillium kashmirense)に一致すると判定した。K
SA−9342株は昭和62年4月18日付け微工研菌第9342号
(FERM P−9342)として受託されている。尚、KSA−934
2株は他の放線菌の場合にみられるように、その性状が
変化しやすい。例えば、KSA−9342株の、またはこの株
に由来する突然変異株(自然発生または誘発性)、形質
融合体または遺伝子組換え体であっても、KSA−9342株
にその形質起源を依存しKSA−9342を生産するものは総
て本発明に使用できる。
KSA−9342の製造法 本発明はKSA−9342株の培養と培養物からの精製を主た
る製造法としている。即ちKSA−9342生産菌を通常の微
生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄
養源としては、従来放線菌の概要に利用されている公知
のものが使用できる。例えば、炭素源として、グルコー
ス、グリセリン、マルトース、ラクトース、水飴、デキ
ストリン、澱粉、糖蜜、動・植物油等を使用できる。ま
た窒素源として、ビースト、大豆粉、小麦胚芽、コーン
スティープリカー、落花生粉、綿実粉、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿
素等を使用できる。その他、必要に応じ、ナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム、コルバルト、塩
素、燐酸、硫酸、およびその他のイオンを生成すること
ができる無機塩類を添加することは有効である。また、
菌の発育を助け、KSA−9342の生産を促進するような有
機および無機物を適当に添加することができる。培養法
としては、好気的条件下での培養法、特に深部タンク培
養法が最も適している。培養に適当な温度は、15〜37℃
であるが、多くの場合、26〜30℃付近で培養する。KSA
−9342の生産は、培地や培養条件により異なるが、振と
う培養、タンク培養とも2〜10日の間でその培養が最高
に達する。
かく生産されるKSA−9342は後記する理化学的性質を有
するので、その性質に従って培養物から抽出、精製する
ことが可能であるが、特に以下の方法により効率的に抽
出、精製できる。
即ち、KSA−9342は大部分が培養ろ液中にに生産される
ので、酸性もしくは中性でけい藻土等のろ過助剤を加え
てろ過するか遠心して菌体と分離し、活性炭、アルミ
ナ、多孔性合成高分子樹脂、イオン交換樹脂等に吸着さ
せ、含水アセトン、含水メタノール、塩基性水、酸性水
等で溶出し、溶出液を減圧濃縮するか、またはアセト
ン、エタノール、メタノール等を使用して沈澱させる。
得られた粗精製物質は、さらに水溶性物質の精製に通常
用いられる公知の方法、例えばシリカゲル、セルロー
ス、ゲルろ過剤等の担体を適時組み合わせたカラムクロ
マトグラフィーによりKSA−9342を単離精製することが
できる。尚、製造工程で塩酸または酢酸のような酸類を
使用することによりKSA−9342の酸塩として回収され
る。
尚、KSA−9342の検定に当たっては、ボトリチス・シネ
レア(Botrytis cinerea)を検定菌とする生物学的検定
法あるいは高速液体クロマトグラフィー法を定量法とし
て用いることが出来る。
KSA−9342の構造式 KSA−9342の理化学的性質は下記の通りである。
物質の色:酢酸塩 無色 元素分析値:C 50.27%、H 6.33%、 N 22.95% 分子式:C23H35N9O7 分子量:549(FABMS) 融点:酢酸塩 175〜180℃(分解) 比旋光度:酢酸塩▲〔α〕22 D▼=−22.3° (c=1H2O) 紫外線吸収スペクトル:酢酸塩は第1図のように、
水および0.01Nの水酸化ナトリウム中で 0.01Nの塩酸中で213(400),255(248) 赤外線吸収スペクトル:酢酸塩の臭化カリウム錠に
よる赤外線吸収スペクトルを第2図に示す。
核磁気共鳴スペクトル:酢酸塩のプロトン核磁気共
鳴スペクトルを第3図に示し、13C核磁気共鳴スペクト
ルを第4図に示す。
呈色反応:シリカゲル薄層上でヨウ素反応、硫酸反
応、ニンヒドリン反応、アニスアルデヒド反応に陽性、
塩化第二鉄反応および2,4−ジニトロフェニルヒドラジ
ン反応に陰性 溶解性:水に易溶、メタノールに微溶、アセトン、
酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに不溶 シリカゲル薄層クロマトグラフィのRf値:ブタノー
ル−酢酸−水(3:1:2)で0.41 塩基性、酸性、中性の区分:塩基性 純化品の構造解析は以下の方法により行なった。本品の
分子量はFABMSにより得られたデータから分子量549であ
ると判明した。又13CNMRから酢酸塩由来のCを除いて23
のC数が認められ、その内訳はメチルが3、メチレンが
2、メチンが11そして4級炭素(カルボニルを含む)が
7であることが解った。本物質の加水分解のアミノ酸分
析によりアラニンとバリンが検出され両アミノ酸の存在
が確認された。一方、紫外部吸収スペクトルからアデニ
ンの存在が推察され、1HNMRならびに13CNMRのピークか
らアデニンの存在が確定出来た。更に2次元1HNMRから
アデニン、アラニン及びバリンの他に第3のアミノ酸の
部分構造の炭素−水素骨格が決定できた。アミノ基なら
びに水酸基の結合部位の決定はアセチル化誘導物のMSな
らびにNMR解析により行なった。これら部分構造の組合
せのためにアミノ酸配列についてはエドマン法を、アデ
ニンの結合についてはアデノシンの13CNMRシフト位置と
の比較を行った。以上の結果よりKSA−9342はC23H35N9O
7の分子式をもち、下記に示した平面構造を有するもの
と決定された。
KSA−9342の抗菌活性 KSA−9342の寒天平板希釈法で測定した各種微生物に対
する最小発育阻止濃度を第2表に示す。
以下の実施例により本発明を具体的に示すが、これによ
り本発明が限定されるものではない。
〔実施例〕
500ml容三角コルベンに、グルコース3.0%、ペプトン0.
5%、ビースト1.0%、脱脂大豆粉1.0%、燐酸一カリウ
ム0.2%、塩化ナトリウム0.2%、炭酸カルシウム0.3%
を含む液体培地(pH6.2)100mlを分注し、120℃で20分
間蒸気滅菌し、これらに酵母エキス0.4%、麦芽エキス
1.0%、グルコース0.4%、寒天2.0%を含む寒天斜面培
地上で、27℃で培養したKSA−9342株の斜面培養より1
白金耳ずつ植菌し、回転式振とう培養機を用い、27℃で
4日間振とう培養し種菌を得た。
4基の30l容ジャーファーメンターに上記種菌培養と同
一培地を20l仕込120℃で20分間蒸気滅菌した。それぞれ
に上記の種菌2本を移植し、攪はん速度400rpm、通気量
20l/minの条件下で、27℃で72時間通気攪はん培養し
た。培養終了後、培養液に4%のけい藻土を加え、ろ過
にて菌体と培養ろ過液に分別した。
得られたろ液60lに2.0Nの塩酸を加えpHを4.5に調製した
後、ダイヤイオンWK−10(Na+)2.0lのカラムに吸着さ
せる。水洗後0.5Nの塩酸で溶出し活性画分を2.0Nの水酸
化ナトリウムでpH8.0に調製し、ダイヤイオンWA−10(C
l-)2.0lのカラムを通過させる。通過液を2.0Nの水酸化
ナトリウムでpHを7.0に調製後、ダイヤイオンHP−20に
吸着させ、水洗後40%メタノールで溶出させる。溶出液
を減圧下濃縮乾固し、次いでシリカゲル(350/250mes
h)300mlのカラムにてブタノール:酢酸:水=5:1:2の
展開溶媒を用いクロマトグラフィーを行い純度25.7%の
粗精製物質1.8gを得た。これを20mlの0.05%の酢酸を含
む5%メタノール水に溶解し、高速液体クロマトグラフ
ィー用分取逆相カラム(山村化学研究所製:D−ODS−
7)に1mlチャージシし、0.05%の酢酸を含む5%メタ
ノール水にて流速10ml/minで展開し活性画分を集め、減
圧下濃縮乾固し、無色無定形の活性物質KSA−9342酢酸
塩を350mgを得た。
実施例により調製したKSA−9342酢酸塩を用いてキュウ
リ灰色カビ病予防効果試験を実施した結果を試験例に示
すが、KSA−9342は極めて高い防除効果を有しており農
業用殺菌剤として利用することが出来る。
(試験例)キュウリ灰色カビ病予防効果試験 9cm×9cmの塩ビ製鉢にキュウリ種子(品種:相模半白)
を12粒づつ播種し、温室内で7日間育成させた。子葉が
展開いたキュウリ幼苗に所定濃度に調製した供試液を1
鉢あたり10ml散布した。風乾後キュウリ灰色かび病菌
(Botrytis cinerea)の菌糸磨砕液を噴霧接種し、20な
いし23℃の湿室内に入れ発病を行わせた。接種4日後の
発病程度を防除価で評価した結果を第3表に示した。
尚、対照薬剤としてポリオキシンAL水和剤を用いた。
下記基準により発病指数を調査し得られた数値をもとに
被害度を求め、さらに防除度を求め、さらに防除価を求
めた。
発病指数0: 発病を認めず 〃 1: 1/3未満の発病面積 〃 2: 1/3〜2/3未満の発病面積 〃 3: 2/3以上の発病面積 〔発明の効果〕 本発明によれば新規な生理活性物質KSA−9342又はその
塩が提供され、またこれはキュウリ灰色カビ病に対して
極めて高い防除効果を有し農業用殺菌剤として利用でき
るという効果がある。
【図面の簡単な説明】
第1図はKSA−9342酢酸塩の紫外線吸収スペクトル、第
2図は同赤外線スペクトル、第3図は同プロトン核磁気
共鳴スペクトル、第4図は同13C核磁気共鳴スペクトル
を示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記の構造式を有する新規生理活性物質KS
    A−9342 又はその塩。
  2. 【請求項2】ストレプトバーチシリウム(Streptoverti
    cillium)属に属し、生理活性物質KSA−9342生産性を有
    する微生物を培養し、その培養物から生理活性物質KSA
    −9342又はその塩を採取することを特徴とする新規生理
    活性物質KSA−9342又はその塩の製造法。
JP13175687A 1987-05-29 1987-05-29 新規生理活性物質ksa−9342又はその塩、及びその製造法 Expired - Lifetime JPH0737478B2 (ja)

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