JPH0362397B2

JPH0362397B2 -

Info

Publication number: JPH0362397B2
Application number: JP13280184A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Tosa; Koichi Nabe; Yutaka Nishida; Katsuhiko Nakamichi
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1984-06-26
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1991-09-25
Also published as: JPS6112296A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明はＤ−、Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒ
ダントインよりＬ−フエニルアラニンを製造する
方法に関する。（従来技術）Ｌ−フエニルアラニンは必須アミノ酸の一つで
あり、栄養上あるいは医薬上重要な物質である。
本発明方法の原料である５−ベンジルヒダントイ
ンは有機合成化学的に容易に合成される物質であ
り、従来、５−ベンジルヒダントインからＬ−フ
エニルアラニンの製造法としては、フラボバクテ
リウム・アミノゲネス（Flavobacterium
aminogenes）FERM−P3133を５−ベンジルヒ
ダントインに作用させてＬ−フエニルアラニンを
製造する方法が知られている（特公昭54−2274）。（発明の目的）本発明は酵素法によりＤ−、Ｌ−又はDL−５
−ベンジルヒダントインからＬ−フエニルアラニ
ンを効率よく製造する方法を提供するものであ
る。（発明の構成及び効果）本発明者らは、Ｄ−、Ｌ−又はDL−５−ベン
ジルヒダントインを極めて効率よくＬ−フエニル
アラニンに転換する酵素を有する新菌種、フラボ
バクテリウム・エスピー−３（Flavobacterium
sp Ｉ−３）を土壌から分離することに成功し、
本発明を完成するに至つた。即ち、本発明はＤ−、Ｌ−又はDL−５−ベン
ジルヒダントインからＬ−フエニルアラニンを生
成せしめる能力を有するフラボバクテリウム・エ
スピーＩ−３菌の培養液、該培養液から採取した
菌体又は該菌体処理物を、Ｄ−、Ｌ−又はDL−
５−ベンジルヒダントインに作用させ、生成した
Ｌ−フエニルアラニンを採取することからなるＬ
−フエニルアラニンの製造法である。本発明に使用されるフラボバクテリウム・エス
ピー−３菌は本発明者らにより、新たに分離さ
れた新菌種であり、その菌学的諸性質は以下の通
りである。尚、本新菌種フラボバクテリウム・エ
スピー−３菌はFERM−P6901（微工研菌寄第
6901号）として寄託されている。 (a) 形態細胞の形および大きさ：桿菌、0.4〜0.9×1.06
〜2.0μ 細胞の多形性：なし運動性：あり、周鞭毛胞子：形成しないグラム染色性：陰性抗酸性：なし (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：生育は適度、全縁、わずかに隆起、表面は
滑らか、不透明、うすい象牙色、光沢あり (2) 肉汁寒天斜面培養：生育は適度、糸状、黄色、光沢あり (3) 肉汁液体培養：皮膜形成しない、沈澱生成、内層混濁、管
壁に沿う輪形成 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化する。 (5) リトマス・ミルク：リトマスを還元する、液化する (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：還元する。 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：コーザー培地、シモン培地、クリステンセ
ン培地のいずれでも利用する。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニウム塩を利用する。 (10) 色素の生成：水溶性色素を生成にしない (11) ウレアーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：弱陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲：PH６〜９ 37℃では生育し
ない (15) 酸素に対する態度：通性、嫌気性 (16) Ｏ−Ｆテスト：オキシデイテイブ (17) 糖類から酸及びガスの生成：

【表】以上、−３菌の菌学的諸性質の特徴として(1)
桿菌、(2)運動性、(3)グラム陰性、(4)集落は黄色、
(5)カタラーゼ陽性、(6)嫌気性・通性、(7)グルコー
スを酸化的に徐々に分解する、などがあげられ
る。これらの諸性状を基準としてBerge's
Manual of Determinative Bacteriology第８版
に基づき検索すると、−３菌はフラボバクテリ
ウム（Flavobacterium）属に属する細菌である
と判断される。しかしフラボバクテリウム属に含
まれる種について更に検索しても上記Bergey's
Manual第８版には−３菌と一致する菌種の記
載を見出せない。 Bergey's Manual第８版の記載によると、フ
ラボバクテリウム属に属する12菌種のうち、運動
性のあるのはフラボバクテリウム・リゲンゼ
（Ｆ・rigense）、フラボバクテリウム・インドル
セチカム（Ｆ・indoltheticum）、フラボバクテリ
ウム・チレニカム（Ｆ・tirrenicum）及びフラボ
バクテリウム・デボランス（Ｆ・devorans）の
４菌種である。しかし、−３菌は37℃で生育し
ないので明らかにフラボバクテリウム・リゲンゼ
とは相違する。フラボバクテリウム・イドルセチ
カムとは、デンプンの加水分解性、シヨ糖及び麦
芽糖からの酸の生成性、クエン酸の利用性、イン
ドールの生成性、硫化水素の生成性及び硝酸塩の
還元性の点で相違する。フラボバクテリウム・チ
レニカムとはゼラチン液化性、Ｄ−グルコースか
らの酸の生成性及び硝酸塩の還元性の点で相違す
る。又、フラボバクテリウム・デボランスとはシ
ヨ糖と麦芽糖からの酸の生成性及び硝酸塩の選元
性の点で相違する。更にBergey's Manual第８
版には記載されていないが、特公昭54−2274に５
−ベンジルヒダントインよりＬ−フエニルアラニ
ンを生成する酵素を有すると記載されているフラ
ボバクテリウム・アミノゲネス（Ｆ・
aminogenes）FERM−P3133とは、運動性、コ
ーザー培地でのクエン酸の利用性及び無機窒素源
の利用性の点で相違する。以上のことから−３菌をフラボバクテリウム
属に属する新菌種と認め、フラボバクテリウム・
エスピー−３（Flavobacterium sp −３）
と命名した。本発明で使用する微生物を培養する培地として
は、炭素源、窒素源、無機塩類、更に必要ならば
５−ベンジルヒダントイン等のアミノ酸ヒダント
イン化合物を含有する通常の培地が使用できる。
炭素源としては−３菌の利用可能なものであれ
ばいずれも使用することができ、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユクロース、マルトース、
デキストリン、グリセリン、ソルビトールなどの
糖もしくは糖アルコール、フマル酸、クエン酸な
どの有機酸が好適に使用できる。窒素源として
は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル塩ア
ンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸ア
ンモニウム塩等を使用することができる。更に
は、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カゼイン加水分解物などの天然有機窒素源
を使用することもできる。尚、天然有機窒素源は多くの場合、窒素源であ
るとともに炭素源にもなりうる。又、無機塩類と
しては、例えば硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、
硫酸マンガン、リン酸一カリウム、リン酸二ナト
リウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを適
宜使用することができる。更にDL−５−ベンジ
ルヒダントイン、DL−５−（インドール−３−イ
ル−メチル）ヒダントイン等のアミノ酸ヒダント
イン化合物を培地に少量添加することにより、よ
り高い活性を得ることができる。培養は、常法により実施すればよく、例えば培
地のPHを５〜８、好ましくは６〜7.5に調整し、
菌株を接種した後20〜30℃、好ましくは26〜30℃
で、通気、撹拌下16〜72時間行なう。この様にして得られる培養液は、そのまま酵素
源として、Ｄ−、Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒ
ダントインからＬ−フエニルアラニンへの転換反
応に使用してもよいが、また粗酵素標品、精製酵
素標品はもちろん、該培養液から採取した菌体又
は該菌体の処理物（例えば、凍結乾燥菌体、アセ
トン乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体磨砕物、
洗浄菌体、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理
物、菌体抽出物など）を酵素源として用いること
もできる。更に、菌体あるいは菌体処理物を、例
えばカラギーナンゲル法、ポリアクリルアミド法
などの公知方法により固定化して使用することも
できる。Ｄ−、Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒダントイ
ンをＬ−フエニルアラニンに転換する反応は、Ｄ
−、Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒダントインと
上記酵素源のいずれかとを用い水性媒体中で実施
することができる。該反応は温度20〜60℃、好ま
しくは30〜45℃、PH６〜10、好ましくは８〜９に
保つて行なう。Ｄ−、Ｌ−又はDL−５−ベンジ
ルヒダントインの濃度は約0.1％〜30％で実施す
ることができる。基質を高濃度で用いる場合に
は、該基質が完全に溶媒に溶解せず不溶物となつ
ていていても本反応の進行には何ら支障はない。
更に酵素源として固定化した菌体を用いる場合
は、固定化菌体をカラムに充填した後、基質含有
溶液を流下させる連続法により実施することもで
きる。又、本発明方法においては、反応液中に、適宜
界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアン
モニウム、トリトンＸ−100など）、有機溶媒（例
えば、ジメチルスルホキシドなど）、補酵素（例
えば、ピリドキサールリン酸など）、無機イオン
（例えば、マンガンイオン、マグネシウムイオン
など）を添加することにより反応時間の短縮ある
いはＬ−フエニルアラニンの蓄積量の増加に有効
な場合がある。かくして反応開始後１〜100時間で、供したＤ
−、Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒダントインは
完全にＬ−フエニルアラニンに転換され、反応液
中に蓄積される。生成したＬ−フエニルアラニン
は、通常の結晶化法、イオン交換樹脂法その他公
知方法を適宜使用することにより容易に分離精製
することができる。以下、実施例をあげて本発明方法を具体的に説
明する。尚、実施例中のＬ−フエニルアラニンの
定量は液体クロマトグラフイー及びロイコノスト
ツク・メツセンテロイデスＰ−60を用いたバイオ
アツセイ法により行なつた。又Ｌ−フエニルアラ
ニンの確認は、反応液から取得した結晶の元素分
析値、比旋光度、NMR、IRスペクトル等と標品
のそれとを比較することにより行なつた。実施例１ (1) 種菌の培養グルコース５％、フマル酸アンモニウム0.1
％、リン酸一カリウム0.3％、リン酸二カリウ
ム0.7％、硫酸マグネシウム、７水和物0.01％、
DL−５−（インドール−３−イル−メチル）ヒ
ダントイン0.2％を含有する培地をPH7.0に調整
し、該培地50mlを500ml容板口フラスコに入れ、
120℃で10分間減菌した。これに予め肉汁塞天
斜面培地に充分生育させたフラボバクテリウ
ム・エスピー−３菌（微工研菌寄第6901号）
を一白金耳接種し、30℃で24時間振とう
（140rpm、振幅７cm）培養した。 (2) 本培養デキストリン２％、塩化アンモニウム0.4％、
イーストエキス0.1％、ペプトン0.1％、リン酸
一カリウム0.3％、リン酸二カリウム0.7％、硫
酸マグネシウム、７水和物0.01％、硫酸第一
鉄、７水和物0.001％、硫酸マンガン0.001％、
DL−５−（インドール−３−イル−メチル）ヒ
ダントイン0.5％を含有する培地をPH7.0に調整
し、該培地50mlを500ml容坂口フラスコに入れ、
120℃で10分間滅菌した。これに(1)で得られた
種培養液0.5mlを接種し、30℃で24時間振とう
培養した。 (3) 酵素反応 (2)の培養液にDL−５−ベンジルヒダントイ
ン1.5ｇを加え、水酸化ナトリウムで液性をPH
8.5に調整した後、37℃で16時間反応させた。
反応終了後、反応液中にはＬ−フエニルアラニ
ン1.3ｇが生成蓄積していた（転換率：98％）。
該反応液を遠心分離により除菌した後、濃縮し
てＬ−フエニルアラニンの粗結晶1.3ｇを得た。
該粗結晶を少量のアンモニア水に溶解し、酢酸
で中和して結晶化させ、一夜冷蔵庫に放置した
後、結晶をろ取することによりＬ−フエニルア
ラニンの結晶1.1ｇを取得した。収率：84％〔α〕_D＝−33.8゜（ｃ＝２、水）実施例２実施例１−(1)、(2)と同様にして得た本培養液50
mlから遠心分離にて菌体を採集し、水でけん濁し
て10mlとした。一方、DL−５−ベンジルヒダン
トイン５ｇ及び臭化セチルトリメチルアンモニウ
ム５mgを2N水酸化ナトリウム約15mlに溶解し、
2N塩酸で液性をPH8.5に調整した後、水を加えて
40mlとした。両者を混合し、液性をPH8.5に保持
して、37℃で16時間反応させた。反応終了後、反
応液中にはＬ−フエニルアラニンが4.3ｇ生成蓄
積していた（転換率：97％）。実施例３ DL−５−（インドール−３−イル−メチル）ヒ
ダントインをDL−５−ベンジルヒダントインに
代える以外は実施例１−(1)及び(2)と同じ組成の培
地を用いて実施例１−(1)，(2)と同様に培養した。
該培養液200mlと実施例２と同様に調整したDL−
５−ベンジルヒダントイン液40mlとを混合し、液
性をPH8.5に保持したまま37℃で16時間反応させ
た。反応終了後、反応液中にはＬ−フエニルアラ
ニン4.15ｇが生成蓄積していた（転換率：93％）。

Claims

【特許請求の範囲】

１Ｄ−，Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒダント
インからＬ−フエニルアラニンを生成せしめる能
力を有するフラボバクテリウム・エスピ−Ｉ−３
（Flavobacterium sp −３）菌の培養液・該
培養液から採取した菌体又は該菌体の処理物を、
Ｄ−，Ｌ−又はDL−５−ベンジルヒダントイン
に作用させ、生成したＬ−フエニルアラニンを採
取することを特徴とするＬ−フエニルアラニンの
製造法。