JP4989947B2 - パラチノース、トレハルロースまたはその混合物の製造方法 - Google Patents
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Description
500mlの坂ロフラスコに表4に示す液体培地3を100ml投入し、オートクレープで120℃、20分間滅菌処理を行った。クレブシエラ ニューモニアSP18−97−4株を1白金耳植菌し、30℃、140rpmにて15時間、レシプロ型シェーカーにて振とう培養(前培養)した。
得られた前培養液を同一の液体培地が1.5L入った2Lのジャーファンメーターに1%植菌し、30℃、500rpm、1vvmで12時間本培養して、本培養液を得た。
上記で得られた培養液1mlと25%ショ糖液4mlを混合攪拌した後、30℃の恒温槽で1時間パラチノースの生産反応を行った。煮沸することによって反応を終了し、遠心機で反応波中の菌体画分の除去を行った。
得られた上清中のパラチノースおよびトレハルロースの生成量をソモギ・ネルソン法で還元力を測定し、これをパラチノース量に換算して1分あたりに生成される還元糖量(μmol/ml)を酵素活性とした。
又、薬剤処理法に用いられる薬剤は特に限定的ではないが、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどが用いられる。
変異誘導した菌株より、上記と同様のスクリーニング方法にて、容易にパラチノースおよびトレハルロース生産能の高いものを選択、確認することができる。選択にあたっては、増殖が早いものであって、さらにパラチノースの製造を目的とする場合にはTLCにてパラチノースのスポットが濃く、トレハルロースのスポットが薄いものを選ぶとよい。
かかるクレブシエラ ニューモニアに属する微生物としては、上記のごとき適当なスクリーニングによって選択されたものであっても、スクリーニングによって選択されたものへ突然変異を誘発して得られるものであってもいずれも好適に用いられる。
選択した菌株を適当な細胞培養用培地で培養する。用いられる培地は炭素源として1〜30%のショ糖、マルトース、フルクトース、グルコース、パラチノース、トレハルロース等の単糖又は二糖を含有しているものが好ましい。その中でもショ糖、パラチノース又はフルクトースを用いると培養液当たりのグルコシルトランスフェラーゼ活性が高くなり、特に好ましい。
本発明のクレブシエラ ニューモニアに属する微生物の産生するグルコシルトランスフェラーゼは、従来公知のものと比して高いパラチノース及びトレハルロースヘの転換効率を示し、効率良く目的とする混合物を得ることができる。
実施例1
本発明のクレブシエラ ニューモニアSP18−97−4株のグルコシルトランスフェラーゼ活性を測定した。比較例として既知のパラチノース、トレハルロース生産能を有する菌株の酵素活性値を示した。
前培養:
ショ糖10g/100ml、C.S.L(コーススティープリカー)5g/100ml、NaCl 1g/100ml、Na2HPO4 0.15g/100ml、MgSO4・7H2O 0.1g/100mlを含有する水溶液をNaOHでpH7に調整した。0.5L容の坂ロフラスコヘ培地30mlを投入し、オートクレープで120℃、20分間滅菌処理を行った。滅菌した培地ヘクレブシエラ ニューモニアSP18−97−4株を1白金耳植菌し、30℃、140rpm、15時間レシプロ型シェーカーにて振とう培養した。
得られた前培養液15mlを上記と同一の液体培地が1.5L入った2Lジャーファーメンター中(滅菌済み)に植菌し、30℃、500rpm、1vvmで24時間培養して、菌体懸濁液を調製した。
上記で本培養により得られた菌体懸濁液1mlと25%ショ糖溶液4mlを混合し、30℃で1時間反応後、熱湯に入れ酵素反応を止めた。反応液中のパラチノース及びトレハルロースの量をソモギ・ネルソン法によって測定し、グルコシルトランスフェラーゼ活性を算出した。なお、パラチノース及びトレハルロースの量は、還元糖とした場合の量として算出した。
培養液のグルコシルトランスフェラーゼ活性は83UNIT/mlであった。なお、ここでグルコシルトランスフェラーゼ活性の1UNITは、pH6.0の20%ショ糖溶液中で、30℃、60分間変換反応させたときに、還元糖量として換算したパラチノース及びトレハルロースの合計量を1分間に1μmol増加させる酵素活性をいう。
本発明のクレブシエラ ニューモニアSP18−97−4株は、既知のパラチノース、トレハルロース生産能を有する菌株に比べ、その酵素生産性において2倍以上の高い活性を示した。既知のパラチノース、トレハルロース生産能を有する菌株との酵素活性値の比較を表6に示す。尚、表中、比較例の酵素活性値は、各菌株が記載されている文献中の測定値を用いた。
実施例1で24時間本培養をした後の菌体懸濁液を遠心分離器(15000×g、20分間)により集菌し、50mM(mol/l)りん酸Na緩衝液pH6中へ懸濁した。50mM(mol/l)りん酸緩衝液pH5.5に50%(w/w)のショ糖を溶解し、40℃に保ちながら4UNIT/g・ショ糖となるように、菌体懸濁液を添加し、ゆっくりと攪拌しながら26時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離器により菌体を除き、上清液を高速液体クロマトグラフィーで成分分析を行ったところ全糖分に占めるショ糖、パラチノース、トレハルロース、単糖の比率は、それぞれ、2%、82.5%、11.0%、4.5%であった。
実施例1で24時間の本培養をした後の菌体懸濁液1Lを遠心分離器(15000×g、20分間)により集菌し、50mM(mol/l)りん酸Na緩衝液pH6(250ml)中へ懸濁した。得られた懸濁液をフレンチプレス(1500bar)にかけ、菌体破砕液を得た。20〜60%の硫安塩析を行い、遠沈後の沈殿を50mM(mol/l)りん酸緩衝液pH6.0で懸濁した。これを粗酵素液として用い、ショ糖からパラチノース及びトレハルロースの混合物への変換反応を行った。即ち、50mM(mol/l)りん酸緩衝液pH5.5に50%(w/w)のショ糖を溶解し、40℃に保温した。そこへ、4UNIT/g・ショ糖になるように、粗酵素液を添加し、ゆっくりと攪拌しながら29時間反応を行った。反応後液を高速液体クロマトグラフィーで成分分析を行ったところ、全糖量中のショ糖、パラチノース、トレハルロース、単糖の比率はそれぞれ、2%、82.5%、11.0%、4.5%であった。
実施例1で24時間の本培養した後の菌体懸濁液340mlを遠心分離器(15000×g、20分)により集菌し、50mM(mol/l)りん酸Na緩衝液pH6(23ml)中に懸濁した。この懸濁液23mlと4%アルギン酸Na(23ml)を混合した液を注射器様の容器に入れ、3%塩化カルシウム溶液中に滴下し、ビーズ状菌体20.0gを得た。このビーズ状菌体20.0gに、2%ポリエチレンイミン20.0gを添加、10分間浸漬させた。濾過によりビーズ状菌体を回収し、0.5%グルタルアルデヒド67mlを添加して、25℃にて30分間保持した。その後、濾過、水洗し、固定化酵素20.0g(85U/g)を得た。
Claims (9)
- ショ糖をパラチノースおよびトレハルロースヘ変換する能力を有し、菌学的方法によって同定されるクレブシエラ ニューモニア(Klebsiella pneumoniae)。
- クレブシエラ ニューモニア(Klebsiella pneumoniae)SP18−97−4株(受託番号NITE BP−258)またはショ糖をパラチノースおよびトレハルロースへ変換する能力を有するその変異株。
- 請求項1または2記載のクレブシエラ ニューモニアをショ糖を含有する培地で培養してパラチノースおよびトレハルロースの混合物を得る工程を含む、パラチノース、トレハルロースまたはその混合物の製造方法。
- クレブシエラ ニューモニアが固定化されたものである、請求項3記載の方法。
- 請求項1または2記載のクレブシエラ ニューモニア培養物より得られるグルコシルトランスフェラーゼヘショ糖溶液を作用させてパラチノースおよびトレハルロースの混合物を得る工程を含む、パラチノース、トレハルロースまたはその混合物の製造方法。
- グルコシルトランスフェラーゼが固定化されたものである、請求項5記載の方法。
- 請求項3〜6いずれかの方法によりパラチノースおよびトレハルロースの混合物を得る工程; および
得られたパラチノースとトレハルロースの混合物から、パラチノースを分離する工程
を含むことを特徴とする、パラチノースの製造方法。 - 請求項3〜6いずれかの方法によりパラチノースおよびトレハルロースの混合物を得る工程; および
得られたパラチノースとトレハルロースの混合物から、トレハルロースを分離する工程
を含むことを特徴とする、トレハルロースの製造方法。 - 請求項3〜8いずれかの方法によりパラチノース、トレハルロースまたはその混合物を得る工程; および
得られたパラチノース、トレハルロースまたはその混合物に水素添加する工程
を含むことを特徴とする、還元パラチノース、還元トレハルロースまたはその混合物の製造方法。
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