DE2241091B2 - Verfahren zur herstellung von 7- (d-alpha-aminophenylacetoamido)-desace- toxy-cephalosporansaeure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-(D-vAminophenylacetamido)-desacetoxycephalosporansäure (= Cephalexin) durch enzymatische Acylierung von 7-Amino-desacetoxy-cephaloiporansäure (= "7-ADCA) mit D-Phenylglycinmethyl- oder -äthylester.

Bisher wurde Cephalexin durch Desacetoxylierung von 7-(D-_-k-Aminophenylacetamido)-cephalosporanläure durch katalytische Hydrierung (vgl. NL-PS 67 04 294), Ringerweiterung von 6-(D-*-substituierlen Amino - phenyl acetamido) - penicillansäure - sulfoxidestern durch Erhitzen in Anwesenheit eines Katalysators und von Xylol (vgl. NL-PS 67 04 294) und Acylierung von 7-ADCA durch D-a-substituierte Aminophenylessigsäure und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppe (vgl. NL-PS 69 05 073) hergestellt.

Dieser Stand der Technik hat jedoch Nachteile. Beispielsweise muß das chemische Acylierungsverfahren von 7-ADCA unter Verwendung des aminogruppengeschützten Phenylglycins durchgeführt werden, außerdem ist diese Schutzgruppe zu entfernen. Diese Nachteile machen das Verfahren unwirtschaftlieh.

Ein Acylierungsverfahren zur direkten Herstellung von Cephalexin aus 7-Phenylacetamido-3-methylid'⁾-cephem-4-carbonsäurc, die ein Ringerweilerungsprodukt von Penicillin G ist, unter Verwendung eines Enzympräparates, das vom Bacillus Megaterium stammt, ist bereits vorgeschlagen worden (vgl. DT-OS 22 14 444); dieses Verfahren ist jedoch wegen der niedrigen Cephalexinausbeute nicht immer industriell vorteilhaft gewesen.

Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von chemotherapeutisch brauchbarem Cephalexin aus 7-ADCA in hoher Ausbeute. Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines industriellen Verfahrens zur Herstellung von Cephalexin.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch Schaffung eines enzymatischen Acylierungsverfahrens gelöst. Im Verlaufe einer Untersuchung über Acylierungsenzyme erzeugende Bakterien, die eine Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe in 7-ADCA einführen, wurde jetzt ein Mikroorganismus gefunden, der zur Gattung Achromobacter gehört und nachfolgend als B-402-2 bezeichnet wird, der eine starke acylierende Wirksamkeit für die Aminogruppe in 7-ADCA hat und der Cephalexin nahezu quantitativ aus 7-ADCA und Phenylglycinmethyl- oder -äthylester bildet.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 7-(D-a-Aminophenylacetamido)-desacetoxy-cephalosporansäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure mit D-Phenylglycinmethyl- oder -äthylester in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines acylierenden Enzyms, das von einem Mikroorganismus des Stammes Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 oder Beneckea hyperoptica ATCC 15803 stammt, bei 20 bis 45⁰C und einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 umgesetzt wird.

Es folgt eine taxonomische Beschreibung des erfindungsgemäß verwendeten Stammes B-402-2.

a) Beobachtungen auf Bouillonagar-Schrägkultur bei 30° C 24 Stunden lang:

1. Gestalt und Größe der Bakterienzellen: Kurze Stäbchen, runde Ränder. 0,5 bis 0,8 X 2,0 bis 2,5 μ.

2. Zellenform: Beinahe Einzelzellen, schwach kettig, keine Membran.

3. Mobilität: Keine:

4. Sporen: Keine.

5. Gramsche Färbung: Negativ.

6. Säurefestigkeit: Negativ.

b) Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Bouillon-Plattenagar (bei 30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, erhebt sich konvex, keine Ausbreitung, weiß, oder hellgelb, glänzend, weich, feucht, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

2. Bouillon-Schrägagar (30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, glatte Oberfläche, keine Ausbreitung, glänzend, feucht, milchigweiße Kolonie, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

3. Bouillonbrühe (bei 30° C, 2 Tage): Gutes Wachstum, gleichmäßig trübe, keine Ausfällung, keine Membranbildung, keine Pigmentierung.

4. Bouillongelatine-Einstich: Oberfiächenwachstum entlang der Stichlinie bis zur halben Tiefe, keine Verflüssigung der Gelatine.

5. Sojabohnen-Schrägagar (30° C,' 24 Stunden): Gutes Wachstum, weiße oder hellgelbe Kolonie, glatte und weiche Oberfläche, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

6. Kartoffelagar (3O⁰C, 5 Tage): Gutes Wachstum, milchigweiße Kolonie, glatte und weiche Oberfläche, konvexe Erhebung, keine Änderung der Farbe des Mediums.

7. Lackmusmilch: Sauer, Peptonisierung.

c) Physiologische Eigenschaften:

1. Nitratreduktion: Negativ.

2. Denitrierungsreaktion: Negativ.

3. MR-Test: Negativ.

4. VP-Test: Negativ.

5. Indolbildung: Schwache Bildung.

6. Hydrogensulfatbildung: Positiv.

7. Stärke-Hydrolyse: Positiv.

8. Zitratverwertung: Positiv (stark).

9. Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: Nitrat- und Ammoniumsalzverwertung.

10. Pigmentbildung: Keine.

11. Urease: Positiv (schwach).

12. Oxidase: Positiv.

13. Katalase: Positiv.

14. Bereich des Wachstums: Wachstums-pH: 5 bis 9; optimaler Wachstums-pH: 7 bis 8; Wachstumstemperatur: 7 bis 4O⁰C; optimale Temperatur: 24 bis 30° C.

15. Aerob oder anaerob: Aerob

16. O-F-Test: O-Tvp.

17. Kohlenhydratfermentation:

Säurebildung Gasbildung

L-Arabinose — _

D-Xylose - _

D-Glukose — —

D-Mannose -f —

D-Fructose — _

D-Galactose — —

Maltose — _

Saccharose — _

Lactose — _

Trehalose — —

D-Sorbit - _

Inosit — _

Glycerin — —

Stärke — — Rhamnose

Ribose —
Cellobiose
Raffinose
Melezilose

Inulin — —

Salicin — —

Glucitol — —

Nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, wird der taxonomische Standort des obigen Stammes B-402-2 bestimmt und gehört demnach zur Gattung Achromobacter, da er Agar nicht zersetzt, kein Pigment bildet und auf Lackmusmilch sauer reagiert. Außerdem ähnelt er Achromobacter parbulus, weil er keine Mobilität zeigt und keine Säurebildung aus Glukose. Er unterscheidet sich jedoch in den folgenden Punkten:

Stamm B-402-2

Achromobacter parvulus

Indolbildung	schwache	keine
	Bildung	Bildung
Stärkehydrolyse	positiv	negativ
Nitratreduktion	negativ	positiv

Bei dem Stamm B-402-2 kann es sich daher um eine andersartige Spezies von Achromobacter parbulus handein, und Achromobacter B-402-2 wird daher als neue Spezies geführt. Dieser Stamm ist im »Institut for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology« hinterlegt worden und trägt die Hinterlegungsbezeichnung FERM-P Nr. 1095. Dieser Stamm ist auch im US-Department of Agriculture, Agricultural Research Service, unter der Bezeichnung NRRL-B-5393 hinterlegt worden.

Eine weitere Mikroorganismenspezies, die für die erfindungsgemäße Herstellung von Cephalexin verwendet werden kann, ist Beneckea hiperoptica ATCC 15803.

Die beiden oben beschriebenen Mikroorganismenstämme oder deren Enzympräparate haben eine spezifische Wirkung auf Cephalexin und die Fähigkeit, nahezu quantitativ Cephalexin aus 7-ADCA und D-Phenylglycin-methyl- oder -äthylester zu bilden.

Gemäß den angewendeten Bedingungen haben die Enzympräparate die Wirksamkeit, die Amidbindung in Cephalexin zu spalten und 7-ADCA zu bilden. Es war nicht bekannt, daß das acylierende Enzym die spezifische Aktivität in bezug auf die Acylierung der Aminogruppe in 7-ADCA hat.

ίο Die in der Erfindung verwendete 7-ADCA wird nach Verfahren hergestellt, die dem Stand der Technik angehören [vergleiche z. B. die Herstellung aus Cephalosporin-C (vgl. US-PS 31 24 576), Verfahren zur Herstellung aus 7-Aminocephalosporansäure

(vgl. US-PS 31 24 576), Herstellung nach dem Verfahren aus 7-Phenoxyacetamido- oder 7-Phenylacetamido-desacetoxy-cephalosporansäureester (vgl. US-PS 32 75 626, BE-PS 6 96 026, NL-PS 68 06 532. BE-PS 7 45 845, GB-PS 12 04 394, BE-PS 7 46 860 und BE-PS 7 47 118 und 7 47 120) oder die enzymatische Deacylierung von 7-Acylamido-desacetoxvcephalosporansäure (vgl. DT-OS 22 12 276)].

Um die Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe in 7-ADCA einzuführen, verwendet man D-Phenylglycinmethylester oder D-Phenylglycinäthylester, das bevorzugte Derivat ist D-Phenylglycinmethylester.

Der das Acylierungsenzym erzeugende Mikroorganismus der Erfindung kann durch aerobe Kultivierung mit einem Nährmittel, das organische oder anorganische Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Mais-Einweichbrühe, Hefeextrakt, trockene Hefe, Sojabohnenprotein-Hydrolysate, Sojabohnenextrakt, Nitrat- oder Ammoniumsalz, eine Kohlenstoffquelle, wie Melasse, Glukose oder Stärkehydrolysat, und anorganisches Salz, gewünschtenfalls auch andere geeignete wachstumsstimulierende wichtige Substanzen enthält, bei 20 bis 35° C in 12 bis 48 Stunden hergestellt werden.

Für eine industrielle Produktion wird im allgemeinen die submerse aerobe Kultivierung angewendet.

Das acylierende Enzym für die Aminogruppe in 7-ADCA kann im allgemeinen als Endo-Enzym vorliegen. Als Enzympräparate können Mikroorganismenkulturen, nach der Kultivierung isolierte native Bakterienzellen oder Suspensionen davon in einer Enzymreaktion verwendet werden. Außerdem können chemische oder physikalisch behandelte Mikroorganismenzellen im Verfahren der Erfindung angewendet werden, sofern die acylierende Enzymaktivität erhalten bleibt. Derartige vorbehandelte Mikroorganismenzellen sind z. B. aceton-, methanol- oder äthanolgetrocknete Zellen; sprühgetrocknete Zellen, zerriebene oder beschallte Zellen; durch Pufferlösung oder Cetylpyridiniumchlorid hergestellte Zell-Lysate; gereinigte Enzyme, erhalten nach bekannten Trennungs- und Reinigungsverfahren, wie z. B. Aussalzen, fraktionierte Ausfällung, Dialyse, Absorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration; zerriebene Zellen oder von Zell-Lysaten; und die festen Enzympräparate oder unlöslich gemachtes Enzym, hergestellt durch Adsorption des Acylierungsenzyms oder der erzeugenden Mikroorganismen auf einem inerten Träger, der gegenüber den Substraten nicht aktiv ist und die Aktivität des acylierenden Enzyms nicht inaktiviert.

Gewöhnlich wird bei der erfindungsgemäßen Acylierung die freie 7-ADCA in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mg/ml, vorzugsweise 2 bis 5 mg/ml,

verwendet. Der Phenylglycinmethyl- oder -äthylester gleiche Pufferlösung verwendet wird ehe für die Einwird im allgemeiner, in dnem 2- bis 20molaren Über- stellung des optimalen pH-Wertes de, Enzyms verschuß für 7-ADCA verwendet, dieses Molverhältnis wendet wird, dann wird die Kulturbruhe oder Enzymkann jedoch je nach der Konzentration von 7-ADCA lösung hindurchgeschickt, die Kolonne m,t Wasser in der Reaktionsmischung geändert werd n; die be- 5 oder Pufferlösung nachgewaschen so daß man ein vorzugteste Menge ist ein 6- bis lOmolarer Über- Enzympräparat auf fester Phase erhalt Be₁ der Adschuß Die Reaktionstemperatur liegt bei 20 bis sorption der Mikroorgamsmenzellen auf dem Träger 45° C, vorzugsweise bei 30 bis 37° C. Man kann wird eine Ze !suspension m Wasser oder Puffer osung eine stationäre, geschüttelte oder gerührte Kultur mit dem Trager vereinigt Dabei,st der Effekt des verwenden. Dev pH der Reaktionsmischung wird bei io pH-Wertes zu berücksichtigen da die Adsorpt.on pH 5,5 bis 7,5, am günstigsten bei 6,0 bis 6,5, gehal- stark von der Ionenstarke beeinflußt wird,
ten. Die Reaktionszeit kann je nach den Reaktions- Ein festes Enzympräparat -bestehend aus dem bedingungen 0,5 bis 3 Stunden betragen, und die Träger und dem darauf adsorbierten, acylierenden Umsetzung kann beendet werden, wenn die stärkste Enzym bzw. Mikroorganismenzellen - kann der Cephalexinbildung erreicht ist. '5 Gefahr e.ner Denaturierung oder eines Akt.vitäts-

Im Falle der Acylierung mit einem festen Enzym- Verlustes unterhegen; es sollte daher im feuchten Zu-

präparat wird zuerst das acylierende Enzym oder der stand gehalten werden.

erzeugende Mikroorganismus auf dem Träger adsor- 7-ADCA wird mit Phenylglycinmethyl- oder Wert. Wenn es sich um Exo-Enzym handelt, kann -äthylester in Anwesenheit des festphasigen Enzymdas Acylierungsenzym adsorbiert werden, indem man 20 präparates umgesetzt. Obwohl die Konzentration des das Kulturfiltrat des das Acylierungsenzym erzeugen- Substrates in Abhängigkeit von der L· nzymstarke oder den Stammes auf den Träger gibt. Im Falle von der Ausfließrate aus der Kolonne schwanken kann, Endo-Enzym werden native Mikroorganismenzellen sollte sie vorzugsweise so festgelegt werden, daß eine aus der Kultur des das Acylierungsenzym erzeugen- bestimmte Menge an nicht umgesetzter 7-ADCA und den Mikroorganismus isoliert und auf dem Träger 25 Phenylglycin im Abstrom nicht erhöht wird. Im alladsorbiert, oder es werden mit Aceton ode·" Äthanol gemeinen beträgt die Konzentration an 7-ADCA 0,1 getrocknete Zellen auf dem Träger adsorbiert; oder bis 2 GewichtsWolumprozent, vorzugsweise 0,2 bis eine Lösung des acylierenden Enzyms, extrahiert aus 1 Gewichts-ZVolumprozent, und der Phenylglycin-Mikroorganismenzellen, wird auf dem Träger adsor- methyl- oder äthylester wird in 2- bis lOmolarem biert. 30 Überschuß gegenüber der 7-ADCA verwendet. Die

Die in der Erfindung verwendeten Träger, die je Acylierungsreaktion sollte bei dem für die Enzym-

nach der Art des Mikroorganismus oder je nach der aktivität günstigsten pH und der günstigsten Tempe-

Herstellung des Acylierungsenzyms oder der Mikro- ratur durchgeführt werden. Die Reaktionszeit kann

Organismenzellen variiert werden sollten, müssen un- im Falle der Umsetzung in einer Kolonne durch

ter Berücksichtigung der Eigenschaften der das Enzym 35 Änderung des Substrat-Abflußvolumens geregelt

oder die Mikroorganismenzellen adsorbierenden Trä- werden. Üblicherweise wird die Umsetzung beim

ger ausgewählt werden, so daß sie die Aktivität des Durchgang durch eine mit einem festphasigen Enzym-

Acylierungsenzyms nicht inaktivieren. Dabei müssen präparat gefüllte Kolonne durchgeführt, wobei ein

die Träger so beschaffen sein, daß das adsorbierte kontinuierlicher Betrieb leicht durch kontinuierliche

Enzym oder die Mikroorganismenzellen nicht durch 40 Zugabe der Substrate erreicht werden kann. Wenn

Waschen entfernt werden. Die Träger sollen gegen- jedoch die Substrate im Abstrom gefunden werden,

über dem Substrat inaktiv sein und das entstehende ist zweckmäßig die Abfließrate zu verringern oder

Cephalexinprodukt nicht adsorbieren. Beispiele für der Abstrom in die Kolonne zurückzuführen. Sobald

Träger, die vorteilhafterweise für die Adsorption einer die Enzymaktivität abnimmt oder verlorengeht, sollte

wäßrigen Enzymlösung verwendet werden, sind akti- 45 natürlich die Operation beendet werden. Das so her-

ves Aluminiumoxid, Diatomeenerde, saurer Ton, ak- gestellte Cephalexin wird nach bekannten Isolierungs-

tiver Ton, Kaolin, Calciumphosphat oder Hydroxy- verfahren abgetrennt. Beispielsweise wird die Reak-

apatit. Zur Adsorption der Mikroorganismenzellen tionsmischung durch ein Anionenaustauscherharz

verwendet man vorteilhafterweise Carboxymethyl- oder durch Aktivkohle geschickt, und danach wird

cellulose, vernetztes Carboxymethyl-Dextran, Di- 50 mit einer wäßrig-sauren Lösung oder einem organi-

äthylenaminoäthanolcellulose, Triäthylaminoäthanol- sehen Lösungsmittel-Wasser-Gemisch eluiert. Das

cellulose oder Diatomeenerde. Eluat, das das Cephalexin enthält, wird eingeengt

Es empfiehlt sich, den pH vorher so zu regeln, daß und isoelektrisch ausgefällt. Oder die Reaktions-

das acylierende Enzym bei der Adsorption auf dem mischung wird durch Zugabe von Trifluoressigsäure

Träger einen stabilen pH hat. Die Adsorption kann 55 auf einen pH-Wert von 1 eingestellt und danach mit

ansatzweise oder in Kolonnen durchgeführt werden. organischem Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon,

Die Kolonnenadsorption verwendet man Vorzugs- extrahiert, wodurch nach Auflösen in saurem Wasser

weise für die kontinuierliche Enzymreaktion. Die isoelektrisch ausgefällt wird. Außerdem wird die

Trägermenge kann je nach der Menge der Mikro- Reaktionsmischung mit einem Anionenaustauscher-

organismenzellen, dem Volumen der Kulturfiltrate, 60 harz in Anwesenheit eines mit Wasser nicht misch-

dem Enzymgehalt oder dem Adsorptionsverhältnis baren organischen Lösungsmittels behandelt, und die

des Trägers schwanken. Im allgemeinen kann bei erhaltene wäßrige Schicht wird konzentriert oder der

einer ansatzweise durchgeführten Adsorption die Gefriertrocknung unterworfen, um das Cephalexin

Trägermenge 5 bis 15 Gewichtsteile/Volumen für als freie Säure zu isolieren.

Kulturfiltrat oder 5 bis 20 Voluminaüberschuß für 65 Die Beispiele erläutern die Erfindung,

native Zellen betragen. Bei der Adsorption auf Ko- Die Prüfung auf Cephalexin wird hierbei folgen-

lonnen wird eine Kolonne mit einem Träger gefüllt, dermaßen durchgeführt:

mit Wasser oder Pufferlösung befeuchtet, wobei die Eine Testlösung, die Cephalexin enthält, wird

mikrobiologisch nach der Papierscheibenmethode oder nach der Schalenmethode mit Bacillus subtilis PCI-219 16 Stunden lang bei 37⁰C geprüft. Die sich ergebende Inhibierungszonc wird gemessen, daraus läßt sich die Cephalexinstärke mit Hilfe der Standard-Cephalexinkurve berechnen.

Beispiel 1

100 ml wäßriges Medium (pH 7,0), das 3% Glukose, 1% Hefeextrakt, 0,1% K₀HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,05% KCl und 0,00"l % FeSO₄ enthält, werden bei 12O⁰C 20 Minuten lang sterilisiert.

Man impft mit Achromobacter B-402-2, NRRL B-5393 an und schüttelt die Kultur bei 26° C 72 Stunden lang. Das Kulturmedium wird auf pH 6,5 eingestellt, dann gibt man 100 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 6,5), der 2 mg/ml 7-ADCA und 20 mg/ml D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, hinzu, danach wird 3 Stunden lang bei 37° C enzymatisch umgesetzt. Man findet 100% Cephalexin im Filtrat der Reaktionsmischung. Das Filtrat wird auf eine Kieselgel - Dünnschicht - Chromatographieplatte aufgetüpfelt, die fluoreszierendes Material enthält und mit Hilfe eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (3:1:1) entwickelt. Die Untersuchung mit Hilfe von UV-Licht von 2536 A zeigt einen purpurroten Fleck in der Nähe von Rf = 0,50, der auch mit dem biologisch geprüften Muster einer authentischen Probe identisch ist.

Beispiel 2

Man wiederholt Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß Beneckea hiperoptica ATCC 15803 an Stelle von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 verwendet wird. Cephalexin gebildet: 100%.

Beispiel 3

1,3 1 eines Mediums (pH 7,0), das aus 3% Glukose, 1% Hefeextrakt, 0,1% K_nHPC,, 0,05% MgSO₄ -7 H_nO, 0,05% KCl und 0,001% FeSO₄ besteht, werden bei 120° C 20 Minuten lang sterilisiert, aseptisch in jeweils 100-ml-Portionen unterteilt und in 500-ml-Kolben gegeben, mit einem Stamm von Achromobacter B-402-2 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung gezüchtet.

1 1 Kulturbrühe wird zentrifugiert, und die so erhaltenen feuchten nativen Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 1,2 1 einer 0,1-m-Phosphatpufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 400 ml wäßrige Lösung, die 5 mg/ml 7-ADCA und 50 mg/ml D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, und stellt die Mischung bei 37° C 2 Stunden lang in den Brutschrank. Man stellt fest, daß in der Reaktionsmischung 98,8% Cephalexin gebildet worden sind.

Beispiel 4

Man wiederholt Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß Beneckea hiperoptica ATCC 15803 an Stelle von Achromobacter B 402-2 NRRL B-5393 verwendet wird.

Cephalexin gebildet: 99%.

65 Beispiel 5

Ein wäßriges Medium (pH 7,0), das 3% Glukose. 1% Hefeextrakt, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,05 KCl und 0,001 % FeSO₄ enthält, wird mit einem Stamm Beneckea hiperoptica ATCC 15803 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. 1 1 der Kulturbrühc wird zentrifugiert, und die isolierten nativen feuchten Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, danach zentrifugiert und in 1 1 destilliertem Wasser suspendiert. Man gibt 8 1 Aceton hinzu und erhält dabei durch Aceton gepulverte Zellen. 165 mg des Acetonpulvers werden in 5 ml eines 0,1 m PhosphatpufTers (pH 6,5) suspendiert, dazu gibt man eine wäßrige Lösung von 2 ml 7-ADCA (5 mg/ml) und 2 ml D-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid (50 mg/ml) und 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,5), so daß sich eine Reaktionsmischung von 100 ml ergibt; diese Reaktionsmischung wird bei 37³ C 90 Minuten lang in den Brutschrank gestellt. Das in der erhaltenen Reaktionsmischung gebildete Cephalexin wird quantitativ bestimmt, man findet 90,5%.

Beispiel 6

500 mg mit Aceton gepulverte Zellen von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393, erhalten nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren, werden in 100 ml einer 0,1m Phosphatpufferlösune (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 50 ml wäßrige 7-ADCA-Lösung (4 mg'ml) und 50 ml wäßrige D-Phenylglycinmethylester-Lösung (20 mg'ml). Nach 2stündigcm Bebrüten bei 37° C wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, und man erhält einen Überstand, der 1260 ;-/ml Cephalexin enthält, Acylierungsausbeute 80,3 %.

Der Überstand wird auf eine Kolonne (2 · 20 cm) eines Polystyrol-Anionenaustauscherharzes in der Acetatform gegeben. 400 ml der durchgelaufenen Lösung werden nach dem Waschen mit Wasser auf pH 8,0 eingestellt und erneut in eine Kolonne (2-15 cm) mit einem Polystyrol-Anionenaustauscherharz in der Acetatform gegeben. Anschließend wird mit 0,05 m Essigsäure eluiert, wobei jede Fraktion (etwa 15 ml) dünnschichtchromatographisch geprüft wird. Die cephalexinhaltigen Fraktionen werden aufgefangen, und man erhält 490 mg CephalexinpulveJ aus der Gefriertrocknung. Die UV-spektroskopische Untersuchung zeigt, daß das Pulver 6O°/oige Reinheit besitzt. Dieses getrocknete Pulver wird durch isoelektrische Ausfällung gereinigt, und man erhält 294 m weißes Pulver (Ausbeute 90%, Reinheit 98%, Ge samtausbeute 88%).

Beispiel 7

A. 20 1 wäßriges Medium (pH 7,0), das 3 % GIu kose, 1% Hefeextrakt, 0,1% K₁HPO₁, 0,05°/ MgSO₄ · 7 H₂O, 0,05% KCl und 0,001 % FeSO₄ ent hält, gibt man in ein 30-1-Fermentationsgefäß, steri lisiert 20 Minuten lang bei 120° C und gibt daz' aseptisch 400 ml Saatkultur, die zuvor im gleiche Medium gezüchtet worden ist, von Achromobact B-402-2 NRRL B-5393 und kultiviert unter aerobe Bedingungen bei einer Belüftung von 20 l/min, ein Rührung von 300 UpM 72 Stunden lang bei 26°
Nach der Fermentation werden die Bakterienzell· durch Zentrifugieren isoliert, zweimal mit physiolo^ scher Salzlösung gewaschen, wobei man 170 g feuch native Zellen erhält.

B. 3 g der oben in A erhaltenen nativen Zeil
werden in 100 ml einer 0.1m Acetatpufferlösu

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(pH 6,0) suspendiert. Dieser Suspension gibt man unter Rühren zu 180 g Diäthylaminoäthanolcellulose in 1,5 1 einer 0,1 m Acetalpufterlösung bei 0° C. Nach östündigem Stehen gewinnt man das Enzympräparat auf fester Phase.

Das Enzympräparat wird in eine Kolonne (3,5 · 47,5 cm) gefüllt, danach mit 0,1m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen, dann werden 12 1 einer 0,16 m AcetatpurTerlösung (pH 6,0), die 0,1 %> 7-ADCA und 0,5 ⁰Zo D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, innerhalb 24 Stunden hindurchgeschickt.

Die so erhaltenen 121 Eluat schickt man durch eine Kolonne mit 120 g Aktivkohle (7,2 · 13 cm), um das Cephalexin zu adsorbieren, dann wäscht man mit Wasser und eluiert mit einem Lösungsmittelgemisch aus Aceton/0,5 n-Essigsäure (1:1).

1 1 der cephalexinhaltigen aktiven Fraktionen wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit einer Mischung aus Wasser und Acetonitril umkristallisiert, um das Cephalexin abzutrennen, das mit warmem Wasser gewaschen und dann getrocknet wird, wobei man 12,3 g Kristalle erhält; Ausbeute: 60» o.

Das Produkt zeigt einen einzigen Fleck bei einer dünnschichtchromatographischen Prüfung auf Kieselgel. Das NMR-Spektrum zeigt die Identität der beiden Verbindungen. Reinheit: 9O°/o auf Grund der Bioautographie und UV-Absorption.

Beispiel 8

40 g native Zellen, erhalten im Verfahren des Beispiels 7 A, werden in 30 ml destilliertem Wasser suspendiert und zu 1 1 Aceton gegeben, wobei man durch Filtration 10 ε acetongetrockneter Zellen erhält.

160 mg der getrockneten Zellen von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 suspendiert man in 4 ml einer 0,1 m AcetatpurTerlösung (pH 6,0) und gibt sie unter Rühren zu 10 g Diäthylaminoäthanolcellulose in 20 ml einer 0,1m Acetatpufferlösung (pH 6,0). Nach 6stündigem Steher, wird der Träger, der die Mikroorganismenzellen adsorbiert hat (= das Enzympräparat auf fester Phase), in eine Kolonne (1 · 26 cm), gefüllt und mit 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen. Dann schickt man 100 ml einer 0,1m AcetatpurTerlösung (pH 6,0), die 0,1 % 7-ADCA und 0,5% D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, innerhalb 5 Stunden hindurch. Die Acylierung, geprüft als Cephalexin im Eluat, beträgt 85 %.

Beispiel 9

Man wiederholt Beispiel 8, mit der Ausnahme, daß die folgenden Träger an Stelle von Diäthylaminoäthanolcellulose für die Herstellung von Cephalexin verwendet werden.

Träger

Gebildetes Cephalexin )

Carboxymethylcellulose
Triäthylaminoäthanolcellulose

40 80

Beispiel 10

Zu einer Suspension von 4 g getrockneter Zellen von Achromobacter B-402-2, erhalten in Beispiel 8, in 500 ml einer 0,1 m AcetatpurTerlösung (pH 6,0) gibt man 50 mg Lysozym, inkubiert 60 Stunden lang bei 37° C und gibt 2 mg Desoxyribonuclease hinzu und inkubiert weitere 10 Minuten lang.
ίο Die Reaktionsmischung wird zentrifugiert, man gibt 10 g Hydroxyapatit zu 200 ml des Uberstandes und läßt danach 1 Stunde lang stehen.

Das Enzympräparat auf fester Phase wird in eine Kolonne gefüllt, und die Enzymreaktion wird wie in Beispiele durchgeführt, wobei man 90⁰Zo Cephalexinbildung findet.

Beispiel 11

100 ml wäßriges Medium, das 3 % Glukose, 1⁰Zo Hefeextrakt, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄- 7 H.,0, 0,05% KCl und 0,001 % FeSO₄ enthält, wird 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit Beneckea hiperoptica

ATCC 15803 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. Die Kulturbrühe wird auf pH 6,5 eingestellt, die Bakterienzellen werden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 isoliert, wobei man 200 mg trockene

Zellen erhält. Dann werden die in Beispiel 8 verwendeten getrockneten Zellen von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 durch 200 mg der oben erhaltenen getrockneten Mikroorganismenzellen ersetzt, um mit ihnen das Cephalexin herzustellen.

Gebildetes Cephalexin: 80 %.

Beispiel 12

600 1 eines Mediums (pH 7,0), das 4 % Glukose, 1,2% Hefeextrakt, 0,15% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,05% KCl und 0,001% FeSO₄ enthält, werden mit 301 Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 Saatkultur angeimpft und submers

kultiviert, wobei man 72 Stunden lang bei 26° C belüftet. Nach der Fermentierung werden die Bakterienzellen durch Abzentrifugieren aus 5701 Brühe isoliert. Die nativen, feuchten Zellen, die 970 g trockenen Zellen entsprechen, werden in 27 1 einer

0,1 m Acetaipufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Dann gibt man 1,18 kg 7-ADCA (Reinheit 84,8%) und 30 kg D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid hinzu und gibt schließlich 0,1 m Acetatpuffer (pH 6,5) hinzu, bis das Volumen der Reaktionsmischung 200 1 beträgt. Die Reaktionsmischung wird bei 37° C 3 Stunden lang unter Rühren bebrütet. In der Reaktionsmischung werden 1,28 kg Cephalexin auf Grund des UV-Absorptionsspektrums ermittelt (Acylierung 80 %). Die Lösung wird zentrifugiert und nitriert. Zur

klaren Lösung gibt man 4 kg Aktivkohle, und nach der Filtration wird die wäßrige Schicht im Vakuum eingeengt, wobei man 1,03 kg Cephalexin erhält (Ausbeute: 64%, Reinheit: 98%).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 7-(D-a.-Aminophenylacetamidoi-desacetoxycephalosporansäure, dadurch gekennzeichnet, daß 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure mit D-Phenylglycin-methyl- oder -äthylester in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines acylierenden Enzyms, das von einem Mikroorganismus des Stammes Achromobacter B-402-2 NRRLB-5393 oder Beneckea hyperoptica ATCC 15803 stammt, bei 20 bis 45° C und einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 umgesetzt wird.

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