DE2212276C3 - Verfahren zur Herstellung von 7-Aminodesacetoxy-cephalospora nsäure - Google Patents

Description

R —CO-NH

v\ ω

I CH, COOM

in welcher R eine Benzyl- oder Phenoxymethylgruppe ist; und M ein Alkalimetallatom ist, welches fähig ist, ein wasserlösliches Salz zu bilden; mit einem Kulturfiltrat von Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr. 748 oder mit einer Enzymzubereitung, welche sich von diesem enzymerzeugenden Stamm herleitet, in einem wäßrigen Medium behandelt und die gebildete 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure in üblicher Weise isoliert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym auf Kieselgur adsorbiert.

lat, welches von Phenoxymethylpenicillin hergeleitet ist, in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Pyridin mit PCI5 behandelt wird und das sich ergebende Imidchlorid mit einem Alkohol behandelt wird, wobei sich ein Imidester bildet, welcher dann der Hydrolyse unterworfen wird (belgische Patentschriften 717 741 von 1969 und 7 37 761 von

1970).
Sämtliche obenerwähnten Verfahren sind jedoch chemische Zersetzungsprozesse, und es ist kein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-ADCA vorgeschlagen worden.

Erfindungsgemäß soll nun 7-ADCA mit Vorteil auf enzymatischem Wege erzeugt werden. Es wurde über-

raschenderweise gefunden, daß ein Stamm B-400, welcher zur Gattung Bacillus gehört und welcher aus Erdböden isoliert worden ist, ein Enzym produziert, welches in der Lage ist, die Amidbindungen von 3- Methyl-7-phenoxyacetamido-Δ ^s-cephem-4-car-

bonsäure und S-Methyl^-phenylacetamido-d'-cephem-4-carbonsäure zu spalten, wobei 7-ADCA erzeugt wird, welche an sich inaktiv ist, jedoch mit Hilfe von Phenylacetylchlorid quantitativ in das zweitgenannte Produkt rückverwandelt werden kann.

Mycologische Eigenschaften des obenerwähnten Stammes B-400 sind die folgenden:

I. Morphologische Eigenschaften (Schrägkultur auf Agarbrühe, 18 oder 24 Stunden bei 3O⁰C):

(1) Zellen stabförmig, hauptsächlich in langen Ketten, runde Enden.

(2) Größe 1,2 bis 1,5 · 2,0 bis 3,5 Mikron.

(3) Kein Häutchen.

(4) Beweglich mit Geißeln (am Umfang).

(5) Grampositiv.

(6) Sporen (Sojabohnenagar, 5 Tage bei 3O⁰C): Größe: 1,0 bis 1,2 · 1,5 bis 2,0 Mikron.
Gestalt: oval.

Lage zentral bis para-zentral.
Sporangia nicht deutlich gequollen.

II. Verhalten auf verschiedenen Kulturmedien:

45

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure (nachstehend als »7-ADCA« bezeichnet) durch cnzymatisches Deacylieren von Alkalisalzen der 7-Phenylacetamido- oder Phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure. Die Ausgangsverbindungen werden auch als 3-Methyl-7-phenoxyacetamido-J^B-cephem-4-carbonsäure bzw. 3-Methyl-7-phenylacetamido-<4 *-cephem-4-carbonsäure bezeichnet.

Bisher wurde 7-ADCA hergestellt nach einem Verfahren, bei welchem Cephalosporin C katalytisch in Anwesenheit von Palladium-Kohle zur Erzielung von 3-Methyl-7-^-aminoadipoylamido)-/l^s-cephem-4-carbonsäure reduziert wird, welche dann durch Hydrolyse deacyliert wird (US-Patentschrift 31 24 576 von 1964); ferner nach einem Verfahren, bei welchem 7-Aminocephalosporansäure durch katalytische Reduktion deacyliert wird (die gleiche US-Patentschrift wie obenerwähnt); und nach einem Verfahren, bei welchem 3- Methyl-7-phenoxyacetamido-zl ^s-cephem-4-carboxy-

(1) Agarbrühen-Strichplatte (30⁰C, 24 Stunden):
gutes Wachstum, kreisförmig, konvex, sich nicht ausbreitend, weiß bis blaßgelb, glänzend, weich, naß, durchscheinend; keine Farbänderung des Mediums.

(2) Brühagar-Schrägrohre (30⁰C, 24 Stunden): gutes Wachstum, Oberfläche glatt, sich nicht ausbreitend, glänzend, naß. Kolonien milchigweiß, durchscheinend; keine Farbänderung des Mediums.

(3) Brühe (30⁰C, 2 Tage): gutes Wachstum, einheitliche Trübung mit Sediment; kein Häutchen.

(4) Brühen-Gelatinestich (30⁰C, 20Tage): Oberflächenwachstum zum Zentrum längs Stichlinie. Keine Gelatineverflüssigung.

(5) Lakmusmilch (3O⁰C, 20Tage): nicht peptonisiert; Lakmuspigment ist reduziert; Kulturflüssigkeit wird gelblichbraun.

(6) Sojabohnenagar-Schrägkulturen (30⁰C, 24 Stunden): gutes Wachstum, weiß bis gelblichweiß, Oberfläche glatt und weich. Gute Sporenbildung.

(7) Glucosenitratagar-Schrägkultur (3O⁰C, 3 Tage):

Wachstum knapp.

(8) Tyrosinagar-Schrägkulturen (3O⁰C, 3 Tage): gutes Wachstum; Medium ist gebräunt.

(9) Kartoffel (30⁰C, 5 Tage): gutes Wachstum; Kolonien rosa bis braun, Oberfläche glatt und naß, konvex und glänzend; Medium ist an etwa dem 3. Tag gebräunt.

III. Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimale Wachstumsbedingungen: aerob bei pH 7,0 bis 8,0 und 28 bis 35° C.

(2) Wachstumsbedingungen: aerob, bei pH 5 bis 10 und 7 bis 45⁰C.

(3) Säurebeständigkeit: gering, kein Wachstum bei unterhalb pH 5,0.

(4) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob, kein Wachstum in Glucosebrühe unter anaeroben Bedingungen.

(5) Indol wird nicht erzeugt.

(6) Schwefelwasserstoff wie erzeugt.

(7) Denitrifizierungsreaktion: keine Gasbildung.

(8) Nitrate werden reduziert.

(9) Katalasebildung: positiv.

(10) Ureasebildung: positiv.

(11) Stärke wird hydrolysiert.

(12) Citrate werden ausgenutzt (in Medien nach K ο s e r und Christensen).

(13) Lakmuspigment wird reduziert.

(14) Methylenblau wird reduziert.

(15) Wasserlösliches Pigment wird in Kartoffelmedium gebildet.

IV. Fermentative Spaltbarkeit von Kohlehydraten:

Kohlehydrate

Säurebildung Gasbildung

Arabinose

Xylose

Glucose

Mannose

Fructose

Galactose

Ribose

Rhamnose

Maltose

Saccharose

Lactose

Trenalose

Raffinose

Cellobiose

Sorbit

Mannit

Inosit

Glycerin

Glucit

Salicin

Inulin

Stärke

35

40

45

Bacillus	Bacillus
mega ten um	megaterium
B-400	var. penicillalyticum
	ATCC 14 945

55

Bei der Prüfung der taxonomischen Stellung des Stammes B-400 mit den obenerwähnten mycologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, wurde identifiziert, daß der Stamm zur Gattung Becillus megaterium gehört. Demgemäß wurde der Stamm B-400 mit der Typenkultur verglichen, welche von der American Type Culture Collection (ATCC) gesendet wurde, um zu erkennen, daß der Stamm ähnlich Bacillus megaterium var. penicillalyticum ATCC 14 945 war, jedoch in den folgenden Punkten hiervon unterschiedlich ist:

Gelatinever	kaum Verflüssi	allmähliche
flüssigung	gung	Verflüssigung
Lakmusmilch	Pigment ist	Pigment wird
	reduziert	alkalisch und ist
		nicht reduziert
Kartoffelagar-	Bildung von	keine Pigment
Schrägkulturen	wasserlöslichem	bildung
	braunen Pigment
Säurebildung	Säurebildung	keine
aus Mannose		Säurebildung

Aus dem obigen wurde erkannt, daß der Stamm B-400 ein neuer Stamm ist, welcher der Gattung Bacillus megaterium angehört. Der Stamm B-400 wurde hinterlegt unter der Nummer »FERM-P Nr. 748« im Research Institute of Microorganism Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Japan.

Das Enzym, welches in der Lage ist, die Amidbindung von 7-Phenylacetamido- oder -Phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure zu spalten, wird erhalten, indem man Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr. 748 bei 25 bis 37⁰C 12 bis 60 Stunden in einem Medium aerob kultiviert, welches gewöhnlich zum Kultivieren von Bakterien verwendet wird, beispielsweise in einem Nährmedium mit einem Gehalt an angemessenen Mengen einer Stickstoffquelle wie Pepton, Fleischextrakt, Getreideeinweichlauge, Hefeextrakt, Trockenhefe, zersetztes Sojabohnenprotein oder Sojabohnenextrakt; an einer Kohlenstoffquelle wie Melasse, Glucose oder Glycerin; und anorganischen Salzen; und, in einigen Fällen, anderen wachstumsfördernden Substanzen. Im allgemeinen bewirkt man ein Luftrühren der Kultur in Flüssigkeit.

Das obenerwähnte Enzym ist ein Exo-Enzym und liegt in einem Kulturfiltrat vor, welches von den Zellen befreit ist. Bei der Enzytnreaktion wird daher das Enzym in Form eines Kulturfiltrats oder einer Enzymzubereitung verwendet, welche aus dem Kulturfiltrat bereitet wurde. Diese Enzymzubereitung wird erhalten, indem man das Enzym einer bekannten Reinigungsmethode unterwirft. Beispielsweise wird es erhalten, indem man das Kulturfiltrat konzentriert oder nicht konzentriert und man das Enzym durch Halbsättigung oder Sättigung mit einem löslichen Salz wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid auffällt oder dieses durch Hinzusetzen einer_hydrophilen organischen Verbindung wie Methanol, Äthanol oder Aceton ausfällt. Die Ausfällung löst man in Wasser auf, und die sich ergebende Lösung wird unter Verwendung einer semipermeablen Membrane dialysicrt, wodurch niedermolekulare Verunreinigungen entfernt werden können. Man kann aber auch, wobei man aus dem Unterschied der Adsorptionsaffinität für ein Adsorptionsmittel oder Gelfiltermittel Vorteil zieht, niedermolekulare Verunreinigungen, gefärbte Substanzen, Proteine und ähnliche Stoffe in der Kulturflüssigkeit wirksam abtrennen gemäß einer gewöhnlichen Arbeitsweise wie Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration. Die gemäß den obenerwähnten Arbeitsgängen erhal-

5 6

tene Enzymlösung kann der Konzentrierung unter Enzyms zum Träger. Beim Adsorbieren des Enzyms

vermindertem Druck, dem Gefriertrocknen oder nach der ansatzmäßigen Arbeitsweise kann jedoch die

ähnlichen Operationen unterworfen werden, um ein Menge an verwendetem Träger etwa 5 bis 15%

Standardenzymprodukt in Form eines Feststoffes zu (Gew./Vol.), bezogen auf die Menge des Kulturfiltrats,

erhalten, oder sie kann, wie sie ist, zur Behandlung 5 sein. Im Falle der Adsorption nach der ansatzmäßigen

der 7-Phenylacetamido- oder Phenoxyacetamido-des- Arbeitsweise rührt man ein Gemisch des Kulturfiltrats

acetoxy-cephalosporansäure verwendet werden. FaHs und des Trägers, und dann trennt man den Träger ab

die Ettzymzubereitung weiter gereinigt werden muß, und wäscht ihn mit Wasser. Im Falle des Adsorbieren

kann man irgendeines der gewöhnlichen Mittel an- nach der kolonnenmäßigen Arbeitsweise benetzt man

wenden, welche man zum Reinigen von Proteinen und io den in eine Kolonne gepackten Träger mit Wasser

Enzymen anwerbet, beispielsweise ein Adsorptions- oder mit Pufferlösung, welche auf den stabilen pH-Wert

mittel oder ein Gelfiltermittel. des deacylierenden Enzyms eingestellt ist, mm läßt

Die Enzymreaktion wird in solcher Weise durch- das Kulturfiltrat durch die Kolonne gehen, und dann

geführt, daß das Alkalisalz des Cephalosporins in wäscht man die Kolonne mit Wasser, wodurch ein

Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst und dann 15 Träger erhalten werden kann, auf welchem das

mit der obenerwähnten Enzymzubereitung behandelt deacylierende Enzym adsorbiert ist.

wird. Das Cephalosporin bringt man gewöhnlich in Wenn der so erhaltene Träger mit adsorbiertem

die Form eines wasserlöslichen Natrium- oder Kalium- deacylierendem Enzym getrocknet wird, so neigt das

salzes und verwendet es in einer Konzentration inner- deacylierende Enzym dazu, inaktiviert zu werden,

halb des Bereiches von 0,1 bis 20 Milligramm/cm³, 20 Demgemäß ist es erwünscht, daß der Träger in der

vorzugsweise von etwa 2 bis 5 Milligramm/cm^s. nachfolgenden eazymatischen Deacylierungsreaktion

Der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit wird Vorzugs- in einem nassen Zustand verwendet wird, ohne geweise innerhalb des Bereiches von etwa 7 bis 8 ge- trocknet zu werden.

halten. Die Reaktionstemperatur beträgt 30 bis 45°C, Die beim erfindungsgemißen Verfahren verwendete vorzugsweise etwa 35 bis 40⁰C, wodurch günstige 25 7-Phenylacetamido- oder Phenoxyacetamido-desacet-Ergebnisse erzielt werden können. Die Reaktionszeit oxy-cephalosporansäure kann nach bekannten Vervariiert je nach den Reaktionsbedingungep, beträgt fahren bereitet werden, beispielsweise nach einem Verjedoch gewöhnlich etwa 5 bis 30 Stunden. Die Reak- fahren, bei welchem man einen Benzyl- oder Phenoxytion kann in einem geeigneten Stadium beendet wer- methyl-pemcillinsulfoxydester der Ringausdehnung den, wobei man die Zeit prüft, bei welcher die Ausbeute 30 unterwirft (US-Patentschrift 32 75 626, belgische Pader 7-ADCA ein Maximum wird. Man kann das tentschrift 6 96 026, niederländische Patentveröffenterfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise aber lichung 68 06 532, belgische Patentschrift 7 45 845, auch in der Weise durchführen, daß man das Enzym britischen Patentschrift 12 04 394 und belgische Patentauf einem Träger adsorbiert. Dabei ist es erforderlich, Schriften 7 47 118, 7 47 119 und 7 47120) und daß den Träger unter Betrachtung der Gesichtspunkte 35 man den sich ergebenden 7-Acylamino-desacetoxyauszuwählen, daß er das deacylierende Enzym adsor- cephalosporansäureester entestert oder nach einem bieren kann, ohne dieses zu inaktivieren; daß er das Verfahren, bei welchem man Phenylacetamido- oder Enzym selbst beim Waschen mit Wasser nicht freigibt Phenoxyacetamido-cephalosporansäure entacetoxyliert und daß er die sich ergebende 7-ADCA nicht oder (US-Pitentschrift 32 75 626).

kaum adsorbiert. Wenn beispielsweise ein anorga- 40 Die obenerwähnte Enzymreaktion wird im allge-

nischer Träger, wie aufbereitete Kieselgur, Terra alba, meinen nach der kolonnenmäßigen Arbeitsweise

aktiver Ton, Kaolin, Aktivkohle oder Silicagel, ein durchgeführt, weil diese Reaktion kontinuierlich

Ionenaustauscher wie Carboxymethylcellulose oder bewirkt werden kann. Die Konzentration des hinzu-

mit Epichloi hydrin 3-dimensional vernetztes Carboxy- zusetzenden Cephalosporins variiert hauptsächlich

methyldextran oder ein Ionenaustauschharz wie ein 45 je nach dem Enzymtiter, d. h. je nach Deacylierungs-

schwach saurer Ionenaustauscher für chromatogra- vermögen des deacylierenden Enzyms, sowie nach der

phische Zwecke oder ein kernsulfonierter Polystyrol- Strömungsgeschwindigkeit, doch wird sie erwünschter-

harz-Ionenaustauscher als Träger verwendet wird, so maßen unter Betrachtung des Punktes entschieden,

wird das durch Bacillus megaterium ß-400 Ferm-P daß die Menge des nicht reagierten Cephalosporins,

Nr. 748 erzeugte deacylierende Enzym gut adsorbiert 50 welches in der ausfließenden Reaktionsflüssigkeit

ohne inaktiviert zu werden, jedoch wenn Aluminium- zurückbleibt, nicht größer wird. Im allgemeinen beträgt

oxid, Cellulosepulver, Diäthylaminoäthylcellulose, ver- die Konzentration an Cephalosporin 0,1 bis 2,0%

netztes Diäthyldextran oder Anionenaustauschharz (Gew. Vol.), vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,0% (Gew./

verwendet wird, so wird das deacylierende Enzym Vol.), doch erübrigt es sich, auszuführen, daß die

kaum adsorbiert, oder es wird inaktiviert, selbst wenn 55 Konzentration, je nach der Art des verwendeten Trä-

es adsorbiert worden ist. gers, mehr oder weniger variiert. Die obenerwähnte

Beim Adsorbieren des deacylierenden Enzyms auf Reaktion vollzieht man natürlich bei angemessenem

dem Träger ist es erwünscht, daß der pH-Wert des pH-Wert und angemessener Temperatur, vorzugs-

Kulturfiltrats vorher auf den für das deacylierende weise bei optimalem pH-Wert und optimaler Tempe-

Enzym stabilen pH-Wert eingestellt ist. Beispielsweise 60 ratur, des dcacylierenden Enzyms. Jedoch ist es wün-

stellt man beim Adsorbieren auf Kieselgur den pH-Wert sehenswert, daß verschiedene Reaktionsbedingungen

des Kulturfiltrats im aligemeinen auf etwa 6 bis 8 ein. so ausgewählt werden, daß die in der Reaktionsflüssig-

Das Adsorbieren des deacylierenden Enzyms auf keit gebildete 7-ADCA mit einer Konzentration ausdem Träger kann gemäß irgendeiner der ansatzmäßigen fließt, welche so hoch wie möglich ist. Die Reaktionsoder kolonnenmäßigen Arbeitsgänge ausgeführt wer- 65 zeit kann richtig variiert werden, indem man die den. Die anzuwendende Trägermenge variiert je nach Menge an zugesetzter wäßriger Cephalosporin-Lösung der Menge und dem Enzymtiter des Kulturfiltrats und steigert oder vermindert. Im allgemeinen ist die je nach dem Adsorplioiisverhältnis des deacylierrtn! 1 Reaktion vollendet, bevor wäßrige Cephalosporin-

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Lösung durch die Trägerschicht in der Kolonne hin- Methoden zur Bestimmung von 7-ADCA

durchgegangen ist. Wenn jedoch das Deacylierungs- ₍₁₎ Bestimmungsmethode 1

verhältnis niedrig gewesen ist und eine große Menge

an Cephalosporin in der Reaktionsflüssigkeit zurück- Die Reaktionsflüssigkeit unterwirft man dem Mikro-

geblieben ist, so setzt man die Reaktionsflüssigkeit, 5 Organismustest (37⁰C, 16 Stunden) gemäß der Papierso wie sie ist, erneut zu der Trägerschicht hinzu, oder Scheibenmethode oder der Bechermethode unter Verman setzt sie zu einer anderen Trägerschicht hinzu, Wendung von Bacillus subtilis PCI-219 als Teststamm, welche das deacylierende Enzym adsorbiert aufweist, und man mißt den Durchmesser des Kreises, welcher wodurch eine Reaktionsflüssigkeit erhalten werden das Wachstum hemmt. Aus der Standardkurve von kann, deren Deacylierungsverhältnis hoch ist. io ß-Methyl^-phenvlacetainido- bzw. 3-Methyl-7-phen-

Wenn es gewünscht ist, die obenerwähnte Enzym- oxyacetamido-J*-cephem-4-carbonsäure berechnet reaktion kontinuierlich durchzuführen, so ist es aus- man die Menge an Cephalosporin, und die Mengenreichend, die wäßrige Cephalosporin-Lösung kontinu- differenz zwischen dem Ausgangs-Cephalosporin und ierlich der Trägerschicht mit adsorbiertem, deacy- dem restlichen Cephalosporin wird wiedergegeben als lierendem Enzym hinzuzusetzen. Jedoch wegen der 15 Prozentsatz gegenüber dem Ausgangs-Cephalosporin. schädlichen Einwirkung diverser Bakterien neigt das Dieser Prozentsatz ist das Zersetzungsverhältnis des Deacylierungsverhältnis dazu, allmählich täglich abzu- Ausgangs-Cephalosporins. nehmen. Wenn man zum Oberteil der Kolonne oder . ^j-.

zum Substrat Toluol hinzugesetzt hat, so kann die <²> Bestimmungsmethode 2

schädliche Auswirkung infolge Verunreinigung auf ein ao Eine bestimmte Menge an Reaktionsflüssigkeit stellt Mindestmaß herabgesetzt werden. man unter Verwendung von 1 η-Salzsäure auf einen

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man eine pH-Wert von 2,5 ein, man wäscht dreimal mit einer Trägerschicht für mehr als 10 Tage verwenden, so daß Hälfte dieser Menge an Butylacetat, und man stellt die 7-ADCA in hoher Ausbeute gewonnen und mit dann unter Verwendung einer wäßrigen 1 n-Natriumgeringen Kosten hergestellt werden kann. Demgemäß »5 hydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein. Anist das erfindungsgemäße Verfahren ein höchst vor- schließend behandelt man eine bestimmte Menge der teilhaftes Verfahren zur Herstellung von 7-ADCA so behandelten Reaktionsflüssigkeit mit einem Säuredurch enzymatische Deacylierung von 3-Methyl- chlorid, welches der Säure auf der Seitenkette des 7-phenylacetamido- oder 3-Methyl-7-phenoxyacet- Ausgangs-Cephalosporins entspricht und unterwirft amido-^d ⁸-cephem-4-carbonsäure. 30 dann dem gleichen Mikroorganismustest wie in Be-

Die Gewinnung der 7-ADCA aus der so erhaltenen Stimmungsmethode 1. Aus der Menge des sich erge-Reaktionsflüssigkeit kann gemäß bekannten Arbeits- benden Cephalosporins berechnet man rückwärts die gangen durchgeführt werden. Beispielsweise stellt man Menge an 7-ADCA, welche dann als Prozentsatz die Reaktionsflüssigkeit auf einen pH-Wert von etwa 2 wiedergegeben wini. Dieser Prozentsau ist die Ausein und wäscht mit einem hydrophoben 01 ganischen 35 beute an 7-ADCA. Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat oder

Methylisobutylketon zum Entfernen von nicht umge- (3) Bestimmungsmethode 3

setztem Cephalosporin, dann konzentriert man die Trinitrobenzolsulfonatmethode

wäßrige Schicht und stellt unter Abkühlen auf einen

pH-Wert von etwa 3,7 ein, um die 7-ADCA isoelek- 40 Zu 1 cm* einer Probe setzt man 2 cm* einer trisch auszufällen. Man kann aber auch die Reaktions- 0,3 m-Phosphatpufferlösung (pH 8,0) und 2 cm* einer flüssigkeit auf einen pH-Wert von etwa 3,7 einstellen, 0,1 %igen Trinitrobenzolsulfonat-Lösung hinzu, und konzentrieren und dann abkühlen, und man wäscht das sich ergebende Gemisch läßt man in der Dunkeiden sich ergebenden Niederschlag zwecks Entfernen heit bei 50^cC 90 Minuten reagieren. Nach dem Abvon nicht umgesetztem Cephalosporin und nebenher 45 kühlen gibt man zu der Reaktionsflüssigkeit 1 cm* gebildeter Carbonsäure mit Aceton. 6 η-Salzsäure hinzu, und man mißt die Absorption

bei 395 Γημ. Die Menge an 7-ADCA wird aus der Standard-Kurve von 7-ADCA berechnet.

a) 20 Liter eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0}

Ein Träger, auf welchem das deacylierte Enzym mit einem Gehalt an 1 % Polypepton, 1 % Hefeextrakl

adsorbiert ist, wird in einem L-förmigen Testrohr und 0,5 % Natriumchlorid gibt man in einen 30-Liter-

gewogen. Zu dem Testrohr setzt man 4,5 cm* einer Schüttelfermentator, und man sterilisiert 20 Minuter

O.lmolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,5) hinzu, und 55 mit Wasserdampf bei 120⁰C. Danach überträgt mar

das Testrohr schüttelt man 10 Minuten in einem 200 cm* einer Saatkulturflüssigkeit von Bacillus mega

Thermostatschüttler, welcher bei 37⁰C gehalten wird. terium B-400 FERM-P Nr. 748, welche bei 30⁰C

Anschließend setzt man 0,5 cm* (10 Milligramm je cm* 24 Stunden in einem Kulturmedium der gleichen Zu

als freie Säure ausgedrückt) einer wäßrigen Lösung sammensetzung wie oben kultiviert -worden ist, unte

des Natriumsalzes der 7-Phenylacetamido-desacetoxy- 60 sterilen Bedingungen in das obengenannte Kultur

cephalosporansäure hinzu, und das sich ergebende medium, und man fermentiert 48 Stunden bei 30 °(

Gemisch läßt man 30 Minuten reagieren. Nach der mit Belüftung und Rühren bei einer Lufteinführung:

Reaktion kühlt man die Reaktionsflüssigkeit sofort geschwindigkeit von 20 Litern je Minute und eine

ab, und 7-ADCA in der Reaktionsmutterlauge, welche Rührgeschwindigkeit von 300 U/Min. Nach de

vom Träger befreit ist, wird gemäß der Trinitrobenzol- 65 Fermentierung werden die Zellen mittels eines Zer

sulfonat-Methode bestimmt. trifugaltrenners entfernt, und man erhält 17,4 Litt

Ein Enzymtiter, welcher 100 y/cm* 7-ADCA bildet, eines Kulturnitrats,

wird dafür gehalten, daß er 100 Einheiten ( ') ist. b) Das Kulturnitrat, welches in a) erhalten wurdi

konzentriert man bei einer Außentemperatur von 30 bis 35⁰C auf ^l/₃, und das Konzentrat beschickt man mit Ammoniumsulfat, bis eine 80%ige Sättigung erreicht wird. Den abgeschiedenen Niederschlag löst man in destilliertem Wasser auf, und man entsalzt unter Verwendung einer Kolonne mit 3-dimensional vernetztem Dextran. Die entsalzte Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 24,3 g eines Standard-Enzymproduktes.

c) 20 Liter eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0) mit einem Gehalt an 0,5 % Glucose, 0,3 % Glycerin, 1 % Fleischextrakt und 1 % Polypepton gibt man in einen Schüttelfermentator von 30 Liter Inhalt, und man sterilisiert 20 Minuten mit Wasserdampf bei 12O⁰C. Danach überträgt man 200 cm³ einer Saatkulturlauge von Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr. 748, welche 24 Stunden bei 30°C in einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben kultiviert worden ist, unter sterilen Bedingungen in das obengenannte Kulturmedium, und man fermentiert bei 30⁰C 72 Stünden mit Belüftung und Rühren bei einer Lufteinführungsgeschwindigkeit von 20 Litern je Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/Min. Nach dem Fermentieren werden die Zellen mittels eines Zentrifugalabtrenners entfernt, und das Filtrat konzentriert man bei einer Außentemperatur von 30 bis 35⁰C auf Va- Das Konzentrat beschickt man mit Aceton, bis die Acetonmenge 60% wird, und den ausgefallenen Niederschlag gewinnt man durch Abfiltrieren und Trocknen, wobei 25,5 g eines Standard-Enzymproduktes erhalten werden.

d) Das in a) erhaltene Kulturfiltrat von Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr. 748 stellt man auf einen pH-Wert von etwa 7 ein. Zu je 1 Liter des Kulturfiltrats setzt man einzeln je 50 g Kieselgur, Aktivkohle für Chromatographie, Carboxymethylcellulose-Ionenaustauscher 0,52 mcg/g und schwach sauren Ionenaustauscher für chromatographische Zwecke (Η-Form) hinzu, und man rührt das entstehende Gemisch für etwa 30 Minuten. Während dieser Zeit hält man den pH-Wert stets bei etwa 7. Danach gewinnt man jeden Träger durch Abfiltrieren und wäscht dann mit Wasser, wobei man einen nassen Träger enthält. Das Enzymadsorptionsverhältnis jedes Trägers wird berechnet unter der Annahme eines 100%igen Enzymadsorptionsverhältnisses von Kieselgur. Die erzielten Ergebnisse sind die folgenden:

Träger

Relatives Adsorptionsverhältnis

Kieselgur 100

Aktivkohle 100

Carboxymethylcellulose 100

Schwach saurer Chromato- 81,2 graphie-Ionenaus tauscher

Das erfindungsgemäße Verfahren sei nunmehr durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher veranschaulicht:

Beispiel 1

4 g des rohen Enzyms, welches in o) erhalten wurde, löst man in 500 cm' Wasser auf, und die sich ergebende Lösung stellt man unter Verwendung einer wäßrigen 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert voi 7,5 ein. Zu dieser Lösung setzt man 2 g Natrium 3-methyl-7-phciioxyacetamido-zJ³-cephem-4-carboxy lat, und das sich ergebende Gemisch läßt man 15 Stun den bei 37⁰C reagieren. Danach befreit man dii Reaktionsflüssigkeit von Proteinen unter Verwendunj eines Filters, man stellt mit 1 η-Salzsäure auf einei pH-Wert von 2,5 ein, wäscht dreimal mit der Hälft« ihrer Menge an Butylacetat und stellt dann mittel:

ίο wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH Wert von 6,5 ein. Diese Flüssigkeit adsorbiert man at einer 2 · 15-cm-Kolonne mit einem stark basischer Polystyrol-Anionenaustauscher, vernetzt mit 8% Di vinylbenzol (Essigsäuretyp), und man eluiert mi

1 η-Essigsäure. Danach mißt man die Adsorptions fähigkeit jeder Fraktion bei 260 πιμ, oder man führ einen biologischen Test nach dem Aufsprühen vor Phenoxyacetylchlorid auf Filterpapier durch, unc Fraktionen, welche 7-Amino-3-methyl-zl³-cephem·

ao 4-carbonsäure enthalten, sammelt man und unterwirf! sie dem Gefriertrocknen. Das getrocknete Produki löst man in einer geringstmöglichen Menge destillierter Wassers auf, und die sich ergebende Lösung stelli man durch Hinzusetzen von 1 η-Salzsäure auf einer

»δ pH-Wert von 3,7 ein. Dann läßt man über Nacht untei Eiskuhlung stehen, wobei sich farblose Kristalle abscheiden. Die Kristalle wäscht man mit einer geringstmöglichen Menge Eiswasser, wäscht dann mit Aceton und trocknet. Man erhält 792 mg 7-Amino-3-methyl-

Δ -cephem^-carbonsäure mit einem Schmelzpunkt ("^nte/ Zersetzung) von 240 bis 242 = C. Ausbeute

Beispiel 2

Zu einer Lösung von 10 mg des in b) erhaltenen rohen Enzyms in 5 cm³ einer 1 m-Phosphatpufferlösung (pH 7,5) setzt man 5 mg Natrium-3-methyl-7-pnenylacetdmido-J³-cephem-4-carboxylat hinzu, und das sich ergebende Gemisch läßt man bei 37⁰C

5 Munden reagieren. Dann mißt man gemäß der obigen öestimmungsrnethode (1) das Zersetzungsverhältnis von 3- Methyl-7-phenylacetamido-zl ³-cephem-4-carbonsaure und die Ausbeute an 7-ADCA, wobei man Werte von 95 % bzw. 91 % erhält.

Beispiel 3

Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, dall man Natrium-3-methyl-7-phenylacetamido-Zl³-cepnem-4-carboxylat anstelle des Natrium-3-methyl-/-pnenoxyacetamido - Δ ³ - cephem - 4 - carboxylate verwendet Man erhält 849 mg 7-Amino-3-methyl-T^/?^h."ⁿ-⁴-^carDonsäure vom Schmelzpunkt 239 bis ^41 c (Zersetzung). Die Ausbeute beträgt 73,5%.

Beispiel 4

Die in d) erhaltene Kieselgur mit adsorbiertem

_fi A?^Cl ™^en<!^{em Εη2}>™ (Enzymtiter 1800 U/g) wird ^Waschen mit einer 0,01 m-Phosphatpufferlösung ΦΗ /,:>) gepuffert, m eine mit Mantelrohr versehene Kolonne (5 · 50 cm) gepackt und dann etwa 1 Stunde oei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit (Raumgeschwindigkeit = 0,5SId.-¹) mit der gleichen

^«lösung wie oben gewaschen.

iJie Außentemperatur der Kolonne wird konstant gehalten, indem man 37°C warmes Wasser zum Mantelrohr strömen läßt. Danach läßt man 6 Liter

11 12

(5 mg/cm³, ausgedrückt als freie Säure) einer wäßrigen _{Art des} Trägers Erhaltene Ausbeute

Lösung von Natrium^-phenylacetamido-desacetoxy- Menge

cephalosporant durch die Kolonne mit einer kon- (g) (%)

stanten Strömungsgeschwindigkeit (Raumgeschwin- αι,^ι,-ι,ι,, -π« cot

digkeit = 0,5 Std.-i _[2,6 ml/h]) strömen, und die 5 Aktivkohle 37,5 58,2

ausfließende Flüssigkeit fraktioniert man in Einzel- Carboxymethylcellulose 32,9 51,8

fraktionen (Fraktionsmenge 10,8 cm³). Es wird eine Schwach saurer Austauscher 31,3 48,5
Zeit von etwa 16 Stunden zum Vollenden des Aus-

fließens benötigt. Beispiele

6,4 Liter der gesamten ausgeflossenen Flüssigkeit io Zur Erzielung einer Kultur bewirkt man die gleiche stellt man auf einen pH-Wert von 6 ein, und dann Kultivierung wie in a). Einen Liter dieser Kultur überkonzentriert man auf etwa ^ι/ιο· Das Konzentrat stellt trägt man in einen 250-1-Kulturtank, welcher 200 Liter man unter Verwendung von 6 η-Salzsäure auf einen eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie pH-Wert von 3,7 ein, wodurch das Ausfallen der ge- in a) enthält, und man kultiviert 48 Stunden bei 3O⁰C. bildeten 7-ADCA eingeleitet wird. Dieses Konzentrat 15 Es werden zwei dieser 250-1-Tanks gefahren, um kühlt man zur Vollendung der Ausfällung mit Eis. Die 350 Liter eines Kulturfiltrats zu erhalten. Zu dem Ausfällung gewinnt man durch Abfiltrieren, man Kulturfiltrat setzt man 3,5 kg Kieselgur hinzu, und wäscht mit einer kleinen Menge Eiswasser, trocknet das sich ergebende Gemisch rührt man 30 Minuten, genügend mit Aceton und trocknet dann zur Erzie- wobei man den pH-Wert bei 7 hält Anschließend lung von 14,0 g an weißer 7-ADCA vom Schmelz- 20 entwässert man das Gemisch auf einer Zentrifuge, punkt 240 bis 242°C. Ausbeute: 72,4%. Dieses Pro- und den Rückstand wäscht man mit Wasser. Man dukt löst man in wäßriger 2,5 n-Natriumhydroxyd- erzielt 5,2 kg an nasser Kieselgur (Enzymtiter 5000 U/g), lösung auf. Die entstehende Lösung entfärbt man mit Diese Kieselgur packt man in eine Vinylchloridkolonne Aktivkohle, stellt unter Verwendung von 6 η-Salzsäure der Ausmaße 120 · 900 mm, und man läßt durch die den pH-Wert auf 3,7 ein und kühlt dann mit Eis ab, »5 Kolonne eine Lösung von 5 mg/cm³ 7-Phenylacetwobei sich 7-ADCA niederschlägt. Anschließend amido-desacetoxy-cephalosporansäure in einem 0,05 gewinnt man die 7-ADCA durch Abfiltrieren, Waschen m-Phosphatpuffer (pH 7,5) fließen, während man die mit einer kleinen Menge Eiswasser, Waschen mit Temperatur bei 37°C hält (Gesamtmenge 1,8 kg/ Aceton und Trocknen, wodurch 11,4 g eines gereinigten 360 Liter, Strömungsgeschwindigkeit 5 Liter je Stunde). Produktes erhalten werden. 3° Die Eluierung ist in 72 Stunden vollendet, und man

erhält insgesamt 375 Liter eines Eluats. Zu diesem

Beispiel 5 tluat setzt man 290 Liter Aceton hinzu, und das sich

Das Beispiel 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, ergebende Gemisch stellt man unter Verwendung von

daß man anstelle der Kieselgur mit adsorbiertem 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 ein. Man

deacylierendem Enzym jeden der in d) erhaltenen 35 rührt hinreichend für 30 Minuten und läßt dann zum

Träger d h Aktivkohle mit adsorbiertem Enzym, Absetzen eines Niederschlages über Nacht stehen

Carboxymethylcellulose mit adsorbiertem Enzym und Der Niederschlag wird durch Abfiltrieren gewonnen,

schwach sauren Chromatographie-Ionenaustauscher mit Aceton gewaschen und dann getrocknet. Mar

mit adsorbiertem Enzym verwendet. Die erzielten erhält 1130,2 g Kristalle von 7-ADCA (Reinheil

Ergebnisse sind die folgenden: 4° 90,0 %ig), Ausbeute 89,2 %.

Claims (1)

Patentanspk üche:

1. Verfahren zur Herstellung von 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure der Formel

COOH

dadurchgekennzeichnet, daß man ein Alkalisalz einer 7-Acylamino-desacetoxy-cephaIosporansäure der allgemeinen Formel