JPH0646951B2 - 微生物によるパラチノース、トレハルロースの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はパラチノース（構造式 Glcα1-6 βFru）、ト
レハルロース（構造式 Glcα1-1 βFru）よりなる抗う
蝕性糖源の製造法に関する。

より詳しくは、微生物によるシュークロースからのパラ
チノース、トレハルロース及び両者の混合物の製造方法
に関する。

［従来の技術］ パラチノースは Glcα1-6 βFru からなる二糖類で抗う
蝕性を有する糖である。

また、トレハルロースは Glcα1-1 βFru からなる二糖
類で、これも抗う蝕性を期待できる糖である。

パラチノースは蜂蜜や甘しょ汁中に存在しているが、現
在、シュークロースの溶液にプロタミノバクター属菌起
源のα−グルコシルトランスフェラーゼを作用させてパ
ラチノースを合成する方法（ドイツ特許第1049800 号）
や、セラチア属菌起源のα−グルコシルトランスフェラ
ーゼを作用させてパラチノースを合成する方法（ドイツ
特許第2217628 号）、あるいはまたエルヴィニア属微生
物による合成法等（欧州特許第1099号）が報告されてい
る。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らはシュークロースを炭素源として微生物の検
索を行ったところ、クレブシエラ属の微生物がパラチノ
ースとトレハルロースを生成することを突き止め、本発
明をするに至った。

本発明は、シュークロースを主炭素源として含む培地に
クレブシエラ属に属する微生物を接種し、好気的に培養
して培養液中にパラチノースとトレハルロースとの混合
物を生成蓄積すること、および培養で得られたクレブシ
エラ属に属する微生物の菌体または菌体処理物をシュー
クロースを含む液に反応させてパラチノースとトレハル
ロースとの混合物を生成させること、並びにこれらの混
合物からパラチノース、トレハルロースを分離して得ら
れるようにしたその製造方法に係るものである。

本発明において用いる微生物はシュークロースからパラ
チノースおよびトレハルロースを生産する能力を有する
ものであり、クレブシエラ(Klebsiella)属に属する菌種
である。

その一例としてのクレブシエラ・オキシトカ〔Klebsiel
la oxytoca)S-61は上記の特性を有し、パラチノースお
よびトレハルロースを生産するものであって、本発明者
らにより東京都の土壌から発見された菌種であり、工業
技術院微生物工業技術研究所へ微工研菌寄第10633 号と
して寄託されている。

クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)S-61は
次ぎの菌学的諸性質を有する。

なお、以下に記載の菌学的諸性質は、長谷川武治著：
「微生物の分類と同定」(1975)に準拠し、また分類方法
は、「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」
（1984）に準拠して行った。

ａ形態 肉汁寒天培地の生育形態において観察を行った結果は次
ぎのとおりである。

1)細胞の形及び大きさ：0.6 〜 0.8μ×２〜６μの好気
性桿菌である。

2)細胞の多形性：なし 3)運動性の有無：なし 4)胞子の有無：なし 5)グラム染色性：陰性 6)抗酸性：なし ｂ各培地における生育状態 1)肉汁寒天平板培養：良好な生育をし、円形で表面隆起
はなだらか、表面はなめらか、不透明で色調は黄変色。

2)肉汁寒天斜面培養：良好な生育をし、表面はなめら
か、不透明で色調は黄白色。

3)肉汁液体培養：生育し、全体が混濁状態となる。

4)肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。

5)リトマス・ミルク：生育しない。

ｃ生理学的性質 1)硝酸塩の還元：陽性 2)脱窒反応：陰性 3)ＭＢテスト：陰性 4)ＶＰテスト：陽性 5)インドールの生成：陽性 6)硫化水素の生成：陰性 7)デンプンの加水分解：陰性 8)クエン酸の利用：陽性 9)無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩は陽性 10) 色素の生成：なし 11) ウレアーゼ：陽性 12) オキシダーゼ：陰性 13) カタラーゼ：陽性 14) 生育範囲：最適pH・・・７．０ 最適温度・・・37℃ 15) 酸素に対する態度：好気性 16) O-F テスト：好気的にも、嫌気的にも糖を分解して
酸を生成。

17) 糖類からの酸及びガスの生成 酸の生成 ガスの生成 １，L-アラビノース ＋ ＋ ２，D-キシロース − − ３，D-グルコース ＋ ＋ ４，D-マンノース − − ５，D-フラクトース − − ６，D-ガラクトース − − ７，麦芽糖 − − ８，ショ糖 ＋ ＋ ９，乳糖 ＋ ＋ 10，トレハロース − − 11，D-ソルビット ＋ ＋ 12，D-マンニット ＋ ＋ 13，イノシット ＋ ＋ 14，グリセリン − − 15，デンプン − − 但し、＋印は生成、−印は不生成。

以上の菌学的性質により本菌株はクレブシエラ・オキシ
トカ(Klebsiella oxytoca)に属するものと断定された。

培養法におけるパラチノース、トレハルロース生成に用
いる培地のシュークロースの濃度は５〜40％の範囲で使
用することができるが、好ましくは20〜40％が適当であ
る。培地にはその他微生物の増殖に必要な窒素化合物、
例えばペプトン、アミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム等のいずれを加えてもよく、さらに酵母エキ
スや燐酸塩等を加え使用する。

このように調整した培地に前培養しておいたクレブシエ
ラ・オキシトカを接種し、20〜37℃、好ましくは30℃の
温度で好気的条件下において１〜５日間、好ましくは２
〜３日間振とう培養するとパラチノース、トレハルロー
スが培地中に蓄積する。

このようにして得られたパラチノース、トレハルロース
を含有する培養液は、高速液体クロマトグラフィーで示
す第１図のように、生成物であるパラチノース、トレハ
ルロースのみであり、原料であるシュークロースやグル
コース、フラクトースその他のオリゴ糖は見られない。

また、パラチノース、トレハルロースの生成比は８：２
から６：４と培養条件を変えることによって変えられ
る。

また、培養によって得られたクレブシエラ・オキシトカ
の菌体および菌体処理物によるパラチノース、トレハル
ロースの生成は、シュークロースの濃度が１〜70％とか
なり広い範囲で使用することができるが、好ましくは50
％程度が適当である。

反応に使用する菌体はグルコースやシュークロースまた
は他の単糖類、二糖類を炭素源とし、それに微生物の増
殖に必要な窒素化合物（ペプトン、アミノ酸、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム等）や、ミネラルを含む培
地で増殖させた菌体を使用する。

また、得られた菌体および菌体抽出物をアルギン酸カル
シウムやカラギナンなど通常の方法で固定化した菌体処
理物を使用してもよい。

培養液または菌体反応液を遠心分離やケイ藻土濾過など
の手段によって菌体を除去し、得られた上澄み液または
濾液を脱塩、濃縮することによりパラチノースとトレハ
ルロース混合物シロップを得ることができる。

また、結晶化操作によりパラチノースだけを結晶化させ
て容易に分離することも可能である。

パラチノースとトレハルロースとの混合物シロップや晶
析後の蜜からカラムクロマトグラフィーなど公知の分画
手段を適宜利用してトレハルロースやパラチノースのみ
を精製することができる。

かくして得られたパラチノース、トレハルロースはα−
グルコシダーゼによりグルコースとフラクトースに加水
分解されること、インベルターゼにより加水分解されな
いこと、またNMR 分析等、種々の分析結果からパラチノ
ース、トレハルロースと断定した。

本発明において使用されるクレブシエラ属としてはクレ
ブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca )が挙げら
れる。

なお、クレブシエラ属の微生物のパラチノース、トレハ
ルロース生産能については未だ知られていなかった。

［実施例１］ シュークロース 30.0％ 硫酸アンモニウム 0.2％ 酵母エキス 0.02 ％ KH₂PO₄ 0.2％ Na₂HPO₄・12H₂O 0.8％ MgSO₄・7H₂O 0.05 ％ pH ７．０ 上記組成の培地100ml を500ml 容三角フラスコにとり、
別に前培養しておいたクレブシエラ・オキシトカS-61(K
lebsiella oxytoca S-61；微工研菌寄第10633 号）の培
養液１mlを接種し、30℃で２日間ロータリシェーカーで
振とう培養(160rpm)を行った後、培養液を遠心分離機に
て遠心分離し(10000rpm)、菌体と上澄液とに分けた。

高速液体クロマトグラフィーにより上澄液中のパラチノ
ース、トレハルロースを測定したところ、それぞれ19.0
g 、７．５ｇが検出された（第１図）。

高速液体クロマトグラフィーの条件は以下に示すとおり
である。

ポンプ：日立製作所製 655 形 カラム：Cica-MERCK製 リクロゾルブNH_２（５μ） 検出器：昭和電工製 SE-51 形 示差屈折計 溶離液：アセトニトリル：水＝70：30 流 速：１．０ml/min ［実施例２］ 実施例１の上澄液100ml から分取用高速液体クロマトグ
ラフィーにより保持時間の小さい方のメインピーク（パ
ラチノース画分）を分取し、その後濃縮、凍結乾窓を行
って純度98％のパラチノース粉末17g を得た。

分取用高速液体クロマトグラフィーの条件は以下に示す
とおりである。

ポンプ：実施例１のプンプと同じ カラム：山村化学研究所製 YMC-Pack PA-43(20 ×250m
m) 検出器：実施例１の検出器と同じ 溶離液：アセトニトリル：水＝75：25 流 速：５．０ml/min ［実施例３］ 実施例１の上澄液100ml から分取用高速液体クロマトグ
ラフィーにより保持時間の大きいピーク（トレハルロー
ス画分）も実施例２と同じ条件で分取し、その後濃縮、
凍結乾燥を行い純度96％のトレハルロース粉末５．５ｇ
を得た。

［実施例４］ 実施例１の上澄液100ml をイオン交換樹脂カラム（アン
バーライトIRA-411 、200）へ通して脱塩し、減圧濃縮
して固形分50％のシロップ52g を得た。

［実施例５］ 実施例１で用いた培地100ml を500ml 容三角フラスコに
とり、別に前培養しておいたクレブシエラ・オキシトカ
S-61(Klebsiella oxytoca S-61；微工研菌寄第10633
号）の培養液1ml を接種し、30℃で２日間ロータリシェ
ーカーで振とう培養(160rpm)を行った。

培養終了後遠心分離機にて遠心分離し(15000rpm)、菌体
を回収した。回収した菌体を蒸留水50mlで２回洗浄し、
蒸留水50mlに懸濁した。この菌体懸濁液にシュークロー
ス50g と1/15M 燐酸衝撃液(pH７．０)50ml を加え、30
℃で20時間反応を実施した。

反応終了液中を高速液体クロマトグラフィーで測定した
ところパラチノース、トレハルロースそれぞれ31.0g 、
10.5g が検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は生成混合物中の成分の高速液体クロマトグラフ
ィーによる検出値を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シュークロースを主要原料とする培地で、
   クレブシエラ(Klebsiella)属を好気条件下で培養してパ
   ラチノース、トレハルロースを生成蓄積させ、この生成
   物を採取することを特徴とする微生物によるパラチノー
   スとトレハルロースとの混合物製造方法。
2. 【請求項２】シュークロースを含む液に、培養によって
   得られたクレブシエラ(Klebsiella)属の菌体および菌体
   処理物を反応させてパラチノース、トレハルロースを生
   成し、この生成物を採取することを特徴とする微生物に
   よるパラチノースとトレハルロースとの混合物製造方
   法。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項及び第２項の方法に
   より製造されたパラチノースとトレハルロースの混合物
   からパラチノースおよびトレハルロースをそれぞれ分離
   して採取することを特徴とするパラチノース並びにトレ
   ハルロースの製造方法。
4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項、第２項に記載の微
   生物がクレブシエラ・オキシトカS-61(Klebsiella oxyt
   oca S-61) であるパラチノースとトレハルロースとの混
   合物製造方法。