CN107118973B - 一种利用微生物生产对羟基苯甲醛的方法 - Google Patents

一种利用微生物生产对羟基苯甲醛的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用微生物生产对羟基苯甲醛的方法，该微生物为具有对羟基苯甲醛生产能力的菌株Bacillus megatherium OMK‑11，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 2016658。本发明为微生物法生产，安全。

Description

一种利用微生物生产对羟基苯甲醛的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用微生物生产对羟基苯甲醛的方法。
背景技术
对羟基苯甲醛，分子式为C7H6O2，分子量为122.12，一种浅黄色或类白色结晶体，微有芳香气味。主要用途是用于医药工业和香料工业的重要中间体，
一、物理性质
对羟基苯甲醛是一种浅黄色或类白色结晶体，微有芳香气味，熔点：112～116℃，相对密度1.129，沸点：246.6℃
易溶于乙醇；乙醚；丙酮；乙酸乙酯，DMF；稍溶于水(在30.5℃水中溶解度为1.388g/100ml)，溶于苯(在65℃苯中溶解度为3.68g/ml)。
二、用途
对羟基苯甲醛是医药工业和香料工业的重要中间体。在医药工业中可用于合成羟氨苄青霉素(阿莫西林)、抗菌增效剂甲氧苄胺嘧啶(TMP)、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、对羟基甘氨酸、羟氨苄头孢霉素、人造天麻、杜鹃素、艾思洛儿等；在香料工业中用于合成香兰素、乙基香兰素、洋茉莉醛、丁香醛、茴香醛和复盆子酮等香料。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种具有对羟基苯甲醛生产能力的菌株Bacillusmegatherium OMK-11，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M2016658。保存地点为湖北省武汉市，武汉大学：保存时间2016年11月20日。
本发明的另一目的在于提供所述的菌株在生产对羟基苯甲醛的用途。
本发明的再一目的在于提供一种对羟基苯甲醛的生产方法，其采用前述的菌株。
本发明提供了一种具有对羟基苯甲醛生产能力的菌株，且利用该菌株进行发酵生产对羟基苯甲醛，发酵法生产对羟基苯甲醛是用天然原料糖质、氨基酸等，经过微生物代谢生成目标产物的一种方法，该方法属于低温低压，比较安全，操作简单，污染少，是一个安全环保的生产方法。
附图说明
图1为实施例1中L-酪氨酸标准品的液相检测图谱；
图2为实施例1中对羟基苯甲醛标准品的液相检测图谱；
图3为实施例1中对羟基苯甲醛发酵液的液相检测图谱。
具体实施方式
菌种
从生姜种植地土壤中分离出一株具有对羟基苯甲醛生产能力的菌株Bacillusmegatherium OMK-11，该菌已于2016年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2016658。
该菌株：可利用葡萄糖、蔗糖、核糖和阿拉伯糖等，该菌株的18s rRNA和26s rRNA序列与芽孢杆菌标准株的18s rRNA和26s rRNA序列有99％的相似性，该菌鉴定为芽孢杆菌属。杆状，末端圆。单个或呈短链排列。革兰氏阳性。
该菌株的菌种活化、种子培养和发酵可采用如下方法：
1)菌种活化：在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布固体斜面培养基上，在生化培养箱中于20-37℃培养24-48h；
2)种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速150-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期；
种子培养基配方如下，按质量比包括：糖质原料1.0-3.5％；无机盐0.1-1.0％；酵母浸粉0.1-1.0％；
3)发酵：将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5-20％的体积比接入发酵培养基；
发酵培养基初始pH3.0-10.0，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气条件下发酵7-20h；然后减小通风，继续发酵至70-80h；
发酵培养基，按质量比包括：糖质原料2.0-5.0％；无机盐；酵母浸粉1.0-2.5％；苯丙氨酸1.0-3.0％。
所述的固体斜面培养基优选为肉汤培养基。
所述的糖质原料，包括葡萄糖，蔗糖，淀粉中的至少一种。
所述的无机盐包括钾盐或钠盐。
所述的步骤3)发酵培养基初始pH优选为5.0-9.0。
实施例1
种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH5，在培养温度28℃，转速1200rpm的条件下培养菌体到对数生长期。
种子培养基配方如下，按质量比(％)：葡萄糖1.0；NaCl0.5；酵母浸粉0.1。
发酵工艺
将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以10％的体积比接入发酵培养基。发酵培养基初始pH5.0，在温度40℃，搅拌转速200rpm，通气量1:0.1的条件下发酵15h；然后降低通风至1:0.01，继续发酵55h。
发酵配方如下(％)：葡萄糖1.0；NaCl 0.5；酵母浸粉1.0；酪氨酸2.0；微量元素。
发酵液检测方法:高效液相色谱法(HPLC法)
柱型：COSMOSIL；5C18-AR-Ⅱ；4.6ID*250MM
柱温：30℃
流动相：甲醇与水(0.1％磷酸)比例为55：45
流速：0.8mL/min，UV:216nm。
检测结果见图1至图3，图1至图3结果表明，发酵液中含有对羟基苯甲醛。
实施例2
种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 6，在培养温度30℃，转速250rpm的条件下培养菌体到对数生长期。
种子培养基配方如下(％)：蔗糖3.5；KCl 0.5；酵母浸粉1.0。
发酵
将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以10％的体积比接入发酵培养基。发酵培养基初始pH 9.0，在温度35℃，搅拌转速350rpm，通气量1:0.2的条件下发酵7h；然后减小通风至1:0.02，继续发酵73h。
发酵配方如下(％)：蔗糖4.0；KCl 0.5；酵母浸粉1.0-2.5；酪氨酸1.0-3.0；微量元素。
实施例3
种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH8，在培养温度35℃，转速150rpm的条件下培养菌体到对数生长期。
种子培养基配方如下(％)：淀粉3.5；NaCl 0.5；酵母浸粉1.0。
发酵
将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以15％的体积比接入发酵培养基。发酵培养基初始pH7.0，在温度35℃，搅拌转速400rpm，通气量1:0.1的条件下发酵10h；然后降低通风至1:0.01，继续发酵65h。发酵配方如下(％)：
淀粉4.0；KCl 1.0；酵母浸粉2.5；酪氨酸3.0；微量元素。
实施例4
天然对羟基苯甲醛的生产(三角瓶震荡发酵)
配制种子培养基，其培养基组成如下(g/L)：葡萄糖10，磷酸二氢钾7，氯化钠2.5，酵母浸粉10.0，溶剂为水，初始pH7.0。121℃灭菌30min。
配制发酵培养基，其培养基组成如下(g/L)：葡萄糖20，磷酸氢二钾4，酵母浸粉1.0，酪氨酸10.0，微量元素100微升，溶剂为水，初始pH7.5。121℃灭菌30min。
种子的制备：无菌转移低温甘油管OMK-11菌株于新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2天，挑取菌落接种于500ml三角瓶做种子培养，瓶中种子培养基的体积为50ml，摇床转速180rpm，30℃培养24h，得到种子液。
天然对羟基苯甲醛的发酵：取配制好的发酵培养基50ml倒入500ml的无菌三角瓶中，然后接入培养好的种子液7.5ml进行发酵，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。摇瓶发酵20h把摇床转速降至80rpm，然后继续发酵80h后用HPLC法测定发酵液中天然对羟基苯甲醛的浓度为2.0g/L。
实施例5：天然对羟基苯甲醛的生产(生物反应器发酵)
种子培养基、发酵培养基配制同实施例4。
种子的制备：无菌转移低温甘油管OMK-11菌株于新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2天，挑取菌落接种于装有1.8L种子培养基的3L种子罐进行种子培养，通风搅拌转速300rpm，30℃培养24h，得到种子液。
天然对羟基苯甲醛的发酵：将配制好的发酵培养基10.2L装入20L发酵罐中，121℃灭菌30min，然后将培养好的1.8L种子液接入20L发酵罐中进行发酵，发酵温度30℃，搅拌转速400rpm，通气比1：0.1。发酵6h降低通风至1：0.01，继续发酵54h。发酵结束用HPLC法测定发酵液中天然对羟基苯甲醛的浓度为3g/L。

Claims (9)

1.具有对羟基苯甲醛生产能力的菌株Bacillus megatherium OMK-11，其特征在于：该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 2016658。
2.如权利要求1所述的菌株在生产对羟基苯甲醛的用途。
3.一种对羟基苯甲醛的生产方法，其采用权利要求1所述的菌株，以酪氨酸作为底物，通过发酵生产对羟基苯甲醛。
4.如权利要求3所述的一种对羟基苯甲醛的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）菌种活化：
2）种子培养
在种子培养基中进行，培养至对数生长期；该种子培养基初始pH 5-8，种子培养基按质量百分比包括：糖质原料1.0-3.5%；无机盐0.1-1.0%；酵母浸粉0.1-1.0%，余量为水；
3）发酵：
在发酵培养基中进行，发酵培养基初始pH3.0-10.0，发酵培养基按质量百分比包括：糖质原料2.0-5.0%；无机盐适量；酵母浸粉1.0-2.5%；酪氨酸1.0-3.0%，余量为水。
5.如权利要求4所述的一种对羟基苯甲醛的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）菌种活化：在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布固体斜面培养基上，在生化培养箱中于20-37℃培养24-48h；
2）种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速150-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期；
种子培养基配方如下，按质量比包括：糖质原料1.0-3.5%；无机盐0.1-1.0%；酵母浸粉0.1-1.0%，余量为水；
3）发酵：将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5-20%的体积比接入发酵培养基；
发酵培养基初始pH3.0-10.0，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气条件下发酵7-20h；然后减小通风，继续发酵至50-100h；
发酵培养基，按质量百分比包括：糖质原料2.0-5.0%；无机盐适量；酵母浸粉1.0-2.5%；酪氨酸1.0-3.0%，余量为水。
6.如权利要求5所述的一种对羟基苯甲醛的生产方法，其特征在于，步骤1）所述的固体斜面培养基为肉汤培养基。
7.如权利要求4或5所述的一种对羟基苯甲醛的生产方法，其特征在于，步骤2）和3）所述的糖质原料，包括葡萄糖，蔗糖，淀粉中的至少一种。
8.如权利要求4或5所述的一种对羟基苯甲醛的生产方法，其特征在于，步骤2）和3）所述的无机盐包括钾盐或钠盐。
9.如权利要求4或5所述的一种对羟基苯甲醛的生产方法，其特征在于，步骤3）发酵培养基初始pH5.0-9.0。
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