KR970009295B1 - 트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조방법 - Google Patents

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Description

트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조방법

본 발명은 트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 신규한 미생물에 의해 생산되는 당-전환 효소를 이용하여 수크로스를 트레할룰로스와 이소말툴로스로 전환시키는 것으로 이루어지는, 고농도 트레할룰로스 시럽의 제조 방법에 관한 것이다.

이소말툴로스와 트레할룰로스는 꿀에서 발견되는 것으로 맛이 달고, 화학분류학상 글루코스 및 프럭토스로 구성되는 헤테로-디사카라이드로서 분류된다. 이 성분들은 이소말툴로스의 경우 α-1, 6-글루코사이드 결합으로, 트레할룰로스의 경우 α-1, 1-글루코사이드 결합으로 연결되어 있다.

이소말툴로스가 치아부식을 일으키지 않는다는 것은 잘 알려진 사실이다. 최근에는 트레할룰로스도 생체 내 및 시험관 실험결과 치아부식을 일으키지 않는 것으로 입증되었다. 이러한 사실들은 이소말툴로스 시럽이라 칭해지는 트레할룰로스 및 이소말툴로스-함유 시럽의 이용을 크게 부추기게 하였다.

트레할룰로스와 이소말툴로스는 예컨대 프로타미노박터 푸브룸(Protaminobacter rubum), 세라티아 spp(Serratia spp.) 및 어위니아 spp(Erwinia spp.)와 같은 몇가지 특정한 미생물에서 발견되는 α-글루코 실트랜스퍼라제에 의해 촉매된 글루코사이드 전달을 통해 수크로스로부터 대개 동시적으로 생성된다. 1959년 공도된 독일특허 No. 1049800에는 프로타미노박터 루브룸으로 표시되는 몇가지 특정 미생물을 이용하여 수크로스로부터 결정형 이소말툴로스를 제조하는 미생물적 방법이 처음으로 기재되어있다. 일본 특허공고 No. 58-38156에는 프로타미노박터, 세라티아, 어위니아 및 류코노스톡(Leuconostoc) 중에서 선택된 세균 균주를 이용하여 수크로스를 이소말툴로스로 전환시키는 호기적 연속식 배양법이 개시되어 있다. 일본 특허공고 No. 60-9797 역시 어위니아 spp. 균주로부터 유도된 고정효소를 이용하여 이소말툴로스를 생산하는 방법을 기재하고 있다. 일본 특허공고 NO. 57-10720에는 호기적 조건하, 수크로스 용액에서 프로타미노박터나 세라티아속에 속하는 미생물을 배양하는 것에 의한 이소말툴로스의 제조방법이 설명되어 있다. 이 통상적인 공정들에 있어서는, 시럽이 부수적인 생산물로서 생산된다.

특히 결정형 이소말툴로스 생산에 적합한 이들 공정에서는, 효소적 전환에 의해 수크로스로부터 생성된 트레할룰로스대 이소말툴로스의 중량비율이 1 : 6 내지 1 : 10 범위이다. 대부분의 이소말툴로스가 결정화되어 반응혼합물로부터 원심분리되어 나온후, 잔류물은 트레할룰로스를 이소말툴로스보다 실제로 더 높은 농도로 함유하는 당밀(molasses) 형태로서 얻어진다.

이 종래방법에 의해 얻어진 결정형 이소말툴로스가 회수되어 있는 잔류시럽은 이소말툴로스를 대개 포화에 가까운 농도로 함유하고, 이소말툴로스는 수용성이 낮기 때문에 저장 중 결정화하기쉽다. 이러한 현상은 종종 생산물의 상업적 가치를 저하시키고 펌핑이동을 어렵게 만든다. 이러한 결점을 피하기 위해서는 이소말툴로스를 포화점 미만으로 함유하는 트레할룰로스 시럽을 제조할 필요가 있다.

더우기, 이들 종래방법에서 수크로스를 효소처리하여 얻은 모든 조(組) 이소말툴로스 용액은 대부분의 이소말툴로스와 트레할룰로스에 덧붙여 대개 상당량의 글루코스, 프럭토스 및 이소말토스를 함유한다. 총 사카라이드 함량의 약 5%를 차지하는 글루코스 및 프럭토스의 존재는 생산효율을 크게 저하시킬 뿐 아니라 용액으로부터 이소말툴로스를 결정형태로 회수하기 위한 보다 높은 온도에서의 작업시 짙은 색상을 띠게 한다. 그러므로, 통상적인 이소말툴로스 생산공장, 특히, 잔류물을 식품용도를 위해 시럽으로 가공하는 경우에 있어서 대용량의 탈색장비가 요구된다.

일반적으로 이소말툴로스 회수공정으로부터 최종적으로 얻어진 잔류물은 탈색, 탈이온화, 여과 및 증발 단계로 된 일련의 연속공정에 의해 식품등급의 시럽으로 가공될 수 있다. 이 시럽은 조 이소말툴로스 용액에서 본래 발견되는 모든 성분들을 함유하기는 하나, 이 시럽의 주성분은 이소말툴로스가 아닌 트레할룰로스이다.

이소말툴로스를 여러 가지 다양한 식품, 특히 저치아부식성 식품에 있어서, 그의 통상적인 조성으로 수크로스의 단독 대체물로서 적절하게 사용할 수 있음은 잘 알려져 있다.

그러나 이소말툴로스는 수크로스보다 수용성이 훨씬 낮기 때문에 바람직스럽지 못하다. 따라서, 잼, 마말레이드, 젤라틴, 요깡(젤라틴 비슷한 일본의 감미 식품) 및 일반적으로 수크로스를 고농도로 함유하는 기타 식품류와 같은 식품에는 이 식품을 그의 통상적인 조성에서 이소말툴로스를 수크로스 대신 전적으로 또는 부분적으로 사용하여 제조하는 경우 이들 식품을 저장하는 중에 이소말툴로스의 부패적인 재결정화가 일어날 것이 예상되기 때문에 이소말툴로스의 결정형 조제물이 거의 사용되어 오지 않았다.

트레할룰로스와 이소말툴로스 조제물, 특히 고농도 트레할룰로스 시럽에 있어서는, 대량으로 얻어질 수 있는 한, 상술한 바와같은 식품에 있어서 결정형 이소말툴로스보다 수크로스를 대체하는데 더 적절한 것으로 사료되는데, 이는 이들이 수용성이 높고 트레할룰로스의 경우 바람직한 감미를 갖기 때문이다. 그러므로, 고농도 트레할룰로스 시럽과 같은 트레할룰로스가 풍부한 조제물은 섹품제조에 있어 그의 요구도가 증가일로에 있는 반면 통상적인 방법으로는 이들을 단지 제한적인 양으로만 공급하고 있을 뿐이다.

본 발명자들은 수크로스로부터 트레할룰로스는 고수율로 생산하고 모노사카라이드는 최소량으로 생산하는 미생물을 찾기위해 오랜동안 연구해왔다. 그 결과 최근 본 발명자들은 단지 최소량의 모노사카라이드를 부산물로서 생산할 뿐인 새로운 세균 균주들이 수크로스로부터 대부분의 트레할룰소스와 그에 부수되는 이소말툴로스를 생산할 수 있음을 발견하였으며 이 제조된 트레할툴로스 및 이소말툴로스 시럽이 종래의 것과는 완전히 다른 신규한 조성을 가지며 두가지 모두 역시 저치와 부식성임을 아울러 발견하였다.

설탕 가공지인 태국의 우드론타니(Udronthani)에서 채집된 토양 샘플로부터 분리된 생술한 새로운 균주 MX-45 및 MX-232(각각 1990년 10월 25일 및 1991년 8월 1일자로 일본 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 수탁되어 각각 수탁번호 FERM BP-3619 및 BP-3620을 부여받음)는 슈도모나스 메소아시도필라(Pseudomonas mesoacidophila)와 아크로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) 균주인 것으로 동정되었다. 수크로스로부터 트레할룰로스 및/또는 이소말툴로스를 생산하는 이들 슈도모나스 종과 아그로박테리움 종에 대한 기록이나 언급은 종래 기술에서는 전혀 찾아볼 수 없다.

본 발명을 수행하는데 있어서, 슈도모나스 속 및 아그로박테리움 속에 속하며 수크로스를 트레할룰로스 및 이소말툴로스로 전환시키는 특성을 갖는 새균 균주이면 어느 것이던지 효소 생산자로서 사용가능하다. 토양 샘플로부터 분리된 상술한 균주 MX-45 및 MX-232는 이러한 균주들의 예에 지나지 않는다.

MX-45의 세균학적 특성은 다음과 같다 :

a) 형태학 :

28℃ 영양 한천 사면 배양으로 3일간 배양시켜 상 현미경 관찰과 통상적인 염색 테스트를 수행하였다. 세포는 막대모양으로서 너비 1.0μm 길이 1.6 내지 2.6μm이다. 다형성 없는 그램-음성 막대 형임, 극성 편모를 갖는 이동성임, 포자형성하지 않음.

b) 여러 가지 배지에서의 배양 특성 :

(1) 영양 한천 플레이트 : 28℃에서 3일간 배양후, 가장자리가 완전한 직경 1 내지 3mm의 원형의 부푼 집락이 형성된다. 그 표면은 매끄럽고 불투명하며 회백색이다.

(2) 영양 브로쓰 : 28℃에서 3일간 배양후, 소량의 침강과 함께 혼탁한 생육이 관찰됨. 균막도 관찰되었다.

(3) 킹 A 및 킹 B 배지 : 20℃에서 30일간 배양하는 동안, 형광물질, 피오시아닌 또는 카로티노이드가 전혀 생산되지 않는다.

C) 생리적 특성 :

(1) OF(산화-발효) 테스트 : 산화적임

(2) 색소 생성 : 없음

(3) 생육 온도범위 : 10 내지 38℃

(4) 시토크롬 옥시다제 : 양성

(5)질산염 환원 : 양성

(6)데카르복실라제 활성

(a) 알기닌 : 양성

(b) 라이신 : 음성

(C) 오리니틴 : 음성

(7) 탈질소작용 : 음성

(8) 젤라틴(GEL) 약화 : 양성

(9) 전분의 가수분해 : 음성

(10) Tween 80의 가수분해 : 음성

(11) 탄소원의 자화 : (+ : 생육, - : 비생육)

D-글루코스 +

D-프럭토스 +

D-갈락토스 +

L-아라비노스 +

D-자일로스 +

D-만노스 +

말토스 +

트레할로스 +

수크로스 +

라피노스 +

D-소르비톨 +

D - 만니톨 +

락토스 -

(12) 에스큘린의 가수분해 : 양성

(13) MR(메틸레드) 테스트 : 음성

(14) VP(Voges-Proskauer) 테스트 : 음성

(15) 인돌 생산 : 음성

(16) 시트레이트 이용성 : 양성

(17) 우레아제 : 양성

(18) 카탈라제 : 양성

(19) 황화수소 생산 : 음성

(20) 산소요구성 : 호기성

상기의 MX-45 균주의 세균학적 특성을 Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권의 지재내용과 비교하면 균주 MX-45가 절대 호기성 그램-음성 막대형 세균인 슈도마나스 메소아시도필라에 속하는 것임을 보여준다. 이 균주 MX-45의 샘플은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(FERM :일본, 쯔꾸바)에 기탁되었으며 임시로 FERM 11808 번호를 할당받은 후 수탁번호 FERM BP-3619를 부여받았다.

MX-232의 세균학적 특성은 다음과 같다 :

a) 형태학 :

28℃ 영양 한천 사면 배양으로 3일간 배양시켜 상 현미경 관찰과 통상적인 염색 테스트를 수행하였다. 세포는 막대모양으로서 너비 0.8μm, 길이 1.5 내지 3.0μm이다. 그램-음성, 골고루 분포된 편모를 갖는 이동성임, 포자형성하지 않음.

b) 여러 가지 배지에서 배양 특성 :

26℃에서 생육, 1 내지 14일간 관찰됨

(1) 영양 한천 플레이트 28℃에서 3-4일간 배양후, 가장자리가 완전한 직경 2 내지 3mm의 원형의 부푼 집락이 형성된다. 그 표면은 매끄럽고 불투명하며 회백색이다.

(2) 영양 부로쓰 : 26℃에서 3-4일간 배양후. 균막이 나타났으며, 잠시후 균막이 일부가 바닥으로 가라앉았다.

(3) 수크로스 함유 배지 : 26℃에서 3-4일간 배양하자 풍부한 세포외 다당류 형성과 함께 배지의 점도가 증가한다.

C) 생리적 특성 :

(1) OF(산화-발효) 테스트 : 산화적임

(2) 색소 생성 : 없음

(3) 생육 온도범위 : 10 내지 38℃

(4) 시토크롬 옥시다제 : 양성

(5) 질산염 환원 : 양성

(6) 데카르복실라제 활성

알기닌 : 음성

라이신 : 음성

오리니틴 : 음성

(7) 탈질소작용 : 음성

(8) 젤라틴(GEL) 액화 : 음성

(9) 전분의 가수분해 : 음성

(10) Tween 80의 가수분해 : 음성

(11) 탄소원의 자화 : (+ : 생육, ± : 약간 생육, - : 비생육)

D-글루코스 +

D-프럭토스 +

D-갈락토스 +

L-아라비노스 +

D-자일로스 +

D-만노스 +

말토스 +

트레할로스 +

수크로스 +

라피노스 +

D-소르비톨 +

D-만니톨 +

이노시톨 +

글리세톨 +

시트르산 +

아세트산 -

숙신산 +

2-케토 글루코산 ±

L-알라닌 +

β-알라닌 +

락토스 +

(12) 에스큘린의 가수분해 : 양성

(13) MR(메틸레드) 테스트 : 음성

(14) VR(Voges-Proskauer) 테스트 : 음성

(15) 인돌 생산 : 음성

(16) 우레아제 : 양성

(17) 카탈라제 : 양성

(18) 황화수소 생산 : 음성

(19) 산소요구성 : 호기성

(20) 3-케토 락토스 생산 : 양성

(21) DNase 테스트 : 음성

(22) DNA의 GC(구아닌-시토신) 함량 : 59.2mol %

(23) 식물병원학(상처난 줄기에서 생성된 종양) : 음성

상술한 MX-232 균주의 세균학적 특성을 Bergy's Manual of Systematic Bacteriology의 기재내용과 비교하자 균주 MX-232는 절대 호기성 그램-음성 막대형인 아그로박테리움 라디오박터에 속하는 것으로 나타났다. 이 균주 MX-232의 샘플은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology(FERM : 일본, 쯔꾸바)에 기탁되어 임시로 FERM 12397 번호를 할당받은 후 수탁번호 FERM BP-3620을 부여받았다. 아그로박테리움 속에 속하는 세균이 당을 트레할룰로스 및 이소말툴로스로 전환시킬 수 있다는 사실은 이제까지 알려지지 않았던 것이며, 따라서 이 균주의 이용은 본 발명의 측면에서도 중요한 것이다.

슈도모나스 속과 아그로박테리움 속이 수크로스를 이소말툴로스와 트레할룰로스로 전환시키는 균주를 포함한다는 것은 여태까지 알려진 바 없었다. 따라서, 슈도모나스 속 또는 아그로박테리움 속에 속하는 균주를 사용하는 것은 본 발명의 중요한 특성이며, 다음에 이를 상세히 설명한다.

이러한 균주에서 발생되고, 수크로스를 트레할룰로스와 이소말툴로스로 전환시키는데 있어서 활성적인 효소는 글루코실트랜스퍼라제의 일종인 것으로 생각된다. 이것의 생산은 생육 배지중의 수크로스, 프럭토스 또는 이소말툴로스에 의해 유도되며 세포-관련 상태(cell-associated status)로서 존재한다. 그러므로, 산업상, 배양된 이 세균을 고정 효소입자에 완전히 인코포레이트시켜, 이를 컬럼에 넣은 다음 수크로스를 트레할룰로스 및 이소말툴로스로 전환시키기위해 이를 수크로스용액과 접촉시켜 컬럼을 통해 통과시킬 수 있다. 다음, 얻어진 트레할룰로스 및 이소말툴로스의 조용액을 탈이온화시킨 다음, 청정화하고 원하는 농도의 시럽이 되도록 최종적으로 증발시킨다.

슈도모나스 또는 아크로박테리움 세균은 대체로 그 특성이 매우 다양하며 천연 또는 인공적으로 돌염변이를 일으키기가 쉽다. 그러나, 본 발명 수행을 위해서는, 어떠한 변이제 및 변형제이던지, 그것이 수크로스를 트레할룰로스 및 이소말툴로스로 전환시키는 효소활성 생성능력을 보유 또는 유지케하는 것이면 어느 것이든지 이러한 변이제 및 변형제로서 사용될 수 있다.

본 발명에서는, 효소생산에 이용되는 미생물의 배양을 호기적 조건하에서 수행한다. 배지의 탄소원으로는, 수크로스, 애피네이션(affination) 시럽, 폐기 당밀, 글루코스, 프럭토스, 말토스, 글리세롤, 유기산과 같은 물질중 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 이중에서도 수크로스, 애피네이션 시럽 및 페기 당밀이 바람직하다. 배지중의 탄소원 함량은 1 내지 15%(w/v)이며, 더욱 바람직하게는 5 내지 13%(w/v)이다. 배지중 질소원으로는 효모추출물, 고기추출물, 펩톤, 말트추출물, 콘스팁리쿼, 요소, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등을 이용할 수 있으며, 특히 효모 추출물과 콘스팁리쿼가 바람직하다. 배지중 무기염으로는, 인산염, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 염화칼륨, 황산철등과 같이 세균생육에 일반적으로 요구되는 염들을 단독으로 또는 서로 배합해서 이용할 수 있다. 또한 필요에 따라 기타의 무기 또는 유기물질을 배지에 첨가할 수 있다.

배양은 10 내지 38℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 35℃에서 행한다. 배양중 배양액의 pH를 5.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 7.0으로 유지한다. 통상적인 발효기를 배양에 이용하는 경우, 1/10 내지 1vvm의 통기율과 100 내지 600rpm의 교반속도 조건하에서 작동시킨다. 배양은 16 내지 80시간 범위내에 종결시킨다. 배양완료후, 배양액을 냉각, 원심분리시켜 침전물 슬러리내의 세균세포를 수확한다.

효소 고정화에는 적용가능한 여러 가지 기존법을 사용할 수 있다. 그러나 다음에는 한가지 구체예만 설명하였다. 슬러리를 균일한 세포현탁액이 되도록 알긴산나트륨 용액과 혼합한 다음, 이를 염화칼슘 교반용액에 작은 방울형태로 떨어뜨려 구형 펠렛형태로 고화시킨다. 펠렛을 수집, 수세한 다음 폴리에틸렌이민 용액을 주입시킨다. 주입된 펠렛을 글루타르알데히드 용액으로 처리하여 고정효소의 최종 조제물로 전환시킨다.

반응기로는, 이러한 고정효소로 충전된 쟈켓 컬럼을 이용할 수 있다. 25℃로 유지된 컬럼에 pH 5.5, 20-60%(w/w) 수크로스 용액을 통과시킨다. 컬럼으로부터의 유출물을 여과하고, 이온교환수지로 탈이온화시킨다음, 증발시켜, 본 발명에 따른 방법에서 얻어지는 최종생성물인 시럽으로 만든다. 이러한 생성물내의 트레할룰로스 : 이소말툴로스의 비율은 4 : 1 내지 10 : 1이다. 요구되는 경우, 이온교환수지 컬럼에서 크로마토그래피 분획화를 통해 보다 높은 순도상태로서 트레할룰로스가 더 풍부한 조제물로 가공하는 것도 수월하게 행할 수 있다.

트레할룰로스의 높은 수용성에 따라, 여러 가지 식품, 특히 습기가 있는 식품에 상술한 바와같이 얻어진 고농도 트레할룰로스 시럽을 이용하여, 프럭토스, 이소말툴로스, 고농도 프럭토스 옥수수 시럽, 말티톨 등과 같은 당과 배합되어, 강력한 감미료의 존재 또는 부재하에서 식품의 저장기간을 연장시킬 수 있다.

본 발명에 따른 이소말툴로스 및 트레할룰로스의 제조방법에서는 종래사용되어온 P.루브룸 및 세라티아 또는 어위니아 속의 미생물 대신 슈도모나스 메소아시도필라 MX-45나 또는 아그로박테리움 라디오박터 MX-232를 이용함으로써 프레할룰로스 시럽의 생산성 증가를 달성할 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 트레할룰로스 시럽은 실제로 이소말툴로스보다 트레할룰로스를 더 많이 함유한다. 따라서, 얻어진 생성물이 농축되어도, 이소말툴로스가 포화농도에 도달하지 못하므로 결정형 이소말툴로스가 분리될 수 없다.

또한, 본 발명에 따른 효소적 전환에서는 클루코스 및 프럭토스가 단지 소량으로 생성되기 때문에 공정 중 생성물의 색 형성이 매우 적으며, 단순한 탈색처리를 통해 덜-착색된 최종 생성물을 얻을 수 있다. 이에 더해, 본 발명에서의 수크로스로부터의 이소말툴로스 형성비율은 종래기술의 그것보다 더 낮기 때문에, 반응 혼합물로부터의 이소말툴로스 결정화를 피할 수 있다. 그러므로, 미생물에 의한 오염을 막고 증발공정 시의 경비를 절감하기 위한 목적으로 반응기에 보다 높은 농도의 수크로스를 적용할 수 있다.

다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1

[효소생산]

이 실시예에 사용된 배지는 1리터당 수크로스 100g, 펩톤 10g, 고기 추출물 3g, 효모 추출물 5g, 인산수소이나트륨 도데카이드레이트 2g 및 염화나트륨 3g을 함유하며, 1N 수산화나트륨으로 pH를 6.5 내지 7.0으로 조정한 것이었다. 모든 멸균처리는 120℃에서 20분간 오토클라브를 이용하여 가압멸균하는 것으로 수행하였다.

한 루프 가득한 슈도모나스 베소아시도필라 MX-45의 사면 배양체를 500ml들이 와동 플라스크내의 100ml배지에 옮겨서, 140rpm에서 왕복운동을 하는 쉐이커상에서 28℃, 24시간 동안 정치시켰다. 다음 배양물을 5리터들이 쟈아 발효기(jar fermenter)내의 멸균 배지 3리터에 접종시켰다. 1/4vvm 통기시키면서430rpm으로 기계교반시켜 28℃에서 60시간동안 배양시켰다. 배양중에, 배양체를 약 6.5pH로 자동조절시키고 온도는 28℃로 맞추었다.

이렇게 얻어진 배양 브로쓰는 글루코실트랜스퍼라제 활성이 30U/ml(여기서 1유니트(U)는 20℃, pH 5.5 물중의 20%(w/v) 수크로스 용액중 수크로스를 초기 변환속도 1μmole/분으로 촉매하는 효소량으로 정의한다)였다.

[효소 고정화]

배양 브로쓰를 50℃로 냉각하고 800G에서 5분간 원심분리시켰다. 상등액을 페기하고 침전물을 회수하였다. 후자를 용량비 1 : 1로하여 4%(w/v) 알긴산나트륨 용액과 혼합하였다. 혼합물을 0.5-mm 구경 노즐이 달린 적하장치에 넣어, 0.25M 염화칼슘 교반용액에 방울 형태로 적가하여 구형 펠렛으로 응고시켰다. 가끔씩 교반해 주면서 2시간 숙성시킨후, 펠렛화 효소를 필터 스크린상에 수집하여 물로 잘 세척하였다.

다음 펠렛화 효소를 염산으로 미리 pH 5.5로 조정한 동량의 2%(w/v) 폴리에틸렌이민(PEI) 용액에 5분간 침지시켰다. 침지된 펠렛을 필터 스크린상의 용액으로부터 회수하고 5℃에서 0.5%(w/v) 글루타르 알데히드(GA) 교반용액에 즉시 넣었다. 연속교반하면서 30분간 처리하는 동안, 세포성 글루코실트랜스퍼라제의 고정화가 완결되었다. 고정효소를 필터 스크린에 모으고 물로 잘 세척하였다. 고정화 효소 조제물의 수율은 습중량 기준으로 200g이었다.

다음 조제물의 몇 가지 특성을 시험하였다. 이 조제물의 글루코시트랜스퍼라제 활성은 약 70U/g인 것으로 측정되었다. 효소 조제물의 급속한 열불활성이 45℃이상에서 관찰되었는데 이 실험은 25 내지 50℃에 이르는 여러 온도에서, pH 5.5, 0.1M 초산칼슘 완충액 90ml 중에서 샘플 5g을 18시간까지 침지시킴으로써 수행하였다. 조제물은 pH 범위 5,0 내지 7.0에서는 매우 활성적이었다. 15 내지 30℃ 범위의 여러온도에서의 비교 반응실험을 통해 트레할룰로스의 생성은 온도가 저하됨에 따라 증가하는 반면, 모노사카라이드 방출 및 이소말툴로스의 생성은 온도가 증가함에 따라 증가하는 것도 밝혀졌다.

[트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조]

직경 15mm, 높이 30mm의 컬럼튜브에 MX-45로부터 유도된 고정효소 조제물 25g(습중량)을 충전시켰다. 15℃, 25℃ 및 30℃에서 8.5ml/시간의 유속으로 50%(w/w) 수크로스 용액을 컬럼에 통과시켰다. 유출액을 반응액이라 칭하였다. 각 온도에서 반응액의 당 조성을 다음 표에 나타내었다. :

액체를 여과하고 양이온 및 음이온-교환수지로 탈이온화시킨다음 감압증발시켜 트레할룰로스를 주성분으로서 함유하는 시럽을 얻었다. 이 트레할룰로스 시럽은 종래의 결정형 이소말툴로스 생산시 부수적 생성물로서 제조되는 이소말툴로스 시럽과 비교할 때 모노사카라이드는 더 적고, 트레할룰로스는 더 풍부하며 보다 투명하였다. 즉, 형성된 트레할로스대 이소말툴로스의 비율은 15℃에서 10.3 : 1, 25℃에서 5.0 : 1 그리고 30℃에서 4.4 : 1이었다.

실시예 2

[효소생산]

수크로스 100g, 펩톤 10g, 고기 추출물 1g, 인산수소이나트륨 2g 및 염화나트륨 3g의 혼합물에 물 1리터를 첨가하여 배지를 만든다음 수산화나트륨 용액을 첨가한 후 배지를 pH 6.5-7.0으로 조정하였다. 이 배지를 120℃, 오토클라브에서 20분간 살균처리하였다.

A. 라디오박터 MX-232의 한 루프가득한 사면 배양체를 500ml 용량의 와동 플라스크내의 배지 100ml 접종하고 140rpm에서 왕복운동하는 쉐이커에서 28℃, 24시간동안 정치시켰다. 다음 이 배양체를 5리터들이 쟈아-발효기내의 멸균 배지 3리터에 접종하였다. 1.4vvm으로 통기시키면서 460rpm에서 28℃, 48시간 동안 배양시켰다. 배양중에, 배양체의 온도를 28℃로 유지하고 얻어진 배양 브로쓰는 글루코실트랜스퍼라제 활성이 30U/ml였다.

[효소 고정화]

배양 브로쓰를 5℃로 냉각하고 9,000G에서 10분간 원심분리시켰다. 상등액을 페기하고 침전물을 회수하였다. 후자를 중량비 1 : 1로 하여 4%(w/w) 알긴산나트륨 용액과 혼합하였다. 혼합물을 0.5-mm 구경 노즐이 달린 적하장치에 넣어, 0.25M 염화칼슘 용액에 방울형태로 적가하여 구형겔을 얻었다. 2시간 숙성시킨후, 얻어진 펠렛화 효소를 물로 잘 세척하였다.

다음 펠렛화 효소를 염산으로 미리 pH 5.5로 조정한 용량의 2%(w/w) 폴리에틸렌이민(PEI) 용액에 5분간 침지시켰다. 그 직후, 펠렛을 필터 스크린상의 용액으로부터 회수하고 5℃에서 0.5% 글루타르 알데히드 교반용액에 넣었다. 연속 교반하면서 30분간 처리하는 동안, 고정효소 300g을 유사히게 제조하였다. 그의 활성은 70U/g이었다.

[트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조]

직경 15mm, 높이 300mm의 컬럼 튜브에 MX-232로부터 유도된 고정 효소 조제물을 충전시켰다. 15℃, 25℃ 및 30℃에서 8.5ml/시간의 유속으로 50%(w/w) 수크로스 용액을 컬럼에 통과시켰다. 각 온도에서의 반응액의 당 조성을 다음 표에 다타내었다 :

액체를 여과하고 양이온 및 음이온-교환수지로 탈이온화시킨 다음 증발시켜 트레알룰로스를 주성분으로서 함유하는 시럽을 얻었다. 이 트레할룰로스 시럽에서의 트레할룰로스대 이소말툴로스의 비율은 15℃에서 10.1 : 1, 25℃에서 5.5 : 1, 그리고 30℃에서 4.3 : 1이었다. 이 투명한 시럽은 모노사카라이드는 더 적고 트레할룰로스는 더 많았다.

본 발명에 따른 트레할룰로스 시럽은 당도가 수크로스의 약 50%이고 스테비아, 아스파탐, 알리탐, 아테술팜 K 또는 수크랄로스와 같은 천연 또는 합성 고감미료와 감미를 증대시킬 수 있다. 이와 동시에, 본 발명의 트레할룰로스 시럽은 고감미료의 특성을 개선할 수 있다.

(저치아부식성 식품의 제조)

1. 핫 케이크 제조

밀가루 200g

베이킹 파우더 6g

우유 180ml

계란 50g

트레할룰로스 시럽 80g

물 45ml

버터 10g

2. 딸기 우유 젤리 제조

딸기 100g

우유 200ml

트레할룰로스 시럽 80g

젤라틴 분말 7g

물 30ml

레몬 쥬스 5ml

3. 딸기를 함유하는 바바리안 크림 제조

젤라틴 분말 4g

물 6ml

우유 100ml

트레할룰로스 시럽 40g

난황 30g

딸기 퓨레 70g

생크림 40ml

4-1. 딸기 잼 제조

딸기 300g

액체 트레할룰로스 300g

레몬쥬스 1리터

4-2. 딸기 잼 제조

딸기 300g

액체 트레할룰로스 300g

아스파탐 5g

레몬쥬스 1리터

Claims (5)

10-35℃의 온도에서 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 아그로박테리움(Agrobacterium) 속에 속하는 미생물의 한가지 이상의 트레할루로스-생성 효소와 수크로스 용액을 접촉시킴으로써 수크로스를 중량비가 4 : 1 이상인 트레할룰로스 및 이소말툴로스와의 혼합물로 전환시키는 것으로 됨을 특징으로 하는 트레할룰로스 및 이소말툴로스의 제조방법.

제1항에 있어서, 수크로스를 트레할룰로스와 이소말툴로스로 전환시키는 활성을 갖는 미생물로부터 유도된 당-전환 효소를 고정시킨 것이 특징인 제조방법

제1항에 있어서, 슈도모나스 또는 아그로박테리움속에 속한 미생물이 슈도모나스 메소아시도필라 MX-45(Pseudomonas mesoaoidophila MX-45 : 수탁번호 FERM BP-3619) 또는 아그로박테리움 라디오박터 MX-232(Agrobacterium radiobacter MX-232 : 수탁번호 FERM BP-3620)인 것이 특징인 제조방법.

수크로스를 트래할룰로스 및 이소말툴로스로 전환시키는 활성을 갖는 슈도모나스 메소아시도필라 MX-45(수탁번호 FERM BP-3619)의 생물학적 순수 균주.

수크로스를 트레할룰로스 및 이소말툴로스로 전환시키는 활성을 갖는 아그로박테리움 라디오박터 MX-232(수탁번호 FERM BP-3620)의 생물학적 순수 균주.