JP2006223268A - ガラクトシル２糖類の製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】有用な食品素材や医薬品原料として期待される希少なガラクトシル２糖類を、効率よく簡便に製造する方法を提供すること。
【解決手段】ラクトースと任意の単糖類を含む基質に、β−ガラクトシダーゼ活性が湿菌体重量１ｇあたり１Ｕ以上である酵母および／または該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とするガラクトシル２糖類の製造法。

Description

本発明は、希少な２糖類であるガラクトシル２糖類の製造法に関し、更に詳細には、食品あるいは医薬品等の分野で有用な、非還元末端にガラクトースをもつガラクトシル２糖類の製造法に関する。

非還元末端にガラクトースをもつガラクトシル２糖類は、医薬品原料としての利用あるいは機能性を持った食品素材としての利用が期待される有用な物質である。事実、フラクトースにガラクトースが結合した構造を持つラクチュロースは、ビフィズス菌等の有用な腸内細菌を増殖させて整腸効果を示すことが知られている。しかしながら、ラクトース、ラクチュロースを除いたガラクトシル２糖類については安価な製造法が確立されていないため、市販されていないか、市販されていても極めて高価であるのが現状である。

ガラクトシル２糖類の製造法については、ラクトースとガラクトシル化される単糖類とを含む培地でスポロボロミセス・シンギュラリスを培養し、ガラクトシル２糖を生成する方法が知られている（非特許文献１）。この文献には具体的な菌株名が記載されていないが、この文献中の引用文献がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection(ATCC)）のデータベース中の引用文献（非特許文献２）と一致するため、この文献では基準株であるスポロボロミセス・シンギュラリス（ATCC 24193）を用いていることが明らかになっている。

しかしながら、この方法では酵母であるスポロボロミセス・シンギュラリスのβ−ガラクトシダーゼの発現量が少ないためラクトースに対するガラクトシル２糖類の収率が低く、また、副生成物である３糖以上のオリゴ糖も多いという問題がある。また、本製法では該酵母の生育が遅く、ガラクトシル２糖の製造に一週間程度要する等生産性の面でも問題があり、工業的な利用は困難であった。

また、非還元末端にガラクトースを含むヘテロ２糖類の製造法も知られており（特許文献１）、これはリン酸糖と単糖を原料とし、これらをセロビオースホスホリラーゼの存在下で反応させることによってヘテロ２糖の製造を行うものである。しかしながら、原料となるリン酸糖が高価であり、また、当該リン酸糖の濃度が１ｍＭと低濃度であるため大量生産には不向きであるという問題があった。

さらに、α−ガラクトシル基を含む非還元性２糖の製造法も知られている（特許文献２）。これはガラクトースまたはガラクトースを含む物質にα−ガラクトシダーゼを作用させてα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成させ、当該オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作を行い、α−ガラクトシル基を含む非還元性２糖を製造する方法である。しかしながら、この方法では還元性２糖を製造することはできないし、また、この方法は目的物以外の成分が多く単離操作が煩雑であり収量も低いという問題があった。

その他、酵母やβ−ガラクトシダーゼを用いた転移２糖の製造法が開示されているが（特許文献３、４）、いずれの方法についても、生成する転移２糖の収率が低く、また、二段階の酵素反応を要する等で操作が煩雑という問題があり、工業レベルで実用化するには適さなかった。

特開平９−２２４６９２号公報 特開２００３−１６０５９４号公報 特開平６−２５３８７８号公報 特開２００１−２９２７９１号公報 Can. J. Chem., vol.42, 2307−2317(1964) J. Microbiol.Serol., vol.28, 193−207 (1962)

従って、本発明は有用な食品素材や医薬品原料として期待されるガラクトシル２糖類を効率よく簡便に製造する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、β−ガラクトシダーゼ活性が特定の値以上である酵母および／または該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼを利用することによりガラクトシル２糖類が効率よく得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の内容のものである。

［１］ラクトースとガラクトシル化される単糖類とを含む基質に、β−ガラクトシダーゼ
活性が湿菌体重量１ｇあたり１Ｕ以上である酵母および／または該酵母由来のβ−ガラ
クトシダーゼを作用させることを特徴とするガラクトシル２糖類の製造法。
［２］グルコース抑制を解除された酵母を用いる前記［１］の製造法。
［３］単糖類が、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、アラビノース、ラ
ムノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−メチルマンノシド、α−メチルガラクトシ
ド、α−メチルグルコシド、２−デオキシグルコース、２−デオキシガラクトースの中
から選ばれたものである上記［１］または［２］の製造法。
［４］基質中の単糖類のラクトースに対する重量比が１以上である上記［１］〜［３］の
いずれか１の製造法。
［５］酵母がスポロボロミセス属に属する酵母である上記［１］〜［４］のいずれか１の
製造法。
［６］スポロボロミセス属に属する酵母がスポロボロミセス・シンギュラリスである前記
［５］の製造法。
［７］スポロボロミセス属に属する酵母がスポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ−
＃４Ｄ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１８）、スポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ
−＃５Ａ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１９）またはスポロボロミセス・シンギュラリス
ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７）である前記［５］の製造法。
［８］スポロボロミセス属に属する酵母がスポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ−
＃＃２Ｂ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７）である前記［５］の製造法。

本発明の製造法により、安価な原料であるラクトースと単糖類から、食品素材や医薬品原料、試薬として有用なガラクトシル２糖類を効率よく簡便に製造することができる。

従って、本発明の製造法は、食品分野や医薬分野における原料生産のために有利に利用することができるものである。

本明細書中において「β−ガラクトシダーゼ」とは、ラクトースや２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等のβ−ガラクトシドを加水分解する反応を触媒する酵素を指し、そのような作用を示す酵素であれば特に限定されるものではない。例えば、分類上「β−グルコシダーゼ」とされている酵素の中にはβ−ガラクトシドを加水分解する作用を備えているものがあることが知られており、本発明においてはこれらの酵素も「β−ガラクトシダーゼ」の範疇に含まれる。

また、本明細書中で「湿菌体」とは、酵母の培養液あるいは洗浄菌体を遠心分離(６,６００ｇ、２０分)に供し、デカンテーションまたはアスピレーターにより上清を取り除き菌体の沈殿をペレット状にしたものを示す。また、「湿菌体重量」とは、前記のようにして得られた菌体を一定量取り、重量をそのまま秤量した値もしくは、遠心分離前に使用する遠心チューブのみの重量を予め測定しておき(遠心前チューブ重量)、遠心分離終了後に上清を取り除き湿菌体のみ付着した状態の遠心チューブの重量を測定し(遠心後チューブ重量)、下記式にて算出した値を示す。

更に、「１Ｕ」とは、β−ガラクトシダーゼの酵素活性１単位（Ｕ）のことであり、下記の測定において１分間に１マイクロモルの２−ニトロフェノールを遊離するβ−ガラクトシダーゼ量をいう。具体的な測定は次のようにして行われる。まず、適当量の酵母あるいは酵母由来のβ−ガラクトシダーゼをｐＨ４.０〜７.０の緩衝液に懸濁・希釈する。一方、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを同ｐＨの緩衝液に溶解して１２.５ｍＭの溶液を調製する。この溶液の０.８ｍＬに酵母懸濁液あるいはβ−ガラクトシダーゼ溶液０.２ｍＬを添加・混合し、２０〜４０℃で正確に５〜３０分間反応させた後、０.２５Ｍの炭酸ナトリウム溶液を４ｍＬ加えて反応停止・発色を行う。試薬ブランクとしては２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド溶液に緩衝液あるいは精製水を加えたものを用いる。また、反応初発液としては予め炭酸ナトリウム溶液を添加しておき、酵母懸濁液あるいはβ−ガラクトシダーゼ溶液を添加・混合すると同時に反応停止・発色を行うものを用いる。これら各液を遠心分離（２,０００〜１２,０００ｇ、５〜３０分）し、上清中に含まれる遊離した２−ニトロフェノールの４２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定する。

本発明のガラクトシル２糖類の製造法（以下、「本発明製造法」という）は、ラクトースとガラクトシル化すべき任意の単糖類とを含む基質に、β−ガラクトシダーゼ活性が湿菌体重量１ｇあたり１Ｕ以上である酵母および／または該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させるものである。

上記製造法で用いる酵母としてはβ−ガラクトシダーゼ活性が湿菌体重量１ｇあたり１Ｕ以上であれば、その種類は特に限定されない。また、β−ガラクトシダーゼ活性が湿菌体重量１ｇあたり２Ｕ以上であれば特に本発明製造法に適している。

このような酵母は、前記した酵素活性測定法によりβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、その活性が上記値以上のものを自然界から、あるいはＡＴＣＣ、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（JCM）、独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)の生物遺伝資源部門等で保管されているものから入手することができる。

上記のような酵母としては、例えば、ブレラ属、クリベロマイセス属、リポミセス属、キャンディダ属、クリプトコッカス属、ステリグマトミセス属、スポロボロミセス属、ベンシントニア属、バリストスポロミセス属、フェロミセス属、フィブロバシディウム属、シロバシディウム属、ティレショプシス属、イターソニリア属、ティレシア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンセヌラ属、ロドトルラ属、デバリョミセス属、ピキア属、トルロプシス属等の酵母が挙げられる。これらの中でもスポロボロミセス属の酵母が好ましい。

上記スポロボロミセス属の酵母としては、スポロボロミセス・シンギュラリス(Sporobolomyces singularis)（旧分類ではブレラ・シンギュラリス（Bullera singularis）、スポロボロミセス・ツガエ(Sporobolomyces tsugae)、スポロボロミセス・サルモニカラー(Sporobolomyces salmonicolor)、スポロボロミセス・ロゼウス(Sporobolomyces roseus)等が挙げられるが、特にスポロボロミセス・シンギュラリスは、ガラクトシル２糖の製造に必要となるガラクトース転移反応活性が高いことから好ましい。

上記した酵母は、特にグルコース抑制を解除した酵母であることが好ましい。グルコース抑制を解除した酵母はβ−ガラクトシダーゼ活性の発現が安定して高いため本発明製造法に好適に用いることができる。

ここで、グルコース抑制（グルコース効果ともいう）とは、一般的に微生物はグルコースを炭素源とした場合に最良の増殖を示し、酵素等の生産性も高くなるが、培地中にグルコースが存在することにより、β−ガラクトシダーゼ等の誘導酵素の発現が抑えられ、その生産性が著しく低下してしまうことをいう。グルコース抑制の解除とは、このようなグルコース抑制を受ける酵素を有する微生物に、突然変異処理等の手段を施して、グルコース抑制に関連する遺伝子へ変異を導入したり、欠損や当該遺伝子の発現の低下等を引き起こすことで、グルコース存在下でも当該酵素が高発現するという性質を獲得させることである。

酵母のグルコース抑制を解除する具体的な方法としては、突然変異処理、グルコース抑制に関連する遺伝子の相同組換えによる人工的な変異導入あるいは遺伝子欠損(ノックアウト)、ＲＮＡｉ技術を利用したグルコース抑制に関連する遺伝子の発現抑制(ノックダウン)等の一般に利用される生化学的、分子生物学的な手法を用いることができる。突然変異処理は特に限定されず、紫外線照射、ガンマ線照射などの物理的処理や、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸等による化学的処理が挙げられる。使用する手法としては突然変異処理が好ましく、特にニトロソグアニジンによる化学的処理が好ましい。ニトロソグアニジンによる処理方法としては特開２００３−３２５１６６号公報に記載された方法が挙げられる。

上記のような方法でグルコース抑制を解除され、β−ガラクトシダーゼ活性の発現が安定して高い酵母としては、本出願人らが先に見出したスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯４Ｄ４、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯５Ａ５、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６が挙げられ、特に、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６を好適に用いることができる。これらスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯４Ｄ４、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯５Ａ５、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６は、本出願人が既に２００２年４月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305−8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８８１８、ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１９およびＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７として寄託している。

本発明製造法において用いる、酵母あるいは当該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼの形態は、特に制限はない。具体的には、培養液をそのまま用いる方法、培養液を遠心分離や膜処理等により濃縮して菌体濃縮液あるいはペレットとして使用する方法、静止菌体として使用する方法、乾燥菌体として使用する方法、菌体破砕物として使用する方法、粗酵素溶液として使用する方法、精製酵素溶液として使用する方法、酵素粉末として使用する方法等が挙げられる。

酵母培養液を得るための培養は、固体培養または液体培養により行われる。これらの培養で用いられるいずれの培地もその成分に特に制限はなく、例えば窒素源として酵母エキス、肉エキス、ポリペプトン、カザミノ酸、トリプチケース、コーンスティープリカー、大豆加水分解物、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられ、特に増殖性の面から酵母エキスが好ましい。また、炭素源としてはグルコース、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、デキストリン、ガラクトース、ラクトース、アミロース、アミロペクチン、ラフィノース等が挙げられ、中でもグルコースおよびラクトースが好ましい。更に、無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のカリウム塩、リン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、塩化ナトリウム等のナトリウム塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩等が挙げられ、特にリン酸１カリウムおよび硫酸マグネシウムが好ましい。またいずれの成分も単独で、もしくは２種以上を組み合わせて使用できる。

上記培養における培養条件に特に制約はなく、固体培養の場合は静置培養で行い、培地のｐＨを３〜８、好ましくは５〜７に調整したものに酵母を接種し、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃で１〜１４日間培養を行う。液体培養の場合は振とう培養もしくは通気撹拌培養等の好気的条件下で行い、培地のｐＨを４〜１０、好ましくは５〜７に調整したものに酵母を接種し、１０〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃で１〜１４日間培養を行う。振とう培養の場合、その速度は５０〜２００ｒｐｍが好ましく、特に１２０〜１５０ｒｐｍが好ましい。通気撹拌培養の場合、撹拌速度は５０〜５００ｒｐｍが好ましく、特に２００〜４００ｒｐｍが好ましい。通気量は０.５〜２.０ｖｖｍが好ましく、特に１.０〜１.５ｖｖｍが好ましい。

前記した静止菌体とは、培養した微生物から遠心分離等の操作により培地成分を取り除き、水や生理食塩水等の希薄塩溶液、あるいは緩衝液で洗浄し、洗浄液と同一の液に懸濁した状態をいう。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられ、特にクエン酸−リン酸緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは３〜８、好ましくは４〜７に調整したものが好ましく、緩衝液の濃度は１〜２００ｍＭ、特に５〜５０ｍＭが好ましい。菌体は生菌体のままでもよいし、有機溶剤処理、凍結乾燥処理を行ったものでもよい。

また、本発明製造法に酵母由来のβ−ガラクトシダーゼを使用する場合、この酵素の精製条件、精製度に特に制約はなく、一般的な精製手法を用いることができる。上記培養条件にて酵母を培養した後、遠心分離、有機膜、無機膜等の分離手段で菌体を分離し、培養上清中に当該酵素が含まれる場合にはこれを回収し、粗酵素溶液とすることができる。また菌体内にβ−ガラクトシダーゼが含まれる場合は、菌体をホモジナイザーや超音波処理により物理的に破砕する、もしくは細胞壁溶解酵素等を用いて酵素的に処理することにより、菌体内抽出液を得、粗酵素溶液とすることができる。これらの粗酵素溶液を硫安塩析処理、透析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製度の高い精製酵素溶液としてもよい。

上記のようにして得られる酵母や該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼは、一般的な固定化の手法を用いて固定化したものを用いてもよい。固定化の手法としては、担体結合法、架橋法、包括法等が挙げられるが、これに制限されるものではない。担体結合法としては共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、架橋法してはグルタルアルデヒド法、包括法としては格子型包括法とマイクロカプセル型包括法が例として挙げられる。より具体的には、活性炭、おがくず等へ吸着させる方法、ＣＭ−セルロース、Ｐ−セルロース、ＤＥＡＥセルロース、ＥＣＴＥＯＬＡ−セルロース等へ結合させる方法、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアナート等により架橋する方法、アクリルアミド、κカラギーナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等により包括させる方法が挙げられる。また、固定化した酵母あるいは酵素をバッチ式、カラム式等の一般的に利用される方法で使用することができ、これらは単回、繰り返し、あるいは連続使用することができる。

これら酵母や該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼの使用量はβ−ガラクトシダーゼ活性として０.０１〜１０Ｕ／ｍＬが好ましく、０.０５〜５Ｕ／ｍＬがより好ましい。

本発明製造法において、上記酵母やβ−ガラクトシダーゼを作用させるラクトース及び単糖類のうち、単糖類としては、特に制約はないが、一例として、ガラクトース、マンノース、アラビノース、フコース、リボース、キシロース、アラビノース、ラムノース、デオキシリボース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、デオキシグルコース、デオキシガラクトース、メチルガラクトシド、メチルグルコシド、メチルマンノシド等が挙げられる。この中でも、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、アラビノース、ラムノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−メチルマンノシド、α−メチルガラクトシド、α−メチルグルコシド、２−デオキシグルコース、２−デオキシガラクトースが好適に用いられ、特にガラクトース、マンノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−メチルガラクトシド、α−メチルグルコシドが好ましい。目的とするガラクトシル２糖を得るためには、当該ガラクトシル２糖においてガラクトースの対となる構造の単糖類を、ガラクトシル化すべき単糖として選択すればよい。また、単糖類を２種類以上組み合わせて、２種類以上のガラクトシル２糖の混合物を得ることもできる。

これらラクトース及び単糖類の使用量は特に制限されないが、いずれも０.１〜５００ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましく、特に１０〜４００ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましい。糖質の総量としては０.５〜８００ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましく、特に５０〜６００ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましい。単糖類／ラクトースの重量比は１以上が好ましい。

本発明製造法において、酵母やβ−ガラクトシダーゼを作用させる条件としては、温度は１０〜７０℃が好ましく、特に３０〜６０℃の範囲が好ましい。ｐＨは２〜１０が好ましく、特に３〜７の範囲が好ましい。作用させる時間は１時間〜１４日間が好ましく、特に１時間〜４８時間の範囲が好ましい。反応液の溶媒として、水や希薄塩溶液もしくは一般的な緩衝液を用いることができる。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられ、特にクエン酸−リン酸緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨは２〜１０が好ましく、特に３〜７の範囲が好ましい。緩衝液の濃度は１〜２００ｍＭが好ましく、特に５〜５０ｍＭが好ましい。

上記の製造法で得られるガラクトシル２糖類は、一般的な精製手法を用いて分離精製してもよい。精製方法に特に制限は無いが、具体的にはイオン交換、ゲルろ過、活性炭、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーにかけることにより精製できる。

以下、実施例、製造例および参考例によって本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何ら制約されるものではない。

製 造 例 １
酵母懸濁液の製造：
５０ｇ／Ｌのラクトース、６ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／Ｌのリン酸１カリウム、０.５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウムを含む培地（ｐＨ５.０）を１００ｍＬ調製し、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）を行った。これにスポロボロミセス・シンギュラリスＡＴＣＣ ２４１９３、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯４Ｄ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１８）、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯５Ａ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１９）あるいはスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７）を１白金耳接種し、２８℃、１２０ｒｐｍの条件で６日間ロータリーシェーカーにて振とう培養を行い、培養終了液を得た。培養終了後、培養終了液を遠心分離（６,６００ｇ、２０分）して菌体を回収し、湿菌体重量１ｇ当たり１ｍＬの生理食塩水を加え懸濁して酵母懸濁液を得た。

製 造 例 ２
β−ガラクトシダーゼの製造：
３０ｇ／Ｌのグルコース、６ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／Ｌのリン酸１カリウム、０.５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウムを含む培地（ｐＨ５.０）を３Ｌ調製し、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）を行った。これにスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６（製造例１記載の培養終了液６０ｍＬ）を接種し、２７℃、２２５ｒｐｍ、１ｖｖｍの条件にて４日間通気撹拌培養を行った。培養終了後遠心分離（６,６００ｇ、２０分）して菌体を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に懸濁し、ホモジナイザーにて菌体を破砕した。この処理液を遠心分離（６,６００ｇ、２０分）して得た上清に硫安を６０％飽和となるまで加え、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.３）に対し分画分子量８,０００の透析膜を用いた透析により硫安を除いた。この酵素溶液７０ｍＬを同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−６Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス）カラムクロマトグラフィー（５０×２００ｍｍ）に供し、活性画分を回収した。活性画分をセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）ＹＭ−３０により濃縮し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に交換した。この溶液３ｍＬをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００ＨＲ（アマシャム・バイオサイエンス）カラムクロマトグラフィー（１５×９００ｍｍ）に供し、再度活性画分を回収しこれを精製酵素溶液とした。なお、活性画分の確認は２−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを基質とした活性測定法により行った。

参 考 例 １
２−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを基質とする活性測定法：
５０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４.０）に１２.５ｍＭとなるように２−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを加えた溶液を調製した。この溶液０.８ｍＬに、５０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４.０）に４２０ｎｍの吸光度が０.２〜０.８となるよう希釈した酵母懸濁液あるいはβ−ガラクトシダーゼ溶液０.２ｍＬを添加し、３０℃にて１０分間反応させた（試験液）。０.２５Ｍ炭酸ナトリウム溶液４ｍＬを加えて反応を停止後、遠心分離（３,０００ｇ、１０分）し、上清中に含まれる遊離した２−ニトロフェノール量を分光光度計にて４２０ｎｍの吸光度を測定して定量した。一方、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド溶液に５０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４.０）を加えたものを試薬ブランクとし、予め炭酸ナトリウム溶液を添加しておき、酵母懸濁液あるいはβ−ガラクトシダーゼ溶液を添加・混合すると同時に反応停止・発色を行ったものを反応初発液（盲検）とした。酵素活性１単位（Ｕ）は、この条件で１分間に１マイクロモルの２−ニトロフェノールを遊離する酵素量とし、式２にて算出した。

実 施 例 １
湿菌体重量あたりのβ−ガラクトシダーゼ活性：
製造例１記載の方法で調製したスポロボロミセス・シンギュラリスＡＴＣＣ２４１９３、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯４Ｄ４、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯５Ａ５あるいはスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６の酵母懸濁液を用いて、参考例１記載の方法にてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。湿菌体重量１ｇあたりのβ−ガラクトシダーゼ活性はそれぞれ０.９７Ｕ、５.８６Ｕ、８.４４Ｕ、６.９１Ｕであった。

実 施 例 ２
使用酵母の違いによるガラクトシル２糖の生成量への影響：
５０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６.０）４.５ｍＬ中にラクトース５０ｍｇ／ｍＬとＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）１５０ｍｇ／ｍＬを加え、基質溶液を調製した。この基質溶液に、製造例１記載の方法で調製したスポロボロミセス・シンギュラリスＡＴＣＣ２４１９３またはスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６の酵母懸濁液を０.５ｍＬ加え、反応させた。なお、スポロボロミセス・シンギュラリスＡＴＣＣ２４１９３及びスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６の湿菌体重量１ｇ当たりのβ−ガラクトシダーゼ活性はそれぞれ０.９７Ｕ、６.９１Ｕであった。反応は４０℃にて７時間行い、この反応液を、沸騰水中で１０分間保持し反応を停止した。反応液中のガラクトシル−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）量について、下記分析条件１に記載の方法で高速液体クロマトグラフィー分析を行なった。Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ生成量の経時変化を図１に示した。この結果、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６によるＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの生成量は、スポロボロミセス・シンギュラリスＡＴＣＣ２４１９３と比較して格段（５〜１２倍）に多かった。

また、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６を用いて生成したＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃについて、構造解析を行った。すなわち、分析条件１記載の条件で高速液体クロマトグラフィーを用いて分取した、固形分重量として１．２ｍｇのＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ溶液と、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）標準物（生化学工業）を、それぞれ濃縮乾固して重水に置換・溶解し、ＪＥＯＬ ＥＣＡ−５００ ＦＴ−ＮＭＲ（日本電子）により構造解析を行った。これらのＨ^１−ＮＭＲスペクトルを図２に示した。この結果、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６を用いて生成したＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃのスペクトル（Ａ）は、Ｎ−アセチルラクトサミン標準物（Ｂ）と同一のパターンを示し、スポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６によるＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ生成物はＮ−アセチルラクトサミンであることが明らかとなった。

分析条件１
カラム：ＣＡＲＢＯ Ｓｅｐ ＣＨＯ−６１１（６.５ｍｍφ×３００ｍｍ：東京化成）
移動相：精製水
流速：０.４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温：８０℃
試料注入量：１０μＬ
検出器：示差屈折計

実 施 例 ３
単糖／ラクトースの重量比の違いによるガラクトシル２糖の生成量への影響：
５０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６.０）中に、ラクトースを５０ｍｇ／ｍＬ、Ｎ−アセチルグルコサミンをそれぞれ２５、５０、１００、１５０、２００ｍｇ／ｍＬ、製造例１記載の方法で調製したスポロボロミセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６の酵母懸濁液を０.２Ｕ／ｍＬ加え、４０℃にて６時間反応させた。反応後、沸騰水中で１０分間保持し反応を停止した。反応液中で６時間後に生成したＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ量及び副生成物である３糖以上のオリゴ糖量を、実施例２の分析条件１記載の方法で高速液体クロマトグラフィー分析を行い、測定した（表１）。この結果、単糖（Ｎ−アセチルグルコサミン）／ラクトースの重量比が０.５の場合は、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと副生成物の生成量は同程度であるが、１以上の場合はＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの生成量が増加していくのに比例して、副生成物の生成量が減少した（図３および図４）。また、単糖／ラクトースの重量比が高くなると共にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃのラクトースに対する収率（１００×Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ生成量／ラクトース添加量）が高くなった（図５）。

実 施 例 ４
各種単糖類からのガラクトシル２糖の生成：
５０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ６.０）中に、ラクトース５０ｍｇ／ｍＬ、表２に記載の各種単糖１５０ｍｇ／ｍＬ、製造例２記載の方法で調製した精製β−ガラクトシダーゼ０.１Ｕ／ｍＬを加え、４０℃にて７時間反応させた。反応後、反応液を沸騰水中で１０分間保持し、反応を停止した。反応液を実施例２の分析条件１記載の方法で高速液体クロマトグラフィーに供し、ガラクトシル２糖の溶出部分を分取し、３糖以上及び単糖成分を除去した。分取した試料に水素化ホウ素ナトリウムを添加して糖を還元し、試薬を除去した試料を、下記分析条件２に記載の方法にて高速液体クロマトグラフィー分析し、生成したガラクトシル２糖量を測定した。表２に７時間後に生成したガラクトシル２糖量を示した。ガラクトース、マンノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−メチルガラクトシド、α−メチルグルコシドを用いた場合、特に効率よくガラクトシル２糖が生成した。

分析条件２
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ （４.６ｍｍφ×２５０ｍｍ：旭化成
工業）
移動相：アセトニトリル／メタノール／水＝７０／１０／２０
流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
試料注入量：１０μＬ
検出器：示差屈折計

本発明の製造法により、有用な食品素材や医薬品原料、試薬として利用できるガラクトシル２糖類が効率よく簡便に製造されるので、食品分野や医薬品分野での原料製造に有利に利用することができる。

実施例２でのＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ生成量の経時変化を示す図面である。 実施例２で得たＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃのスペクトル（Ａ）を、Ｎ−アセチルラクトサミン標準物のスペクトル（Ｂ）と比較した図面である。 実施例３でのＧｌｃＮＡｃ添加量と、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ生成量および３糖以上のオリゴ糖生成量の関係を示す図面である。 実施例３でのＧｌｃＮＡｃとラクトースの添加量比と、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと３糖以上のオリゴ糖の生成量比の関係を示す図面である。 実施例３でのＧｌｃＮＡｃとラクトースの添加量比と、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの対ラクトース収率の関係を示す図面である。 以 上

Claims (8)

1. ラクトースとガラクトシル化される単糖類とを含む基質に、β−ガラクトシダーゼ活性が湿菌体重量１ｇあたり１Ｕ以上である酵母および／または当該酵母由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させることを特徴とするガラクトシル２糖類の製造法。
2. 酵母が、グルコース抑制を解除した酵母である請求項１記載の製造法。
3. ガラクトシル化される単糖類が、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、アラビノース、ラムノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−メチルマンノシド、α−メチルガラクトシド、α−メチルグルコシド、２−デオキシグルコースおよび２−デオキシガラクトースよりなる群から選ばれるものである請求項１または２記載の製造法。
4. ガラクトシル化される単糖類を、ラクトースに対して重量比で１以上含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
5. 酵母が、スポロボロミセス属に属する酵母である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
6. スポロボロミセス属に属する酵母が、スポロボロミセス・シンギュラリスである請求項５記載の製造法。
7. スポロボロミセス属に属する酵母が、スポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ−＃４Ｄ４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１８）、スポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ−＃５Ａ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１９）またはスポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７）である請求項５記載の製造法。
8. スポロボロミセス属に属する酵母が、スポロボロミセス・シンギュラリス ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７）である請求項５記載の製造法。
   
   

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