JPH0191793A

JPH0191793A - ジ‐ｄ‐フラクトシルフラノース２，６′：６，２′ジアンハイドライドの製造法

Info

Publication number: JPH0191793A
Application number: JP24588787A
Authority: JP
Inventors: Kokichi Tamura; 幸吉田村; Takashi Kuramoto; 倉本　隆志; Sumio Kitahata; 北畑　寿美雄
Original assignee: Maruzen Kasei Co Ltd
Current assignee: Maruzen Kasei Co Ltd
Priority date: 1987-10-01
Filing date: 1987-10-01
Publication date: 1989-04-11
Anticipated expiration: 2012-05-28
Also published as: JP2614460B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、酵素を利用してレバンまたはフレインよりジ
−ローフラクトシルフラノース　１，２．６’：６，２
’ジアンハイドライドを製造する方法に関するものであ
る。

従来の技術ジ−ローフラクトシルフラノース　１，２．６’：６，
２’ジアンハイドライド（略称ＤＦＡＩＶ、構造式下記
）は、フラクトースに似たされやかな甘味を有し、熱に
安定であり、また微生物により資化されないという特長
があるため、低カロリー且つ難う触性の甘味料としての
利用が期待されている。

○− 従来、ＤＦＡＩＶを製造する方法としては、アースロバ
フタ−・ウレアファシェンスが生産するレバンフラクト
トランスフェラーゼをレバンに作用させる方法があった
（Ｃｓｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、第９
９巻、　１９７〜２０４頁、１９０年）。しかしながら
、アースロバフタ−・ウレアファシェンスのレバンフラ
クトトランスフェラーゼ産生力は弱く、この菌を用いる
方法によってレバンフラクトトランスフェラーゼを経済
的に得ることは困難である。したがって、上記公知方法
でも、アースロバフタ−・ウレアファシェンスを培養す
る培地中に原料のレバンを添加しておき、培地中に生産
される酵素をその場で利用してＤＦＡＩＶを生成させる
方法を採用しており、菌培養物から採取した酵素をレバ
ンに作用させているわけではない。しかも、アースロバ
フタ−・ウレアファシェンスはレバンフラクトトランス
フェラーゼと共に著量のβ・フラクトースーゼを生産す
るから、粗酵素液を使用するとＤＦＡＩＶよりもフラク
トースを大量に生成してしまうという問題がある。これ
らにより、あるいはアースロバフタ−・ウレアファシェ
ンスのレバン７ラクトトランスフエラーゼに固有の特性
によるものか、ＤＦＡＩＶの生産性はきわめて低く、し
かも種々の培地成分を含む反応液からＤＦＡＩＶを単離
するのに多段の精製を必要とするという問題があった。

発明が解決しようとする問題点したがって本発明の目的は、レバンまたはフレインを原
料として従来よりも効率よ＜ＤＦＡ■を製造する方法を
提供し、ＤＦＡＩＶを安価に利用し得るようにすること
にある。

問題点を解決するための手段上記目的を達成するため、本発明者らは多くの微生物に
ついてレバンフラクトトランスフェラーゼ産生能と酵素
活性の観点からスクリーニングを行い、シュードモナス
属に属する一細菌すなわちシュードモナス・フルオレッ
センスＭＺ　Ｎｏ、９４９　（微工研菌寄第９２３５号
）がすぐれた性質を有することを知った。

本発明は上記知見に基づくものであって、シュードモナ
ス属細菌が生産するレバンフラクトトランスフェラーゼ
をレバンに作用させることを特徴とするものである。

上記ＭＺ　Ｎｏ、９４９株は、広島県尾道市の土壌より
分離されたものであって、その菌学的性質は次のとおり
である。

（ａ）形態 ■細胞の形および大きさ０．５〜０．７ｘ２．Ｏ〜３．５Ｑの桿菌■運動性：あ
り。１本以上の極鞭毛を有する。

■胞子；なし ■ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：なしくｂ）生育 ■肉汁寒天斜面培養中程度の発育；透明；やや赤味を帯びる。

■肉汁液体培養：中程度の発育；表面に膜形成。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

■リドマスミルク　：変化しない。

■ＢＣＰミルク　−変化しない。

（ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元：する。

■脱窒：しない。

■ＭＲテスト　：陰性 ■ｖｐテスト：陰性 ■インドールの生成：なし ■硫化水素の生成：なしくＴＳＩ寒天培地）■デン粉の
加水分解：なし ■クエン酸の利用：あり　（クリステンセン培地）■無
機窒素源の利用硝酸塩およびアンモニウム塩を利用する。

［相］色素の生成：水溶性、蛍光性の色素を生成する。

■オキシダーゼ：陽性＠カタラーゼ：陽性［相］生育の範囲：ｐＨ４〜１０で生育する。

４°０１２７℃で生育する。３７℃で生育しない。

■酸素に対する態度：好気性＠　Ｏ−Ｆテスト　ニゲルコースを酸化する。

（Ｈｕｇｈ　Ｌ　５ｉｆｓｏｎ法） ■炭水化物の利用ｚＤ−グルコース、Ｌ−アラビノース
、トレハロース、イノシトール、Ｌ−バリン、ｐ−ヒド
ロキシ安息香酸を利用する。シュクロース、ゲラニオー
ル、アセトアミド、エタノールを利用しない。

Ｏアルギニンの脱炭酸：陽性［相］プロトカテキン酸の分解：オルト型の開裂以上の
諸性状をバー　ジエイのマニュアル・オブ・デターミネ
イティブ・バクテリオロジ−、第８版（Ｈ７４）の記載
と照合することにより、本菌がシュードモナス・フルオ
レッセンス［ミグラ　１８９５］であることを確認した
。

本発明の実施に用いるレバンフラクトトランスフェラー
ゼは、上記ＭＺ　Ｎｏ、９４９株で代表されるシュード
モナス属レバン７ラクトトランスフエラーゼ生産菌を、
β−２，６結合を持つフラクトースポリマー含有培地で
培養することにより得られる。フラクトースのポリマー
を酵素誘導基質として含有させることを除けば、培地と
して特殊なものは必要としない。シュードモナス属細菌
の培養に通常使用される培地、すなわちグルコース等の
炭素源および酵母エキス、ペプトン等の有機窒素源、そ
の他硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン
などの無機塩類等を基本成分として適宜組合せたｐＨ５
〜８程度の培地を用いることができる。

培地に含有させる上記フラクトースのポリマーとしては
、レバン、フレイン等を用いることができ、その好適濃
度は０．０１〜３０％、特に好ましくは１〜５％である
。培養は、シュードモナス属細菌培養の常法に従って行
うことができる。目的とする酵素は菌体外に生産される
。生産は菌の対数増殖期に始まり、定常期にほぼ最大生
産量に達するので、通常は定常期に達したあと適当な時
期に培養を打切る。培養終了後は直ちに遠心分離して菌
体を除去する。菌体を除いただけの培養液でも粗レバン
フラクトトランスフェラーゼ液として利用できるが、こ
れを、硫安塩析、限外ろ過、ゲルろ過等の精製手段を用
いる酵素精製の常法に従って精製すれば、より活性が強
く、利用し易いレバンフラクトトランスフェラーゼを得
ることができる。得られるレバン７ラクトトランス７エ
ラーゼは安定で、冷蔵庫で数カ月間保存可能であり、冷
凍庫中ならば、さらに長期間保存することができる。

上述のようにして得られたレバンフラクトトランスフェ
ラーゼの粗酵素液または精製品をレバンまたはフレイン
に作用させる場合、好適反応条件は、レバンまたは７レ
イン濃度１〜２０％、反応液ｐＨ５〜８　（特に好まし
くは５．５〜６．５）、反応温度２０〜６０℃（特に好
ましくは４０〜５０℃）である。

反応終了後、１００℃に約１０分間加熱して酵素を失活
させ、生じる沈殿を除去した反応液から、たとえば活性
炭カラムクロマトグラフィー等により、ＤＦＡ■を得る
ことができる。さらに高純度のものとする必要がある場
合は、たとえば９５％エタノールから結晶化させる。

発明の効果本発明の製法は、アースロバフタ−属細菌培養液中でレ
バンを分解させる従来の製法と違って酵素液とレバンま
たはフレインを反応させるものであること、用いるレバ
ンフラクトトランスフェラーゼが分離困難なβ−フラク
トシダーゼを含有しないこと、などにより、従来法と比
べて生産性および反応収率が著しく高く、反応生成物か
らＤＦＡＩＶを分離するための精製も容易である。

したがって本発明によれば、高品質のＤＦＡＩＶを従来
よりもはるかに安価に提供することが可能になる。

実施例以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　ルレバン　１％、ペプトン　１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％
、ＮａＮ０，０．５％、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ！Ｏ０，０５
％、ＭＩＩＣＩ！・４Ｈ，ＯＯ，０２％を含むｐＨ７，
０の培地１００ｍ１を５００ｍ１容坂ロコルベンに入れ
、シュードモナス・フルオレッセンスＭＺ　Ｎｏ、９４
９を植菌して、２８℃で４日間振とう培養した。培養終
了後、遠心分離して培養液から菌体を除き、粗酵素液を
得た。

一方、レバンｌｏｇを１０＋ａｌの温湯に溶解し、今後
ｐｉ（を６．０に調整した。この溶液に上記粗酵素液を
加え、３７℃で５時間反応させた。次いで１００℃に加
熱して酵素を失活させた後、減圧下にｌＯ＋１まで濃縮
した。濃縮液は活性炭カラム（直径５　ｃｍ、高さ５０
ｃｍ；粒状活性炭１５０ｇとハイクロス−パーセル１５
０ｇとの混合物を充填）に吸着させ、蒸留水２ａを流し
た後、５％エタノール水溶液で溶出しｔ；。溶出液は、
ＴＬＣにてＤＦＡＩＶを検出しながら２０ｍ１ごとに集
め、ＤＦＡ■溶出フ溶出シラクシジン、１０〜５０）を
集めて濃縮乾燥し、粗ＤＦＡＩＶ　　３．０ｇを得た。

次いでこれを９５％エタノールから結晶化させることに
より、Ｍ’ＪＡＤＦＡＮ　Ｏ，５ｇをｍｆニー。ソ（７
）［αｌＦバー　３２６、融点は１７７°Ｃで、標品と
よく一致した。

なお、上記カラム溶出液から７ラクトースは全く検出さ
れなかった。

実施例　２レバンにかえて同量のフレインを含有させた培地を用い
たほかは実施例１と同様にして、粗酵素液を得た。

次いでこれに硫安を６０％飽和になるよう加え、生じた
沈殿を遠心分離して集め、ｐＨ６，０の０．０１Ｍ酢酸
緩衝液に溶解し、同緩衝液で２日間透析し、部分精製酵
素液１５ｍ１を得た。

一方、風乾したフレラム・プラテウスの根茎の粉砕物５
０ｇに２５０ｍ１の水を加え、６０〜７０℃に加温して
１時間攪拌することにより、フレインを抽出した。

得られた抽出液に水酸化カルシウム１ｇを加え、生じた
沈殿をろ別した。得られたろ液２４０＋ａｌを、そのＤ
Ｈを６．０に調整してから上記酵素液と混合し、２００
Ｃで１０時間反応させた。以下、実施例１と同様に処理
して、結晶化ＤＦＡＩＶ　　１．０ｇを得た。その［α
］ｒは一３２°、融点は１７７℃で、標品とよく一致し
た。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュードモナス属細菌が生産するレバンフラクト
トランスフェラーゼをレバンまたはフレインに作用させ
ることを特徴とするジ−Ｄ−フラクトシルフラノース１
，２，６′：６，２′ジアンハイドライドの製造法。
（２）シュードモナス・フルオレッセンスＭＺＮｏ．９
４９（微工研菌寄第９２３５号）が生産するレバンフラ
クトトランスフェラーゼを用いる特許請求の範囲第１項
記載の製造法。