CN112760231B - 一种用于低分子量普鲁兰多糖制备的培养体系及生产工艺 - Google Patents

一种用于低分子量普鲁兰多糖制备的培养体系及生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于低分子量普鲁兰多糖制备的培养体系，包括碳源营养物、氮源营养物和无机盐，其特征在于，所述氮源营养物为牛肉粉，同时含有维生素B5。本发明还提供了利用所述培养体系生产低分子量普鲁兰多糖的生产工艺。本发明提供的培养体系和生产工艺，可高效生产低分子量普鲁兰多糖，同时提高普鲁兰多糖的产量。

Description

一种用于低分子量普鲁兰多糖制备的培养体系及生产工艺
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及在不同时间段向发酵培养基中添加不同浓度维生素B5生产低分子量普鲁兰多糖发酵的新工艺。
背景技术
普鲁兰多糖(Pullulan)又称短梗霉多糖，作为一种常见的微生物胞外多糖，是由类酵母菌出芽短梗霉发酵经提取纯化干燥而得到的真菌胞外多糖。与其它多糖相比，普鲁兰多糖具有单一的物质组成和聚集形式，具有较好的生物相容性。它是通过α-1,6糖苷键将芽三糖结合起来的高分子聚合物，具有独特的α-1,4和α-1,6葡聚糖重复单元连接模式，这种特殊的糖苷键的规则交替导致普鲁兰多糖具有柔韧的结构和较强的溶解度，独特的连接模式还赋予普鲁兰多糖拥有其它多糖所没有的、独特的、优异的物理特性，包括良好的粘结性能、成纤维性、成膜性和可塑性。目前，商业化的普鲁兰多糖的数均相对分子质量大概在1.0×105～2.0×105Da，重均相对分子质量大概在1.8×105～3.62×105Da，相对分子质量分散指数一般在2.1到4.1之间。相对分子质量的分布范围决定了普鲁兰多糖的应用范围，例如3.0×104～9.0×104Da大小的普鲁兰多糖分子片段可代替右旋糖酐作为血浆扩容剂。同时在释放剂的应用中，低分子量的多糖由于其在生物组织中的高扩散性而比其他高分子量的多糖具有优势。因此，作为一种极具前途的工业用多糖，低分子量普鲁兰多糖的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于低分子量普鲁兰多糖制备的培养体系，包括碳源营养物、氮源营养物和无机盐，所述氮源营养物为牛肉粉，同时含有维生素B5。本发明首次通过添加维生素B5控制获得了低分子量的普鲁兰多糖。
优选的是，维生素B5的含量为0.01-2g/L。进一步优选的维生素B5的使用量为0.01、0.02、0.05、0.1、0.3、0.7、1.0、1.3、1.7、2.0g/L。
上述任一项优选的是，牛肉粉的含量为5-10g/L。进一步优选的牛肉粉的含量为5、6、7、8、9、10g/L。
本发明中，所述氮源营养物的含义为微生物培养添加的氮源：作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。把从外界吸入的氮素化合物或氮气，称为该生物的氮源。微生物生长和产物合成需要氮源。氮源主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成。培养基中使用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等。常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、麸皮、废菌丝体等。
上述任一项优选的是，维生素B5的添加时间为发酵开始后的第0～72小时。优选的维生素B5的添加时间为发酵开始后的第0、5、10、15、20、24、32、36、44、48、56、64、72小时。
上述任一项优选的是，所述碳源营养物包括蔗糖和/或葡萄糖。
本发明中，所述碳源营养物的含义为微生物培养添加的碳源：含有碳元素且能被微生物生长繁殖所利用的一类营养物质统称为碳源。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸及有机酸酯和小分子醇。根据微生物所能产生的酶系不同，不同的微生物可利用不同的碳源。碳源对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。碳源在制作微生物培养基或细胞培养基时有重要的作用，为微生物或细胞的正常生长，分裂提供物质基础。
上述任一项优选的是，所述碳源营养物为130-180g/L的蔗糖。进一步优选的蔗糖含量为130、150、165、180g/L。
上述任一项优选的是，所述无机盐包括NaCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和KH2PO4。
上述任一项优选的是，所述无机盐为NaCl 3g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O 0.05g/L、KH2PO4 7g/L。
本发明所述无机盐为矿物质，常见的有钙、镁、钠、钾等，包括硫酸盐,磷酸盐,氯化物和含钾,钠,镁,铁，钙的化合物等。本发明最为优选的为氯化钠、硫酸镁及其水合分子、硫酸亚铁及其水合分子和磷酸二氢钾。无机盐为微生物生长提供了不可缺少的营养物质.其主要作用是构成菌体细胞成份,作为酶的组成部分,酶的激活剂或抑制剂,调节培养基的渗透压,PH,氧化还原电位等。
本发明还提供了一种生产低分子量普鲁兰多糖的工艺方法，利用上述任一项所述的培养体系作为出芽短梗霉的发酵培养基。
优选的是，菌株发酵过程包括以下步骤：
步骤一：将冻存的出芽短梗霉菌株进行活化，菌种编号CGMCC7055；
步骤二：活化菌液转接于种子培养液振荡培养，活化菌液与种子培养基的体积比为1：5，28℃，180r/min条件下恒温震荡培养20-24h获得种子液；
步骤三：将所得种子液以6％(v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，转速400r/min，前24h培养温度为32℃，后64h培养温度为28℃，发酵周期为88h，发酵培养体系为权利要求1至8任一项所述的培养体系。
本发明的一项优选实施方式中，将出芽短梗霉菌株置于25℃温培箱中活化2～3h，然后使用接种环挑取一环接种于种子培养基(100mL/500mL)中，在28℃，180r/min条件下恒温震荡培养20～24h。
种子培养基组成为：蔗糖150g/L，酵母浸粉3g/L，硫酸铵1g/L，NaCl 2.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
接种口在火焰保护下，将所得种子液以6％(v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养。转速400r/min，前24h培养温度为32℃，后64h培养温度为28℃，发酵周期为88h。
发酵培养基为：蔗糖130～180g/L，牛肉粉5～10g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 0.02～2g/L，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
所述的普鲁兰多糖检测是利用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，普鲁兰多糖含量的测定使用酒精醇沉法。上述检测方法为现有技术中的常规方法，记载在现有文献和工具书中，在此不进行赘述。
本发明所解决的技术问题是：利用5L发酵罐发酵，在发酵的不同时间段向发酵培养基中添加不同浓度维生素B5，可以高效产低分子量普鲁兰多糖的同时并提高其产量。在发酵过程中可以测定多糖的生物量、含量、粘度及分子量等参数，研究其变化规律。为下一步的中试阶段提供可靠的依据。本发明进一步的对维生素B5在发酵产生普鲁兰多糖多糖过程中的作用机理进行了研究，实验表明：维生素B5的添加增大了普鲁兰多糖代谢途径中三种生物合成关键酶酶活性(磷酸葡萄糖变位酶(α-phosphoglucose mutase，PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGP)和葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase，FKS))及两种降解酶酶活性(α-淀粉酶和普鲁兰酶)。通过代谢组学和蛋白质组学的研究发现，添加维生素B5主要加强了TCA循环(为普鲁兰多糖的合成与降解提供了大量能量)、半乳糖代谢途径(为普鲁兰多糖的合成与降解提供了更多的前体物质UDPG)。
本发明所用菌种来源：天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种半连续法生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，申请号:201610827587.2。该专利中公开了本发明所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC7055。
本发明与现有技术相比，有益效果是：1)发酵培养基中加入维生素B5，可高效生产低分子量普鲁兰多糖，但生产成本没有较大的提高；2)通过增加不同浓度维生素B5，促进了普鲁兰多糖代谢相关关键酶的活性，产量有了一定的提高。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1
(1)种子培养
将出芽短梗霉菌株置于25℃温培箱中活化2～3h，然后使用接种环挑取一环接种于种子培养基(100mL/500mL)中，在28℃，180r/min条件下恒温震荡培养20～24h。
种子培养基组成为：蔗糖150g/L，酵母浸粉3g/L，硫酸铵1g/L，NaCl 2.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(2)发酵培养
接种口在火焰保护下，将所得种子液以6％(v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养。转速400r/min，前24h培养温度为32℃，后64h培养温度为28℃，发酵周期为88h。
发酵培养基为：蔗糖150g/L，牛肉粉5g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
本专利使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，首先将发酵液离心去除菌体和其他沉淀物，取1mL上清液，用0.05moL/L无水硫酸钠溶液定容至10mL，取1mL过0.22μm的水相膜，打入液相小瓶中，使用高效液相色谱仪和示差折光检测器对普鲁兰多糖分子量进行检测。测得普鲁兰多糖重均分子量为2.7×105Da。本发明各项优选实施例中，普鲁兰多糖产量的测定方法及溶液稀释体系相同，因此测得的浓度可用于直接横向比较各实施例中普鲁兰多糖的产量。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
本专利使用醇沉法进行普鲁兰多糖含量的测定，首先取30mL上清液，加2倍体积的无水乙醇(即60mL)，充分搅拌，静置5分钟后抽滤，之后放入60℃烘箱中烘干至恒重，称量并计算，测得的普鲁兰多糖含量为85.2g/L。
实施例2
(1)种子培养
同实施例1
(2)发酵培养
同实施例1
发酵培养基为：蔗糖130g/L，牛肉粉5g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 0.02g/L(添加时间为0h)，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，测得普鲁兰多糖的重均分子量为,1.83×105Da，较空白组降低了32.2％。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
使用醇沉法测得的普鲁兰多糖含量为87.4g/L。
实施例3
(1)种子培养
同实施例1
(2)发酵培养
同实施例1
发酵培养基为：蔗糖140g/L，牛肉粉6g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 0.2g/L(添加时间为0h)，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，测得普鲁兰多糖的重均分子量为1.32×105Da，较空白组降低了51.1％。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
使用醇沉法测得的普鲁兰多糖含量为92.8g/L。
实施例4
(1)种子培养
同实施例1
(2)发酵培养
同实施例1
发酵培养基为：蔗糖150g/L，牛肉粉7g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 2g/L(添加时间为0h)，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，测得普鲁兰多糖的重均分子量为1.57×105Da，较空白组降低了41.8％。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
使用醇沉法测得的普鲁兰多糖含量为90.2g/L。
实施例5
(1)种子培养
同实施例1
(2)发酵培养
同实施例1
发酵培养基为：蔗糖160g/L，牛肉粉8g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 0.2g/L(添加时间为24h)，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，测得普鲁兰多糖的重均分子量为1.79×105Da，较空白组降低了33.7％。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
使用醇沉法测得的普鲁兰多糖含量为88.6g/L。
实施例6
(1)种子培养
同实施例1
(2)发酵培养
同实施例1
发酵培养基为：蔗糖170g/L，牛肉粉9g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 0.2g/L(添加时间为48h)，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，测得普鲁兰多糖的重均分子量为2.02×105Da，较空白组降低了25.1％。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
使用醇沉法测得的普鲁兰多糖含量为85.8g/L。
实施例7
(1)种子培养
同实施例1
(2)发酵培养
同实施例1
发酵培养基为：蔗糖180g/L，牛肉粉10g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B5 0.2g/L(添加时间为72h)，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
(3)普鲁兰多糖分子量的测定
使用高效液相色谱法进行普鲁兰多糖分子量的测定，测得普鲁兰多糖的重均分子量为2.45×105Da，较空白组降低了9.2％。
(4)普鲁兰多糖含量的测定
使用醇沉法测得的普鲁兰多糖含量为85.4g/L。
实施例8
实施例8与实施例1-7相似，不同的是维生素B5的添加量为0.01g/L，添加时间为0h，最终普鲁兰多糖分子量为2.16×105Da，普鲁兰多糖产量为86.7g/L。
实施例9
实施例9与实施例1-7相似，不同的是维生素B5的添加量为1g/L，添加时间为0h，最终普鲁兰多糖分子量为1.52×105Da，普鲁兰多糖产量为91.4g/L。
实施例10
实施例10与实施例1-7相似，不同的是维生素B5的添加量为1.5g/L，添加时间为0h，最终普鲁兰多糖分子量为1.54×105Da，普鲁兰多糖产量为90.5g/L。
对比例
对比例与实施例1-10的方法相似，不同的是发酵培养基的氮源营养物质用5g/L蛋白胨替换实施例1-10中的牛肉粉，维生素B5的添加量为1g/L，添加时间为0h，最终普鲁兰多糖分子量为3.58×105Da，普鲁兰多糖产量为75.8g/L。

Claims (3)

1.一种用于低分子量普鲁兰多糖制备的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基为蔗糖130～180g/L，牛肉粉5～10g/L，NaCl 3g/L,KH2PO4 7g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，维生素B50.02～2g/L，其余为蒸馏水，调节pH为6.0。
2.一种生产低分子量普鲁兰多糖的工艺方法，其特征在于，利用权利要求1所述发酵培养基作为出芽短梗霉的发酵培养基，将编号为CGMCC7055的出芽短梗霉菌株，接种于所述发酵培养基，转速400r/min，发酵周期为88h，前24h培养温度为32℃，后64h培养温度为28℃。
3.如权利要求2所述的工艺方法，其特征在于，菌株发酵过程包括以下步骤：
步骤一：将冻存的出芽短梗霉菌株进行活化，菌种编号CGMCC7055；
步骤二：活化菌液转接于种子培养液振荡培养，活化菌液与种子培养基的体积比为1：5，28℃，180r/min条件下恒温震荡培养20-24h获得种子液；
步骤三：将所得种子液以6％(v/v)的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，转速400r/min，前24h培养温度为32℃，后64h培养温度为28℃，发酵周期为88h，发酵培养使用的培养基为权利要求1所述的发酵培养基。
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