JPS62126990A - セドヘプツロ−スの製造法 - Google Patents

セドヘプツロ−スの製造法

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JPS62126990A
JPS62126990A JP60266583A JP26658385A JPS62126990A JP S62126990 A JPS62126990 A JP S62126990A JP 60266583 A JP60266583 A JP 60266583A JP 26658385 A JP26658385 A JP 26658385A JP S62126990 A JPS62126990 A JP S62126990A
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JP
Japan
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sedoheptulose
ribose
phosphate
bacillus subtilis
transketolase
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JP60266583A
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Akira Yokota
明 横田
Kenichi Sasajima
笹島 賢一
Hiroshi Imai
紘 今井
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HAKKO KENKYUSHO
Original Assignee
HAKKO KENKYUSHO
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、酵素活性阻害剤、フェロモン、抗生物質に含
まれる糖類などの光学的(こ活性な生理活性物質を化学
的に合成するための原料化合物として有用なセドヘプツ
ロースの製造法に関する。
(従来の技術) セドヘプツロースは天然物中から抽出単離する方法(ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(Jo
urnal of Biological Chemi
stry )第30巻、第61〜77頁(1917) 
 )、炭素化合物を原料として化学的に合成する方法(
ジャーナル オブ アメリカン ケミカル ソサエティ
(Journal of American Chem
ical 5ociety )第74巻、第2197〜
2198頁、(1952) )、お・よび微生物を用い
る方法(ザ ジャーナル オブバイオケミストリー (
The Journal of Bioch−emis
try )第54巻、第107〜108頁(196(’
)、特公昭89−14500号公報、特公昭41−44
00号公報、特公昭41−5915号公報、特公昭41
−21760号公報、特公昭39−14500号公報、
特公昭41−5915号公報)が知られている。
しかしバチルス属に属する細菌を用いた微生物法による
セドヘプツロースの製造法は知られていない。
(発明が解決しようとしている問題点)従来の天然物中
からの抽出法、化学合成法および微生物による方法は、
いずれも収率が低く、また原料化合物が高価であるなど
の点から、セドヘプツロースを製造する方法としていず
れも満足できるものではない。微生物を用いて該目的物
をより収率よく製造できれば、工業的に安価に大量生産
することができることとなる。
c問題点を解決するための手段) 本発明者らは、安価な炭素源、窒素源を主原料として著
量のセドヘプツロースを生成蓄積する菌株を多くの微生
物菌株について検索した結果、これをバチルス属に属す
る菌株およびその変異株に見いだし、この知見に基づい
て鋭意研究を続けた結果、ついに本発明を完成した。
すなわち本発明は、 (1)  バチルス属に属し、セドヘプツロース生成能
を有する菌株を、基質としてD−リボースを含有する培
地に培養してセドヘプツロースを生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするセドヘプツロースの製造法
、および(2)トランスケトラーゼを欠損し、セドヘプ
ツロース生成能を有するバチルス・ズブチリスである。
本発明に用いられる微生物は、バチルス属に属し、セド
ヘプツロース生産能を有するものであればいずれでもよ
く、天然から分離したものでも、その野性株から導かれ
た変異株であってもよい。
変異株を得るためには、たとえば紫外線、X線、γ線な
どの放射線を照射したり、ニトロソグアニジン等の変異
剤を作用させるなどの手段が適宜に用いられる。本発明
において使用される菌株の具体例としては、たとえばバ
チルス・ズブチリス(Bacillus 5ubLil
is )に属するバチルス・ズブチリス、鈑1およびバ
チルス・ズブチリス基2などが挙げられる。バチルス・
ズブチリスf;、1およびバチルス・ズブチリス基2の
菌学的性質は、バージイズ・マニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジイ(Bergey’s 
Manual of Deter−minative 
Bacteriology )第8版(1974)第5
31〜534頁に記載されたバチルス・ズブチリスの菌
学的性質と同一である。
上記菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所(FRI
)に、バチルス・ズブチリスA’lおよび意2は昭和6
0年(1985) 11月8日にそれぞれ寄託番号微工
研菌寄第8512号(FERMP−8512)および第
8513号(FERMP−8518)として寄託されて
いる。また財団法人発酵研究所(I FO)にバチルス
・ズブチリス基1および石2は昭和60年(1985)
11月5日にそれぞれIFO14473およびIFO1
4474として寄託されている。
これらの菌株の遺伝的特徴としては、トランスケトラー
ゼを欠損しD−グルコン酸、p−キシロース、D−リボ
ースあるいはL−アラビノースを唯一の炭素源として生
育し得ないこと、それを生育せしめるのには芳香族アミ
ノ酸を培地に添加する必要があること、の二点があげら
れ、なお他の菌学的諸性質は上記文献に記載されたもの
と異なるところはない。
本発明でいうトランスケトラーゼ欠損とは、アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(A
gricultural and Biologica
lchemistry )第38巻、第1297−18
08頁(1974)に記載された方法に従って酵素活性
を測定した場合、その活性が0.01マイクロモル/分
imyi白以下であると定義することができる。
以下に上記酵素活性測定法を記載する。
(トランスケトラーゼ活性測定法) (1)菌体抽出液の調製法 トランスケトラーゼを測定すべき菌株の斜面培養の一白
金耳量をソルビトール0.5%、L−グルタミン酸ソー
ダ0.65%、KH2PO40,1%、K2F(PO4
0,8%、Na2SO40,1%、MgSO4−7H2
010,01%、ビオチン0.0004%、サイアミン
塩酸塩o、oooa%およびL−チロシン、L−トリプ
トファン、L−フェニルアラニン各100 m97me
からなる培地に接種し、37℃で24時間培養する。
ついで遠心分離によって菌体を集め、o、 o o t
 Mメルカプトエタノールを含む0.01M)リス−塩
酸緩衝液(pH7,5)で2回洗浄し、同緩衝液で65
0 nmの吸光度が10になるような菌体懸濁液を調製
する。これに卵白リゾチームを50μvmeの濃度で加
え、37℃で30〜90分加温する。
ついで遠心分離によって不溶部分を除き、上澄液を菌体
抽出液とする。
(2)トランスケトラーゼ活性測定用反応液反応液A(
1,117i’fl):D−リボース5−リン酸20 
μmol 、 NADHo、5/jmol 、十分量の
D−リボース5−リン酸・ケト−ルーイソメラーゼおよ
びエピメラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼを十分
量含有するα−グリセロリン酸脱水素酵素0.66単位
およびトリス−塩酸緩衝液(pH7,5)60μmo1
0 反応液B (0,89ml! ) : Mgc(J22
0 μmol 、サイアミンピロリン酸0.43μmo
l+  トリス−塩酸緩衝液(pH7,5)40μmo
l  および菌体抽出液10μ10 (3)トランスケトラーゼ活性測定操作反応液Aおよび
Bをそれぞれ30℃で10分間加温してから、両反応液
を混合し、光路1o++の石英セルに入れて、30℃に
設置したギルフォード・マルティプル・サンプル・アブ
ソーバンス・レコーダー240 (G11ford  
Instrument Laboraむ−ories 
 Inc、、 U、S、A、)  にかけて340 n
mの吸光度の変化を記録する。
(4)酵素活性の計算 酵素活性は次式に従って算出する。
式中−ΔE 340 / m l nは340nmの吸
光度の1分間当りの減少速度、■は反応液の液量(2m
l>、ΣはNAOHのa 40 nmの分子吸光係数(
6,22cttt”/ フィクロモル)、dは光路の長
さくICIR)、Eは酵素液量(10μl)、pは酵素
液中の蛋白量(mVml )を示す。
本発明において用いられる菌株バチルス・ズブチリスx
lおよびバチルス・ズブチリスf;、2のトランスケト
ラーゼ活性を測定した結果、0.01マイクロモル/分
/1ng蛋白以下であった。なお、凪1および隘2の親
株であるバチルス・ズブチリスIFO12114株のト
ランスケトラーゼ活性については0.23マイクロモル
/分/my蛋白であった。
これらの株を培養する場合、用いられる培地は該菌株が
利用し得る炭素源、消化し得る窒素源、無機物質、微量
栄養素などが適宜配合される。
本発明においてD−リボース−5−リン酸を生成しうる
物質を含有する培地が使用される。
七ドヘプツロースは、D−グルコース6−リン酸から6
−ホスホ−D−グルコン酸、D−リブロース5−リン酸
、D−トボース5−リン酸、セドヘプツロース7−リン
酸を経て生成される。本発明における基質のD−IJボ
ース5−リン酸を生成しうる物質としては、D−’Jボ
ースのほか、例えばD−グルコース、D−フラクトース
、D−マンノース、D−ガラクトース、ソルビトール、
  D −マンニトール、シュークロース、マルトース
ノヨうなヘキソース類、L−アラビノース、D−キシロ
ースのようなペントース類、糖蜜、澱粉、澱粉加水分解
物、酢酸、炭化水素C例、n−パラフィン)、アルコー
ル類(例、メタノール、エタノール)などが使用できる
さらに、D−リボースと上記ヘキソース類とを併用する
ことにより本発明の目的化合物をより効率よく生産する
ことができる。
本発明において添加されるD−リボースの添加量は、培
地に対して5%(w/v)程度がよく、ヘキソース類を
併用する場合の添加量はヘキソース類を後述する炭素源
として用いる場合は10%(w/v)程度までがよいが
、ヘキソース類等を基質および。
炭素源として添加する場合は10〜20%(′v/v)
程度がよい。
本発明で用いられる炭素源としては、前記のD−グルコ
ース、D−フラクトース、D−マンノース、D−ガラク
トース、ソルビトール、D−マンニトール、シュークロ
ース、マルトース、糖蜜。
澱粉、S粉加水分解物、酢酸、炭化水素C例、n−パラ
フィン)、アルコール類C例、メタノール。
エタノール)などが挙げられる。
また窒素源としては、コーン・ステイープ・リカー、綿
実粕、酵母エキス、乾燥酵母、フィツシュミール、肉エ
キス、ペプトン、カザミノ酸、その他の含窒素有機資源
、アンモニア水、アンモニアガス、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム。
硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素化合物のほか、尿素
、アミノ酸などの有機窒素化合物が使用される。また培
地にこれらの炭素源や窒素源のほか、用いる微生物の生
育に必要な種々の金属(例、MgSO4,Mnc#2 
、 Fec63)などの無機物質、ビタミン(例、ビオ
チン、チアミン)などの微量栄養素が適宜添加される。
これらセドヘプツロース生産菌が生育するためには、培
養液中にL−チロシン、L−トリプトファン、L−フェ
ニルアラニンを存在させることが必要である。そしてこ
れらの芳香族アミノ酸をいずれも培地に25μg/ml
以上存在させることにより目的物の収率を向上させるこ
とができる。上記アミノ酸は必ずしも精製物である必要
はなく、芳香族アミノ酸を含有するもの、たとえば乾燥
酵母、ポリペプトン、肉エキス、カザミノ酸、コーンス
テイープリカーなどに含有されていてもよい。
またこれらの混合物ももちろん使用できる。
培養は振数あるいは通気撹拌深部培養などの好気条件下
で実施される。培養温度は通常20℃〜45℃の範囲か
ら、用いる菌株の生育およびセドヘプツロースの蓄積に
好適な温度が選択される。
また培地の液性はpH5〜9程度が好適である。
培養中のpHをこの様な至適pH域に保つために、塩酸
、′&L酸、アンモニア水、アンモニアガス、水酸ナト
リウム水溶液1.炭酸カルシウム、消石灰などを適宜添
加してもよい。通常3〜5日程度の培養で培養物中にセ
ドヘプツロースが蓄積される。
このようにして生成されたセドヘプツロースを採取する
には、微生物が生産する代謝産物を採取するのに通常用
いられる手段を適宜に利用すればよい。セドヘプツロー
スは水に良く溶けるが、一般の有機溶媒には難溶もしく
は不溶の中性糖類であるから、中性糖類の精製によく用
いられる方法が採用できる。例えば、活性炭、陰イオン
交換樹脂、セルロースのカラムクロマトグラフィーなど
の方法が単独あるいは組み合わせて利用される。
培養物から菌体を分離して得られる培養濾液を脱塩用イ
オン交換樹脂カラム、例えば酸性および塩基性イオン交
換樹脂カラムを組み合わせてイオン性物質を除去し、そ
のまま濃縮するか、あるいはさらにホウ酸型にした陰イ
オン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィーを
適用し、溶出後ホウ酸塩を除去し、濃縮することにより
セドヘプツロースを溶液あるいはシロップ状として取得
することができる。またセドヘプツロースを酸処理する
ことにより、そのアンハイドロ体であるセドヘプツロー
スの結晶として取得することもできる。
酸処理の具体的方法としては、培養を終了後、培養物に
酸C例、硫酸、塩酸、酢酸、シュウ酸など)を加えて加
熱する方法、培養物に生成蓄積されたセドヘプツロース
を採取し、これを酸性溶液(例、前記の酸で酸性にした
もの)に加えて加熱する方法、培養物中に生成蓄積され
たセドヘプツロースの精製採取の際に酸性樹脂(例、前
記の酸で平衡化した樹脂、例えばアンバーライトIR−
120(H+)ローム・アンド・ハース社製、米国)を
通し加熱する方法、などが挙げられる。酸処理中におけ
るpHは1.0以下が好ましい。
なお、培養経過に伴うセドヘプツロースの生成過程は、
n−ブタノール−エタノール−水(5:3:2)の混合
溶媒を展開液とするペーパークロマトグラフィーにより
Rf値0.40の部位にオルシノール−塩酸試薬により
緑青色を呈し、アルカリ性硝酸銀試薬に陽性のスポット
の消長をもって追跡することができる。またイオン交換
樹脂カラムを用い、063Mホウ酸緩衝液(pH9,0
)を溶出液として高速液体クロマトグラフィーにより定
量することができる。
実施例 以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。なお、培地の%は重量/容量%を示す。
実施例1゜ バチルス・ズブチリス(I FO12114)に紫外線
を照射して得られたバチルス・ズブチリス変異株患1 
(IFO14473,FERMP−8512)を、ソル
ビトール2%、コーンステイーフリカー2%、リン酸−
カリウム0.1%、リン酸二カリウム0.3%、L−チ
ロシン25mg/6.t、 −トリプトファン25my
/1SL−フェニルアラニン25my/1からなる培地
500ml’(pH7,0)ニ接種し、37°Cで16
時間培養してこれを種培養とする。
これを、D−リボース5%、D−グルコース10%、乾
燥酵母2.0%、硫酸アンモニウム0.5%、硫酸第一
鉄o、 o o t%、硫酸マンガン0.001%、炭
酸カルシウム2.0%、アクトコール(消泡剤式日薬品
工業製)0.05%からなる培地10041’に接種し
た。これを37°Cで60時間、通気撹拌培養したとこ
ろ、セドヘプツロース259/lが蓄積していた。
上記のセドヘプツロース醗酵液を濾過して除菌体後、カ
チオンおよびアニオン交換樹脂からなる脱塩塔を通し、
通過液をさらに炭末塔を通した。
これを21まで減圧濃縮して得られた濃縮物にメチルア
ルコール61を加えて沈澱物を除き、減圧温情すること
によりセドヘプツロース約60%含有のシロップ1.3
 Kgを得た。
実施例2゜ 実施例1と同様にして得たバチルス・ズブチリス変異株
隘2 (IF014474.FERMP−8512)を
使用して同様に培養し、72時間培養を行った。
以下実施例1と同様に処理することによう、セドヘプツ
ロース約40%含有のシロップ2.2 K7を得た。
実施例3゜ 実施例1によシ得られたセドヘプツロースを少量の水に
溶解し、粉末セルロースを充てんしたカラムに導入した
。次いで、セルロースカラムを25%水飽和ブタノール
、50%水飽和ブタノール、75%水飽和ブタノールに
て溶出シ、75%水飽和ブタノール画分を減圧濃縮する
ことにより含ff195%のセドヘプツロースシロップ
1. I KF、 ヲ得た。これを15m1’の濃硫酸
を含む11の水に溶かし、100 ’Cで5時間加熱し
た後、イオン交換樹脂によシ硫酸を除去し、濃縮して残
査に少量のメタノールを加え、氷室内に保存するとセド
ヘプツロースの結晶が析出した。結晶を濾過し、メタノ
ール−水から再結晶化することにより、融点102°C
の無色針状結晶セドヘプツロース・1水和物を750y
得た。
実施例4゜ バチルス・ズブチリス変異株1に2 (I FO144
74、FERMP−8512)を可溶性でん粉2%、コ
ーンステイープリカー2%、リン酸−カリウム0.1%
、リン酸二カリウム0,3%からなる培地500me(
pH7,0)に接種し、37℃で24時間培養後、これ
を種培養としてD−リボース5%、可溶性でん粉lO%
、乾燥酵母1.5%、亜リン酸カルシウム0.5%、リ
ン酸三力lレジウ゛AO,5%、炭酸カルシウム1.0
%からなる培地30eに接種した。これを37℃で72
時間通気撹拌培養したところ、セドヘプツロース21’
;’/1−1t:蓄積していた。
この醗酵液を、ハイフロス−パーセル(ジョンズ・マン
ビル・プロダクト社製、米国)を用いて濾過し、菌体を
除去後、これをあらかじめ酸処理した炭末塔に通過させ
、通過液を集め、減圧濃縮して約4.54にしたこの濃
縮液を、カチオンおよびアニオン交換樹脂からなる脱塩
塔全通し、通過液をさらに11にまで濃縮した。この濃
縮液を実施例3と同様の方法で硫酸による加熱処理を行
い、イオン交換樹脂による硫酸の除去、濃縮後残渣にメ
タノールを加えて放置することにより、セドヘプツロー
スの結晶240yを得た。
実施例5゜ バチルス・ズブチリス変異株Na1(IFO14473
、FERMP−8513)を実施例1と同様の組成の種
培地500meに接種し、37°Cで20時間培養して
これを種培養とした。これをD−グルコース15%、乾
燥醗母2.0%、硫酸アンモニウム0.5%、硫酸第一
鉄0.001%、硫酸マンガンo、oot%、炭酸カル
シウム2.0%、アクトコール(消泡剤、飲用薬品工業
製) 0.05%からなる培地1006に接種した。こ
れを37’Ct’ 70 RtL’l、通カイ拌培i 
L、 ?: 、!: c 6、ヤ1、 特プツロース5
.2 Vlが蓄積していtこ。このセドヘ 1゜プツロ
ース醗酵液を実施例1と同様の方法により精製、濃縮し
てセドヘプツロース約50%含有の 2・シ0′・プロ
50yを得た・            3゜(発明の
効果) 本発明の、バチルス属に属し、セドヘプツロース生成能
を有する菌株をD−リボースを含有する培地に培養する
方法により、セドヘプツロースを5゜ 特許出願人  財団法人 発酵研究所 手続補正力(睦) 昭和60年12 月23日 許庁長官殿 事件の表示  昭和60年特許願第266583号発明
の名称  セドヘプツロースの18法補正をする者 事件との関係 特許出願人 代表者飯島貞二 やついEt]□0の日付 昭和 年 月  日(発送日
、昭和  年  月  日付)(1)特許請求の範囲 
 別紙のとおシ(2)  明細書第2頁、下から2 行
目の「特公昭39−14500号公報、特公昭41−5
915号公報」を削除する。
同第4頁、第1行のrD−!Jボース」の次に「5−リ
ン酸を生成しうる物質」を挿入する。
同第6頁、下から5行目末尾の「7H2o0」を「7H
20」に訂正し、同頁下がら2行目のr100mg/m
e」を[100ttVme J ニ訂正する。
同第7頁、下から4行目の「Mg c 12 JをrM
gcJl’2 Jに訂正する。
同第9頁、第10行の「D−リボース−5−リン酸」を
「D−リボース5−リン酸」に訂正し、同頁第14行の
「D−トボース5−リン酸」をrD−リボース5−リン
酸」に訂正する。
同第11頁、下から8行目の「Mnc12゜Fec62
Jをr MnCJl’2 、 Fe(,12Jに訂正す
る。
同第16頁、第9行のr FERMP −8512Jを
r FERMP−8513jに訂正する。
同第17頁、下から9行目のrFERMP−8512J
をr FERMP−8513Jに訂正する。
同第18頁、下から5行目のrFERMP−8513J
をl’−FERMP −8512J  に訂正する。
特許請求の範囲 (1)バチルス属に属し、セドヘプ・70−ス生成能を
有する菌株を、基質としてD−リボース5−リン酸を生
成しうる物質を含有する培地に培養してセドヘプツロー
スを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
セドヘプツロースのHa法。
(2)トランスケトラーゼを欠損するバチルス属菌を用
いる特許請求の範囲第1項記載の製造法。
(3)L−チロシン、L−)リプトファンおよびL−フ
ェニルアラニンをそれぞれ25μVme以上の濃度で含
有する培地を用いる特許請求の範囲第1項記載の製造法
(4)トランスケトラーゼを欠損し、セドヘプツロース
生成能を有するバチルス・ズブチリス。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)バチルス属に属し、セドヘプツロース生成能を有
    する菌株を、基質としてD−リボースを−5−リン酸を
    生成しうる物質を含有する培地に培養してセドヘプツロ
    ースを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
    るセドヘプツロースの製造法。
  2. (2)トランスケトラーゼを欠損するバチルス属菌を用
    いる特許請求の範囲第1項記載の製造法。
  3. (3)L−チロシン、L−トリプトファンおよびL−フ
    ェニルアラニンをそれぞれ25μg/ml以上の濃度で
    含有する培地を用いる特許請求の範囲第1項記載の製造
    法。
  4. (4)トランスケトラーゼを欠損し、セドヘプツロース
    生成能を有するバチルス・ズブチリス。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009066822A1 (en) * 2007-11-21 2009-05-28 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology A method of producing sedoheptulose using thermostable enzymes
JP2016512704A (ja) * 2013-03-21 2016-05-09 メディツィニッシェ ユニヴェルシテート ウィーン 栄養補給剤としてのセドヘプツロースの使用
WO2019208747A1 (ja) 2018-04-27 2019-10-31 長瀬産業株式会社 セドヘプツロースの製造方法

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