JPH04169190A - トレハルロースおよびパラチノースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はトレハルロースおよびパラチノースの製造法に
関する。更に詳しくはトレハルロースおよびパラチノー
スを製造するに際し、トレハルロースを高濃度に含有す
るシロップを製造する方法に関するものである。

（従来の技術） トレハルロースおよびパラチノースは非う蝕原性甘味料
として現在、広く使用されており、天然には蜂蜜中の成
分として存在する。トレハルロースおよびパラチノース
の工業的生産は蔗糖に微生物の生成するα−グルコシル
トランスフェラーゼを作用させ製造されている。従来、
蔗糖をパラチノースまたはトレハルロースに変換する酵
素、α−グルコシルトランスフェラーゼ生成微生物とし
てプロタミノバクタ−属１セラチア属、エルウィニア属
の菌株が知られている０例えば、ドイツ特許明細　書１
．０４９．８００号にはプロタミノバクタ−・ルブラム
、セラチア・プリムチ力等の微生物由来酵素により蔗糖
をパラチノースに変換する方法、特公昭５７−１０７２
０にはアロタミノバクター属又はセラチア属微生物を蔗
糖溶液中で好気的条件下で培養してパラチノースを製造
する方法、特公昭６０−９７９７の固定化酵素によるイ
ソマルチュロースの製造法においてはエルウィニア属微
生物を使用する方法が記載されていおり、これらの方法
においてトレハルロースが副産物として生成する。

（発明が解決しようとする課題） 従来知られているこれらの微生物生産酵素によるパラチ
ノースおよびトレハルロースの製造ではパラチノースと
トレハルロースの生成比率は６：１〜１０．１程度であ
る。パラチノースは容易に結晶化するため、反応液を精
製後、濃縮し結晶化して製品とするが、トレハルロース
は結晶化しないのでパラチノース結晶を回収後の最終蜜
に残り、これを更に精製濃縮した液状製品のトレハルロ
ースシロップが得られる。しかし前述の酵素反応におい
ては目的生産物のパラチノース、トレハルロース以外に
副生成物として単糖のグルコース、フルクトースやイソ
マルトース、イソメレチト−ス等が生成する。これらの
内、単糖のグルコース、フルクトースの生成割合は反応
液中の糖組成の約５％存在する。これら単糖は製造工程
中の濃縮など繰り返し行われる加熱により製品の着色を
来し、以後の生産物回収工程において脱色工程が欠かぜ
ない等、目的生産物の生産効率や製造工程上の問題があ
った。またこの工程で得られた製品を、低う触性の飲食
物を製造する際に糖質甘味料として使用した場合、パラ
チノースは水に対する溶解性がやや低いため、最終製品
中で結晶が析出する場合があり含有率に制限を受けるの
に対し、溶解性の高いトレハルロースを主成分とするシ
ロップではその問題がなくまた甘味の質も良い、この様
な事情があるにもかかわらず従来の製造方法ではトレハ
ルロースの生成量が少ないためトレハルロースシロップ
が不足がちであった。上記の状況からトレハルロースの
生産比率が高く、そして単糖の生成が少ない酵素生産菌
が望まれていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者等は予てより単糖生成が少なく、トレハルロー
スの生産比率の高い生産菌の探索を行ってきたが、タイ
国つドン県りムバワピー郡の製糖工場内で採集した土壌
から純粋分離したシュードモナス属メソアシドフィラ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｓｏ−ａｃｉｄｏｐｈｉ
ｌａ）に属する新規な微生物ＨＸ−４５が蔗糖から単糖
のグルコース、フルクトースを殆ど生成せずトレハルロ
ースを主成分とし、パラチノースを副産物として生成す
る、従来とは全く異なった糖組成の非う触性のシロップ
を生産することを見出だし一本発明を完成したものであ
る。従来、シュードモナス属によるトレハルロースおよ
びパラチノースの製造法は知られていない、なお本発明
で使用されるトレハルロースおよびパラチノース生産菌
としてはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
に属し、トレハルロースおよびパラチノース生産能を有
するものであれば、いかなる微生物でもよい９例として
本発明者らがタイ国つドン県の土壌より採取したシュー
ドモナス属の細菌ＨＸ−４５株があげられ／、、　　）
４Ｘ−４５株の菌学的性状は下記の通りである。

（ａ）形態 肉汁寒天斜面培地上で２８°Ｃ１３日間培養後、位相差
顕微鏡による観察および鞭毛染色を行った結果、ＨＸ−
４５は華鞭毛を有する１、ＯＸｌ、６〜２６ノｌ１１の
ダラム陰性桿菌で、多形性を示さず、運動性があり、極
鞭毛を有し、胞子を形成しない。

（ｂ）各種培地上での成育状態 １　肉汁寒天平板培養、２８°Ｃで３日間培養で直径２
ないし３ｍｍの円形、隆起状、金縁の集落を形成する０
表面は平滑、不透明、灰白色を呈する。

２　肉汁液体培養・２８℃で３日間培養・で混濁状に成
育し２＠体の一部が沈殿し、表面に薄い菌膜を形成する
。

３　キングＡ、キングＲ培地における２０’Ｃで３０日
間培養で、蛍光色素、ビオシアニン、力ロヂノイドなど
の色素生産は認められない。

（ｃ）生理的性質 １．０Ｆデスト　　　二酸化的 ２　色素生産性 蛍光色素　　二なし ビオシアニン：なし カロチノイド・なし ３　生育温度眼界　・１０〜３８℃ ４　チトクロームオキシダーゼ反応：陽性５　硝酸温の
還元能：陽性 ６　脱炭酸反応 アルギニン　：陽性 リジン　　　：陰性 オルニチン　：陰性 ７　脱窒反応　　　：陰性 ８　ゼラチンの分解性（ＧＥＬ）　　：陽性９、澱粉の
分解性　：陰性 １０、　Ｔｗｅｅｎ　８０の分解性：陰性１１　　炭水
化物の利用（＋°生育、−゛生育なし）Ｄ−グルコース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース し−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−マンノース マルトース トレハロース スクロース ラフィノース Ｄ−ソルビトール Ｄ−マンニトール ラクトース １２　　エスクリンの加水分解性：陽性１３、　）ＩＲ
テスト　　　　：陰性 １４、νＰテスト　　　　　：陰性 １５、インドールの生成：＃ｉ性 １６　　クエン酸資化性　：陽性 １７　　ウレアーゼ活性　・陽性 １８、カタラーゼテスト：陽性 １９　　硫化水素の生成　：陰性 ２０　　酸素の要求性　　：好気的 上記の菌学的性質を有する）ＩＸ−４５株をバーシーズ
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｈａｎｕａｌ　ｏｒ　５ｙｓ
（ｅ＋＋＋ａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　　
Ｖｏｌｕｍｅ　２により分類学上の位置を照合した結果
、本菌株、ＭＸ−４５は偏性好気性グラム陰性桿菌のシ
ュードモナス属メソアシドフイラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｉ＋ｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）と同定した。

シュードモナス属メンアシドフィラ（ＰＳｅｕｄｏｌｏ
ｎａＳｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）　　ＨＸ−４５
は工業技術院微生物工業技術研究所に「微生物寄託番号
微工研菌寄託第１１８０８号」として寄託した。シュー
ドモナス属に属する菌種が蔗糖をトレハルロースおよび
パラチノースに変換することは従来全く知られていない
ことであり、この属の菌株を使用することが本発明の重
要な特徴である。以下に本発明に関わるトレハルロース
およびパラチノースの製造法について説明する。

本菌の生産する、蔗糖をトレハルロースおよびパラチノ
ースに変換する酵素は糖転移酵素の一種と考えられ、培
地中に蔗糖、フルクトース、パラチノースが存在するこ
とにより誘導的に生産され菌体付随的に存在する。従っ
て工業的には酵素生産培地で菌体を培養後、菌体をその
まま固定化した固定化酵素を製造し、バイオリアクター
に充填し、これに蔗糖溶液を連続的に通液して反応させ
ることによりトレハルロースおよびパラチノースを生成
させ、反応液を脱塩　精製、濃縮して目的生産物９得る
。

シュードモナス属細菌は一爪にその性状が変化しやすく
、自然にも、人為的にも容易に変異が起こるが、シュー
ドモナス尻細菌に出来するいかなる変異株であろうとも
パラチノース、トレハルロース生産能を有するものであ
れば本発明に使用することが出来る。

培養は通常液体培地を用いて好気的に行う、酵素生産用
の培地組成は炭素源としては、例えば蔗糖、洗糖蜜、廃
糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、グリセ
ロール、有機酸類が適宜使用されうるが、蔗勲、洗糖蜜
、廃Ｎ蛮が好適に使用でき、培地中の量的割合としては
１〜１５Ｘ（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは５〜１３％（Ｗ
／Ｖ）の範囲で添加使用する。窒素源としては、微生物
が使用しうる酵母エキス、肉エキス、ペプトン、麦芽エ
キス、コーンスチープリカー、尿素、硫酸アンモニュー
ム、硝酸アンモニューム、塩化アンモニューム、リン酸
アンモニューム、などの有機および無機窒素化合物が使
用できるが、酵斤エキス、コーンスチーブリカーなどが
特に好ましい、無機塩類としてはリン酸、マグネシウム
、カルシュラム、カリウム、鉄などの通常、細菌の培養
に必要な塩類が単独または適宜組合わせ使用される。さ
らに必要により他の有機物、無機物が培地に添加される
。

培養温度は菌体が成育する１０〜３８°Ｃで行われるが
、好ましくは約２５−３５℃の範囲である。また培地ｐ
１１は５０〜７．０好ましくはｐｌ＋６．０〜７０の範
囲で調整される０通常の培養槽を用いる培養においては
１／１０〜１ｖｖｍ程度の通気と１００〜６００ｒｐ１
１程度の攪拌を行う、培養時間は１６−８０時間程度で
ある。

培養終了後培養液を冷却し、遠心分離により沈殿部分を
回収する。固定化酵素とする場合は種々の方法が適用出
来るが、−例として、これをアルギン酸ナトリュウムと
混合して、塩化カルシウム溶液内に滴下して粒状にゲル
化させる。この粒状化酵素をさらにポリエチレンイミン
、ゲルタールアルデヒドで処理して固定化酵素とする。

これをカラムに充填し濃度２０〜６０　Ｘｗ／ｗの蔗糖
溶液を温度的２５°ＣｐＨ５，５に調整して通液し反応
させる０反応液はｒ通接、イオン交換樹脂で脱塩してか
ら濃縮し製品とする０本法の製品中のパラチノースとト
レハルロースの生成比率は１：３〜１：１０である。必
要に応じてこの混合液をイオン交換樹脂を用いた通常の
クロマト分離などにより分画することによりさらに高純
度のトレハルロース製品を容易に得ることが出来る。

トレハルロースシロップは溶解性が高いので、加工性お
よび製品である食品の品質の安定性改善を目的としてフ
ルクトース、パラチノース、異性化糖、マルチトール等
の各種糖類と混合したり、甘味増強剤を添加し使用する
ことが出来る。

（発明の効果） パラチノースおよびトレハルロース製造に際し、従来使
用していたｐ、　ｒｕｂｒｕａｔ菌等に代えて新菌株シ
ュードモナス属メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ−
ｎａｓ　ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）　）ＩＸ−４
５を使用することにより、トレハルロースシロップの増
産が可能となる。

また本発明の方法では製品中の単糖のフルクトース、グ
ルコースの生成量がごく僅かであり、従って製造工程中
の反応液の加熱による着色が少ないので清浄工程が簡略
化出来、着色度の低い清澄なトレハルロースシロップが
得られる。さらに従来前に比較し反応液糖組成のパラチ
ノースの割合が低いので反応液からのパラチノースの晶
出が避けられるので原料の蔗糖溶液濃度を上昇させるこ
とが出来、工程中の微生物汚染の回避並びに高濃度原料
処理によるコストダウンが可能となる。

実施例 ［酵素生産］ 蔗糖１００ｇ、ペプトン１０ｏ、肉エキス３ｇ、酵母エ
キス５Ｑ、燐酸ニナトリウム２Ｑおよび塩化ナトリウム
３Ｑを水に溶解して１ｆＪとし、水酸化ナトリウム溶液
てｐＨ６，５〜７０に調整したものを培地とした。殺菌
条件はオートクレーフで温度１２０°Ｃて２０分間とし
た。５００ｍ１振とうフラスコに培地を１００ｍ１入れ
、Ｐ、ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐＨｉｌａ　ＨＸ−４５のス
ラントを接種して、２８°ＣＣ１１４０ｒｐで２４時間
培養したものを種菌とした。容量５．Ｏ，ｆｆのファー
メンタ−に培地側を入れて殺菌・冷却して温度２８°Ｃ
とした後。

種菌を接種し、通気速度１／Ａ　ｖｖｍ、　４３０ｒｐ
ｍ攪拌下で約６０時間培養した。培養中温度は２８°Ｃ
，ｏｆｆは約６５に保った。培養液の糖転移酵素活性は
３０１／ｉｆ　テあった。１ｕはＩＪＩ＋５．５（７）
２０％蔗７居ンδンル中ｒ２０℃で反応させたとき、蔗
糖の生産物への転換の初速が１分間に１μモルとなる酵
素量を１華位（Ｕ）とした。

［酵素の固定化］ 培養液を５℃に冷却し、８，０ＯＯＧ、　５分の遠心分
離を行って、上清液を捨て沈殿部分を回収した。

沈殿は４ｘアルギン酸ナトリウム溶液と１：１　（ｗ／
Ｖ）の割合で混合し、滴下装置により孔径０５■醜のノ
ズルから０．２５８塩化カルシウム溶液内に滴下して粒
状にゲル化させ２時間エージングした後、水洗し粒状化
酵素とした１次いでこの粒状化酵素を塩酸を加えてｐｌ
ｌ５．５に調整した２χのポリエチレンイミン（ＰＥＡ
）溶液とｔ：ｔ　（ｗ／ｗ）の割合で混合して５分間放
置し、直ちに濾過してＰＥＩを吸収した粒状化酵素を回
収し、続いて冷却して５°Ｃとした０、　５％グルタル
アルデヒド（ＧΔ）溶液中に投入して３０分間ゆるやか
に攪拌後、混合物を濾過し、充分に水洗して固定化酵素
２００Ｑを製造した。本固定化酵素の特性を調査した結
果、活性は７０１１／（ｌであり、温度２５−５０°Ｃ
の酢酸カルシウムバッファー溶液９０１に固定化酵素５
ｇを１８時間浸積した耐熱性試験では４５°Ｃ以上では
活性が急激に低下した。ｐｌｌは５．０−７．０で活性
が高く、反応温度は１５−３０℃の実験では温度が低い
程トレハルロースの生成が多く、逆に温度が高くなると
パラチノースの生成量が増加し、グルコース、フルクト
ースの生成率が多くなった。

［トレハルロースおよびパラチノースの製造］上記、）
ＩＸ−４５の固定化酵素を内径１５＋ｎ、長さ３００ｍ
ｍのカラムに２５　Ｑ充填し、固形分５０％（ｗ／ｗ）
の蔗糖溶液を温度２５℃、流速８．５ｍｌ／ｈで通液し
、カラムから固形分５０　％　（ｗ／ｗ）の流出反応液
を得た１反応液のＮ組成は以下の通りであった。

反応液糖組成 フルクトース　　　　　　０２％ グルコース　　　　　　　０２ スクロース　　　　　　　１０ パラチノース　　　　　１６２ トレハルロース　　　　８２０ その他　　　　　　　　０４ 計　　　　　　　　　　１００％ 上記反応液を濾過し、カチオン交換樹脂塔、アニオン交
換樹脂塔に通液して脱塩Ｎ製し、濃縮してトレハルロー
スを主成分としたシロップ製品を得た。木製品は従来品
に比べ単糖の含有量が少なく、清澄でトレハルロースの
含有率が高いシロップである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の生産する酵素を利用し、蔗糖からトレハ
   ルロースおよびパラチノースを生産するに際し、全生成
   物中のトレハルロース含有量が５０％以上であることを
   特徴とするトレハルロースおよびパラチノースの製造法
   。
2. （２）トレハルロースおよびパラチノース生産能を有す
   る微生物の生産する糖転移酵素を固定化してトレハルロ
   ースおよびパラチノースを製造する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
3. （３）糖転移酵素を生産する微生物がシュードモナス属
   に属する微生物である特許請求の範囲第１項および第２
   項記載の方法。
4. （４）シュードモナス属に属する微生物がシュードモナ
   ス・メソアシドフィラＭＸ−４５（微工研菌寄託第１１
   ８０８号）である特許請求の範囲第１項および第２項記
   載の方法。（５）トレハルロースおよびパラチノースの
   生産能を有するシュードモナス・メソアシドフィラＭＸ
   −４５（微工研菌寄託第１１８０８号）。