SU469266A3 - Способ плучени 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты - Google Patents

Description

Коса  среда на агаровом бульоне (30°С, 24 час). Хороший рост культуры, гладка  поверхность , малораспространенна , блест ща , влажна . Колонип бело-молочные, просвечивающиес ; цвет среды не мен етс .

Бульон (30°С, 2 суток). Хороший рост культуры , равномерна  мутность с осадком, кожицы нет.

Палочки из желатинового бульона (30°С, 20 суток). Поверхностна  культура к центру по лини м палочек. Нет разжижени  желатина .

Лакмусовое молоко (30°С, 20 суток). Пе пептонизировано; лакмусовый пигмент восстановлен; культуральна  жидкость становитс  желто-коричневой.

Соева  агарова  коса  культура (30°С, 24 час). Культура белого до желтовато-белого цвета, поверхность гладка  и м гка . Хорошее образование спор.

Глюкозо-нитратна  агарова  коса  культура (30°С, 3 суток). Скудна .

Коса  культура на тирозиновом агаре (30°С, 3 суток). Хороша , среда коричнева .

Картофель (30°С, 5 суток). Хороша  культура , колонии розовые до коричневых, поверхность ровна  и влажна , изогнута  и блест ща ; среда становитс  коричневой приблизительно на 3-й день.

П1.Физиологические свойства.

Оптимальные услови  роста: аэробные при рН 7,0-8,0 и . Услови  размножени : аэробные, рН 5-10, при 7-45°С. Кислотостойкость низка , при рН ниже 5,0 роста нет.

Отношение к кислороду: аэробна , нет роста в глюкозном бульоне при анаэробных услови х . Индол не продуцируетс . Образуетс  сероводород. Реакци  денитрификации: газы не образуютс . Нитраты восстанавливаютс . Образование каталазы - положительное, уреазы - положительное. Крахмал гидролизуетс . Цитраты утилизируютс  (в среде Козера .и Христинсона). Лакмусовый пигмент восстанавливаетс . Метиленовый синий восстанавливаетс . В картофельной среде образуетс  водорастворимый пигмент.

IV. Ферментируемость углеводов (см. табл. 1).

Предлагаемую 7-амино - дезацетоксицефалоспорановую кислоту (7-АДСА) можно изменить путем сорбции деацилирующего энзима Се (I)

на носителе, не инактивируюшем этот энзим.

Дл  этого добавл ют водный pacTiBOp Се(1)

к этому носителю дл  деацилировани  Се(1)

и из реакционной жидкости выдел ют

Таблица 1

Арабиноза

Ксилоза

Глюкоза

-f + +

Манноза

Фруктоза

Галактоза

Рибоза

+ Рамноза Мальтоза Сахароза Лактоза Трегалоза

+ + +

Рафиноза Целлобиоза Сорбитол Маннитол Инозитол Глицерин

Глюцитол Салицин Инсулин Крахмал

+

7-АДСА. Штаммом, продуцирующим энзим, который способен деацилировать Се(1),  вл етс  Bacillus megaterium Е-400 FERM-P № 743.

Энзим, способный разлагать амидную св зь

Се(1), согласно изобретению получают аэробным выращиванием Bacillus megaterium В-400 PERM № 748 при 25-37°С в течение 12-60 час в среде, обычно примен емой дл  выращивани  бактерий, т. е. в питательной

среде, содержащей соответствующие количества источников азота (например: пептон, м сной экстракт, кукурузна  барда, экстракты дрожжей, сухие дрожжи, соевые продукты разложени  протеина или соевые выщелоченные продукты), источников углерода (например: меласса, глюкоза или глицерин); неорганические соли и, в некоторых случа х, другие ускор ющие рост вещества. Обычно используют аэ1рац1ИОН Ное перемешивание жидкой «ультуры .

Вышеуказанный энзим, представл ющий собой обычно оксо-энзим, в энзимной реакции примен етс  в виде фильтрата культуры или в виде энзимного препарата, полученного из

фильтрата культуры. Этот препарат получают путем очистки энзима известным методом, например, концентрированием фильтрата культуры или осаждением энзима полунасыщением или насыщением растворимой солью,

например сульфатом аммони  или хлористьгм натрием, или осаждением с помощью добавлени  гидрофильного органического растворител , например метанола, этанола или ацетона . Осадок раствор ют в воде и полученный раствор подвергают диализу через полупроницаемую мембрану, при этом можно удал ть низкомолекул рные примеси. Исход  из разницы в сорбции на сорбенте или в средстве с фильтрующим гелем, можно также

удал ть Низкомолекул рные примеси, окрашенные вещества, протеины и т. п. из культуральной жидкости при использовании обычных способов, например, сорбционной или ионообменной хроматографии, или фильтрующим гелем.

Энзимный раствор можно подвергнуть выпариванию при пониженном давлении, вымораживанию и т. п. обработке с получением стандартного энзимного продукта в виде твердого вещества, или его можно использовать -ка.к таковой дл  обработки Се(1).

ECvin требуетс  дальнейша  очистка энзимного препарата, то можно применить обычные способы очистки протеинов и энзимов, в которых примен ютс  сорбенты, фильтрующие гели и т. п.

Энзимную реакцию веДут следующим образом: Се(1) раствор ют в воде или буферном растворе, а затем обрабатывают вышеуказанным энзимным препаратом. Се(1) перевод т в форму водорастворимой натриевой или калиевой соли и примен ют IB концентрации от 0,1 до 20 мг/мл, лучше от 2 до 5 мг/мл, рН реакционной жидкости поддерживают в интервале 7-8 при температуре 30-45°С, предпочтительно от 35 до 40°С, в течение 5- 30 час. Реакцию можно остановить на любой стадии, устанавлива  врем , при котором выход 7-АДСА становитс  максимальным.

Тип носител  мен ют в зависимости от типа используемого продуцирующего энзим штамма дл  деацилировани  Се(1). Однако при выборе носител  учитывают его способность сорбировать деацилирующий энзим без его инактивации. Например, если примен ют такие неорганические носители, как целит, белую землю, активную глину, каолин, активированный уголь ИЛИ силикагель, такие ионообменные смолы как СМ-целлюлоза, СМцефадекс С-25, -или Асберлит С-50, Давекс-бО, то деацилирующий энзим дл  Се{1), продуцирующийс  Bacillus megaterium В-400, хорошо сорбируетс  без инактивации. Но если примен ют в качестве носител  двуокись алюмини , порошок целлюлозы, ДЕАЕ-целлюлозу , ДЕАЕ-цефадекс-25 или анионообменную смолу, то деацилирующий энзим плохо сорбируетс , а в случае сорбции сильно инактивируетс .

При сорбции деацилирующего Се(1) анзима на носителе рН фильтрата культуры штамма, продуцирующего деацилирующий Се(1) энзим, довод т до посто нного рН дл  деацилирующего энзима. Например, при сорбции деацилирующего энзима, продуцируемого Bacillus megaterium на целите, рН фильтрата культуры составл ет, как правило, 6-8. Сорбцию деацилирующего энзима на носителе провод т периодическим способом или по способу с колонкой.

Количество носител  зависит от количества и титра энзима фильтрата культуры продуцирующего деацилирующий энзим штамма и степени сорбции деацилирующего энзима носителем. При сорбции энзима периодическим способом количество используемого носител  должно составл ть от 5 до 15 вес. % от количества фильтрата культуры . При периодической работе смесь фильтрата культуры и носител  перемещивают, затем .носитель отдел ют и промывают содой , а в случае сорбции с помощью колонки носитель, набитый в колонку, смачивают водой или буферным раствором, в котором рН

доведен до стабильного значени ; фильтрат культуры пропускают через колонку, затем колонку промывают водой, и получают носитель , который сорбирует деаиилпруюп1ий энзим .

Се(1) получают известными методами. В предлагаемом способе Се(1) используют в виде водорастворимой соли щелочного металла , например натриевой или калиевой. Далее водный раствор Се(1) обрабатывают деацилирующпм энзимом, сорбированным на носителе. Предварительно добавл ют к раствору буферный раствор с таким же рН, как и соответствующий рН деацилирующего энзима. Эту энзимную реакцию ведут непрерывно на колонке.

Концентраци  Се(1) зависит от титра эпзима , т. е. от способности его деацилировать Се(1), и от расхода; однако желательно, чтобы количество непрооеагировавшей Се(1)

в выход щей реакционной жидкости -не увеличивалось . Обычно концентраци  Се(1) составл ет 0,1-2,0% по весу, лучше от 0,5 до 1,0% по весу. Концентраци  зависит также от типа носител .

Выщеуказанную реакцию провод т при соответствующих рН и температуре, лучще при оптимальных рН и температуре дл  деацилирующего Се(1) энзима. Однако подбирают такие услови  реакции, чтобы образующа с 

в реакционной жидкости 7-АДС.4. выходила в возможно больщей концентрации. Длительность реакции регулируют путем увеличени  или уменьшени  добавл емого количества водного раствора Се(1). Обычно реакци  за канчиваетс  до того, как водный раствор Се(1) проходит через слой носител  в колонке. Однако в том случае, когда степень деацилировани  Се(1) низка и в реакционной жидкости остаетс  большое количество Се(1), реакционную жидкость снова добавл ют в этот слой носител  или в другой, сорбировавший деацилирующий энзим, при этом получают реакционную жидкость с большой степенью деацилировани  Се(1).

При проведении энзимной реакции водный раствор Се(1) добавл ют непрерывно в слой носител , на котором сорбирован деацилирующий энзим. Однако степень деацнлировани  Се(1) постепенно уменьшаетс  за счет миграции различных бактерий и т. п. Вредное воздействие из-за загр знени  сводитс  к минимуму , если в верх колонки добавл ть толуол . Согласно изобретению один слой носител 

можно использовать более 10 дней, при этом

7-АДСА выдел етс  с большими выходами при малых затратах.

Выделение 7-АДСА из полученной таким образом реакционной жидкости осуществл ют известными способами. Например, рН реакционной жидкости довод т до 2 и промыва от ее гидрофобным органическим растворителем, например этилацетатом, бутилацетатом или метилиизобутилкетоном, дл  удалени  непрореагировавшей Се(1), затем водный слой концентрируют и довод т его рН до 3,7 при охлаждении дл  осаждени  7-АДСА изоэлектрически . Можно также довести рН реакционной жидкости до 3,7, концентрировать ее и охладить , выпавший осадок промыть ацетоном дл  удалепи  непрореагировавшей Се(1) и побочно полученной карбоновой кислоты. Таким образом можно выделить 7-АДСА.

Метод измерени  активности сорбированного энзима.

Носитель с сорбированным деацилируюш,им энзимом взвешивают в L-образной пробирке. В пробирку добавл ют 4,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,5), и пробирку встр хивают 10 мин (на тр сучке Монод термостатного типа) при 37°С. Затем добавл ют 0,5 мл (10 мг/мл в единицах свободной кислоты) водного раствора натриевой соли 7-фенилацетамиддезацетоксицефалоспорановой кислоты, и полЗчениой смеси дают реагировать в течение 30 мин. По окончании реакции реакционную жидкость сразу же охлаждают и в реакционной маточной жидкости, освобожденной от носител , определ ют 7АДСА по методу TNBS. Энзимный титр, образуюший 100 Y/мл 7-АДСА, принимают за 100 единиц (и).

Методы определени  7-АДСА.

I. Реакционную жидкость подвергают испытанию на микроорганизмы (37°С, 16 час) по методу бумажных дисков или чашечному методу с использованием Bacillus subtilis PCI-219 в качестве испытуемого штамма, измер ют диаметр кружка ингибирующего рост этого штамма. По стандартной кривой дл  Се(1) рассчитывают количество Се(1); разницу между исходным количеством Се(1) и оставшейс  Се(1) выражают в процентах к исходной Се(1). Этот процент представл ет собой степень разложени  исходной Се(1).

П. В определенном количестве реакционной жидкости довод т рН до 2,5 с помош;ью 1 н. сол ной кислоты, промывают 3 раза половинным количеством бутилацетата, затем рН довод т до 7,5 с помощью 1 н. водного раствора едкого натра. Затем определенное количество обработанной таким образом реакционной жидкости обрабатывают хлорангидридом кислоты , соответствующей кислоте в боковой цепи исходной Се(1), а затем подвергают такому же испытанию микроорганизмами, как и в определении по методу I. Из количества полученной Се(1) рассчитывают количество 7-АДСА и выражают его в процентах; этот процент представл ет собой выход 7-АДСА.

III. Метод TNBS. К 1 мл пробы добавл ют 2 мл 0,3 М раствора фосфатного буфера (рН 8,0) и 2 мл 0,1%-ного раствора TNBS; полученной смеси дают реагировать в темноте при

5 50°С в течение 90 мин. После охлаждени  в реакционную жидкость добавл ют 1 мл 6 н. сол ной кислоты и определ ют поглощение при 395 ммк; количество 7-АДСА рассчитывают по стандартной кривой дл  7-АДСА.

0 Пример 1. Получение энзимных пренаратов .

20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей (%): полипептон 1, дрожжевой экстракт 1 и хлористый натрий 0,5, - загружают в чашечный ферментатор на 30 л и стерилизуют 20 мин паром при 120°С. Затем в стерильных услови х перенос т в эту культуральную среду 200 мл затравочной культуры Bacillus megaterium В-400 FERM-P № 45, которую выращивают 24 час при 30°С в культуральной среде вышеуказанного состава и ферментируют при 30°С в течение 48 час с аэрацией и перемешиванием при расходе воздуха 20 л/мин и 300 об/мин мешалки. По оконча5 НИИ ферментации клетки удал ют с помощью центрифуги-сепаратора Вестфали  и получают 17,4 л фильтрата культуры.

Пример 2. Фильтрат культуры из примера I выпаривают до 1/3 объема при наружной

0 температур е 30-35°С, и в концентрат добавл ют сульфат аммони  до достижени  80% насыщени . Выпавший осадок раствор ют в дистиллированной воде и обессоливают с помощью колонки с Цефадексом С-25; обессоленный раствор замораживают и получают 24,3 г стандартного энзимного продукта. .

Пример 3. 20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей (%): глюкозы 0,5, глицерина 0,3, м сного экстракта 1,0 и

0 полипептона 1,0, - загружают в чашечный ферментатор на 80 л и стерилизуют 20 мин паром при 120°С. Затем в стерильных услови х в ферментатор внос т 200 мл затравочной жидкости Bacillus megaterium В-400 FERM-P

5 № 748, которую выращивают при 30°С в течение 20 час в культуральной среде вышеуказаиного состава « фер1ментируют при 30°С в течение 72 час при аэрации и перемешивании, при расходе 20 л/мин воздуха и 300 об/мин

0 мешалки. По окончании ферментации клетки удал ют с помошью центрифуги Вестфали , фильтрат выпаривают до 1/3 объема при наружной температуре 30-35°С. К концентрату добавл ют ацетон до его содержани  60%,

5 выпавший осадок выдел ют фильтрованием и сушат, получают 25,5 г стандартного энзи.много продукта.

Пример 4. 4 г сырого энзима, полученного по примеру 2, раствор ют в 500 мл воды,

0 рН полученного раствора довод т до 7,5 с помощью водного 1 ц. раствора едкого натра. К этому раствору добавл ют 2 г натри  3-метил7-фенокоиацетамид-А -цефам-4 - карбоксилата и полученную смесь выдерживают при 37°С в

5 течение 15 час. Затем реакционную смесь освобождают от протеинов с помощью Диафильтра G-IQH, рН довод т до 2,5 с помощью 1 п. сол пой кислоты, 3 раза промывают половипным количеством бутилацетата и затем довод т рН до 6,5 с помощью 1 и. раствора едкого натра. Эту жидкость сорбируют в колонке 2X15 см с набивкой из Довекс-18 (кислотного типа) и элюируют 1 н. уксусной кислотой . Затем измер ют поглощаемость каждой фракции дрИ 260 ммк биологической пробой после распылени  на нее феноксиацетилхлорида на фильтровальной бумаге; фра-кции, содержащие 7-амино3-метил-Д -цефам - 4 - карбоновую кислоту, собирают и .подвергают вымораживанию. Высущенпый таким образом продукт раствор ют в дистиллированной воде, количество которой берут как можно меньще, полученный раствор довод т до рН 3,7 с помопдью I н. сол ной кислоты, затем выстаивают в течение ночи при охлаждении льдом дл  осаждени  бесцветных кристаллов. Кристаллы промывают лед ной водой, которую берут в возможно меньших количествах, промывают ацетоном, сушат и получают 792 мг 7-амино-З-метил-Д -цефам-4-карбоповой кислоты с т. пл. 240-242°С (разл.), выход 69,6%.

Вычислено, %: С 44,85; Н 4,70; N 13,08.

CsHioNaOaS

Найдено, %: С 45,02; Н 4,58; N 12,95.

Пример 5. К раствору 10 мг сырого энзима , полученного по примеру 2, в 5 мл 1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,5) добавл ют 5 мг натрий З-метил-7-фенилацетамид-ДЗ-цефам-4-карбоксилата , реакци  протекает при 37°С в течение 5 час. Затем определ ют степень разложени  3-метил-7-фе1 илацетамид-Д -цефам-4-карбоновой кислоты и выход 7-АДСА по вышеуказанному методу определени  I. Получают, соответственно, величины 95% и 91%.

Пример 6. Пример 4 повтор ют, но вместо натрий З-метил-7-феноксиацетамид-Д -цефам-4-карбоксилата берут натрий З-метил-7фенилацетамид - Д - цефам - 4 - карбоксилат и получают 349 мг 7-амипо-3-метил-Д -цефам-4карбоновой кислоты с т. пл. 239-241°С (разл.), выход 73,5%.

Пример 7. рН 10 л фильтрата культуры Bacillus megaterium В-400 FERM-P № 748, получепного по примеру 2, довод т до 7 с помощью уксусной кислоты. К фильтрату культуры добавл ют 500 г диатомной земли и полученную смесь перемешивают 30 мин. В течение этого времени рП поддерживают равным 7. Затем реакционную жидкость центрифугируют на центрифуге корзинчатого типа, затем промывают водой и получают 750 г влажпого целита (энзимный титр 1200 ед/г).

Пример 8. рН фильтрата культуры Bacillus megaterium В-400 FERM-P № 748, полученной по примеру 2, довод т до 7. К каждому литру фильтрата отдельно добавл ют по

50 г целита (Гифло Супер Цел), активированного угл , СМ-целлюлозу и Амберлий CG-50. Полученные смеси перемешивают в течение 30 мин. В это врем  рН поддерживают

около 7. Затем носитель выдел ют фильтрованием, промывают водой и получают влажный носитель. Рассчитывают степень энзимной сорбции дл  каждого носител , принима  за 100%-ную сорбцию энзима степень

сорбции целитом. Результаты представлепы в табл. 2.

Таблица 2

Относительна  степень

Носитель сорбции, %

15

100,0

Целит 100,0

Активированный }голь СМ-целлюлоза 100,0

81,2 Амберлит CG-50

П р и м е р 9. Целит с сорбировапным деацилирующим энзимом (энзимный титр

1800 ед/г), полученный по примеру 8, промывают буферным раствором 0,01 М фосфата (рП 7,5), набивают в колонку, снабженную рубашкой (5X50 см) и промывают в течение 1 час при определенном расходе (объемна 

скорость 0,5) этим же буферным раствором.

Паружную температуру колонк поддерживают определенной путем пропускани  :В рубашку колонки теплой воды при 37°С. Затем через колонку пропускают 6л (5 мг/мл свободной кислоты) водного раствора натрий 7-фепилацетамиддезацетоксицефалоспорапата при определенной скорости (объемна  скорость 0.5), вытекающую л идкость фракционируют на отдельные фракции (количество каждой

фракции 10,8 мл). Дл  заверщенн  реакции требуетс  16 час. Довод т рН до 6 и выпаривают до 1/10 объема. Конце .:трат довод т до рН 3,7 с помои1,ью 6 н. сол ной кислоты, при этом образовавша с  7-АДСА начинает выпадать в осадок. Дл  завершени  осаждени  концентрат охлаждают льдом, осадок отфильтровывают , промывают небольшпм количеством лед пой воды, ацетопом и после сушки получают 14.0 г белой 7-АДСА с т. пл. 240-

, выход 72,4%. Этот продукт раствор ют в водном растворе едкого натра (0.5 н.), раствор обесцвечивают активированным углем , довод т рП до 3,7 с помощью 6 н. сол ной кислоты и охлаждают льдом дл  осал дени  7-АДСА. Затем 7-АДСА отфильтровывают , промывают небольшим количеством лед пой воды, ацетопом и сушат, при этом получают 11,4 г очищенного продукта. Пример 10. Пример 9 повтор ют, но

вместо Целита с сорбированным деацилирующим энзимом дл  получени  7-АДСА берут активированный уголь с сорбированным энзимом , СМ-целлюлозу с сорбированным энзимом и Амберлит CG-50 с сорбированным энзимом . Результаты представлены в табл. 3

11 Пример 11. Дл  получени  культуры провод т такое же выращивание, как в примере 1. 1 л этой культуры перенос т в резервуар дл  выращивани  культуры на 250 т, в котором находитс  200 л среды, такого же состава как в примере 1, и ведут выращивание при 30°С в течение 48 час. Дл  получени  350 л культуры (фильтрата) работают 2 резервуара на 250 л. К фильтрату культуры добавл ют 3,5 кг целита и смесь перемешивают 30 мин, поддержива  рН среды 7. Затем смесь дегидратируют на центрифуге, остаток промывают водой и получают 5,2 кг влажного целита (энзимный титр 5000 ед/г). Этот целит помещают в поливинилхлоридную колонку размером 120X900 мм и через нее пропускают раствор (5 мг/мл) 7-фенилацетамидо-д,езацетоксицефалоспораповой кислоты в фосфатном буферном растворе 0,05 М (рН 7,5), поддержива  температуру 37°С (общее количество 1,8 кг), 360 л расход 5 л/час. Элюирование заканчивают в течение 72 час и получают всего 375 л элюата. К этому элюату добавл ют 290 л ацетона, рН полученной смеси довод т до 4,0 с помощью 6 и. сол ной кислоты, перемешивают в течение 30 мин и выстаивают в

12

течение ночи дл  выпадени  осадка. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и сущат . Получают 1130,2 г кристаллов 7-АДСА (чистота 90,0%) выход 89,2%. Предмет изобретени  Способ получени  7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДСА) общей формулы . . / тем, что, на соль оощеи отличающийс  формулы R-dO-NH где R - бензильна  ли феноксиметильпа  группа, М - щелочной металл, воздействуют культуральной жидкостью, полученной при выращивании щтамма Bacillus megaterium В-400 PERM JMb 748,  вл ющегос  продуцентом энзима ацеламид амидогидролазы.