CN109402017B - 一株盐单胞菌100-16-2及盐单胞菌100-16-2制备聚3-羟基丁酸酯的方法 - Google Patents

一株盐单胞菌100-16-2及盐单胞菌100-16-2制备聚3-羟基丁酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株盐单胞菌100‑16‑2及盐单胞菌100‑16‑2制备聚3‑羟基丁酸酯的方法，涉及聚3‑羟基丁酸酯生产技术领域，所述菌株的拉丁文名称为Halomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.13730。将本发明提供的盐单胞菌100‑16‑2菌株采用逐级扩大培养，最终实现了在2000～4000L下发酵，发酵结束后，聚3‑羟基丁酸酯的含量为菌株细胞干重的80％，发酵菌体干重为32g/L。

Description

一株盐单胞菌100-16-2及盐单胞菌100-16-2制备聚3-羟基丁 酸酯的方法
技术领域
本发明涉及聚3-羟基丁酸酯生产技术领域，具体涉及一株盐单胞菌100-16-2及盐单胞菌100-16-2制备聚3-羟基丁酸酯的方法。
背景技术
聚3-羟基丁酸酯(PHB)为一定粒度的脂溶性颗粒物质，原核生物在氮缺乏或碳过剩时在胞内大量积累PHB。由于具有低溶解性和相对高的摩尔质量，故PHB可以在细菌胞内大量储存而不影响胞内外的渗透压。PHB有良好的生物降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无任何污染是一种理想的储存材料。PHB作为一种微生物合成塑料，不仅具有化学合成塑料的特性，而且还有密度大、光学活性好、透氧性低、抗紫外线辐射、生物可降解性、生物组织相容性、压电性和抗凝血性等优点，可在电子、光学、生物医学等高技术领域获得应用。
目前发现的能够大量积累PHB的细菌包括甲烷氧化菌属(Methylocystis)，芽孢杆菌属(Baciillus sp.)和螯合细菌(Chelatococcus daeguensis)等。Kaynaret al.(2009)发现从土耳其安卡拉鱼肠道中分离的30多种杆菌均能积累PHB，PHB积累量在0.81％-23.38％CDW之间。此外，一些嗜盐古菌在细胞内也可以合成PHB，如Haloferax(Fernandez-Castillo et al.,1986)和Haloarcula(Han et al.,2007)等。
Kawata et al.(2012)发现他所研究的16株Halomonas中，PHB积累量最高可达63.6％CDW(摇瓶培养，200mL)；Quillaguaman(2006,2007)等以乙酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，在45g/LNaCl盐度下培养H.boliviensis LC1，PHB含量达到55％CDW(2L体积发酵罐)。Tan et al.(2011)等在盐度60g/L和葡萄糖浓度30g/L条件下，Halomonas细胞干重达6g/L和PHB含量达69％CDW(开放条件培养，6L体积)。陈佳妮(2017)等利用厌氧发酵污泥热裂解液产生的乙酸为碳源，在60g/LNaCl培养Halomonas CJN，细胞干重可以达到约9g/L，PHB含量达到20％CDW(摇瓶培养，50mL)。Fu et al.(2014)利用去除2-甲基柠檬酸合成酶的HalomonasTD01工程菌株，培养70h产生菌体112g/L，PHB含量达到70％(500L发酵罐)。得到的PHB的含量不是很理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一株盐单胞菌100-16-2菌株，将该菌株应用到生产聚3-羟基丁酸酯中，聚3-羟基丁酸酯的含量为菌株细胞干重的80％，发酵菌体干重为32g/L。
本发明提供了一株盐单胞菌100-16-2菌株，拉丁文名称为Halomonas sp.，保藏编号为CGMCCNo.13730。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的盐单胞菌100-16-2菌株制备聚3-羟基丁酸酯的方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的盐单胞菌100-16-2菌株用CM液体培养基进行活化，得到活化液；
2)将所述步骤1)得到的活化液接种于CM液体培养基中进行第一培养，得到第一种子液；
所述活化液与CM液体培养基的体积比为(3～5)mL:(200～400)mL；
所述第一培养的时间为2～3d；
3)将所述步骤2)得到的第一种子液接种于CM液体培养基中进行第二培养，得到第二种子液；
所述第一种子液与CM液体培养基的体积比为(3～5)L:(20～40)L；
所述第二培养的时间为20～28h；
4)将所述步骤3)得到的第二种子液接种于CM液体培养基中进行第三培养，得到第三种子液；
所述第二种子液与CM液体培养基的体积比为(20～40)L:(200～400)L；
所述第三培养的时间为20～28h；
5)将所述步骤4)得到的第三种子液接种于CM培养基中进行发酵，得到聚3-羟基丁酸酯；
所述第三种子液与CM液体培养基的体积比为(200～400)L:(2000～4000)L；
所述发酵的总时间为45～50h，在发酵的前25h时每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加氯化铵1.5～2.5g、磷酸二氢钾0.4～0.6g和葡萄糖25～35g；在发酵25h后，每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加葡萄糖25～35g；
所述CM液体培养基以稀释卤水溶液为溶剂，每升包括：酵母提取物10～15g，酸水解酪蛋白7.5～9g，葡萄糖30～40g，所述CM液体培养基的pH值为7～8；
所述稀释卤水溶液的盐度为25～35g/L。
优选的，所述步骤4)第三培养的DO水平为5～15％。
优选的，所述步骤4)第三培养的DO水平为10％。
优选的，所述步骤5)发酵的DO水平为5～15％。
优选的，所述步骤5)发酵的DO水平为10％。
优选的，所述步骤1)活化的条件包括：所述活化的温度为35～40℃，所述活化的时间为1.5～2.5d，所述活化的转速为100～200rpm。
优选的，所述步骤2)第一培养的条件包括：所述第一培养的温度为35～40℃，所述第一培养的转速为100～200rpm。
优选的，所述步骤3)第二培养的条件包括：所述第二培养的DO水平为5～15％，所述第二培养的温度为35～40℃。
优选的，所述步骤4)第三培养的温度为35～40℃。
本发明提供了一株盐单胞菌100-16-2菌株，将该菌株应用到生产聚3-羟基丁酸酯中，聚3-羟基丁酸酯的含量为菌株细胞干重的80％，发酵菌体干重为32g/L。
本发明还提供了所述的盐单胞菌100-16-2菌株制备聚3-羟基丁酸酯的方法，通过将该菌逐级扩大培养，最终实现了在2000～4000L下发酵，聚3-羟基丁酸酯的含量为菌株细胞干重的80％，发酵菌体干重为32g/L。
附图说明
图1为本发明盐单胞菌100-16-2菌株的细胞的扫描电镜结果；
图2为本发明盐单胞菌100-16-2菌株的细胞的透射电镜结果，细胞内的白色颗粒状物质为PHB；
图3为本发明盐单胞菌100-16-2菌株的细胞的荧光显微镜结果，荧光显微镜下经尼罗蓝染色的富含PHB的Halomonas细胞呈亮黄色。
保藏说明
盐单胞菌100-16-2，拉丁文名称为Halomonas sp.，于2017年03月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.13730。
具体实施方式
本发明提供了一株盐单胞菌100-16-2菌株，拉丁文名称为Halomonas sp.，保藏编号为CGMCCNo.13730。
本发明提供的盐单胞菌100-16-2菌株的细胞的扫描电镜结果见图1，透射电镜结果见图2，荧光显微镜结果见图3。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的盐单胞菌100-16-2菌株制备聚3-羟基丁酸酯的方法，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的盐单胞菌100-16-2菌株用CM液体培养基进行活化，得到活化液；
2)将所述步骤1)得到的活化液接种于CM液体培养基中进行第一培养，得到第一种子液；
所述活化液与CM液体培养基的体积比为(3～5)mL:(200～400)mL；
所述第一培养的时间为2～3d；
3)将所述步骤2)得到的第一种子液接种于CM液体培养基中进行第二培养，得到第二种子液；
所述第一种子液与CM液体培养基的体积比为(3～5)L:(20～40)L；
所述第二培养的时间为20～28h；
4)将所述步骤3)得到的第二种子液接种于CM液体培养基中进行第三培养，得到第三种子液；
所述第二种子液与CM液体培养基的体积比为(20～40)L:(200～400)L；
所述第三培养的时间为20～28h；
5)将所述步骤4)得到的第三种子液接种于CM培养基中进行发酵，得到聚3-羟基丁酸酯；
所述第三种子液与CM液体培养基的体积比为(200～400)L:(2000～4000)L；
所述发酵的总时间为45～50h，在发酵的前25h时每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加氯化铵1.5～2.5g、磷酸二氢钾0.4～0.6g和葡萄糖25～35g；在发酵25h后，每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加葡萄糖25～35g；
所述CM液体培养基以稀释卤水溶液为溶剂，每升包括：酵母提取物10～15g，酸水解酪蛋白7.5～9g，葡萄糖30～40g，所述CM液体培养基的pH值为7～8；
所述稀释卤水溶液的盐度为25～35g/L。
本发明将上述技术方案所述的盐单胞菌100-16-2菌株用CM液体培养基进行活化，得到活化液。
在本发明中，所述活化的条件优选包括：所述活化的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述活化的时间优选为1.5～2.5d，更优选为2d；所述活化的转速优选为100～200rpm，更优选为150rpm；所述活化使用的培养基优选为CM液体培养基，所述CM液体培养基优选以稀释卤水溶液为溶剂，每升优选包括：酵母提取物10～15g，酸水解酪蛋白7.5～9g，葡萄糖30～40g，所述CM液体培养基的pH值为7～8，更优选包括酵母提取物11～14g，酸水解酪蛋白8～8.5g，葡萄糖32～38g，所述CM液体培养基的pH值为7.5～8；所述稀释卤水溶液的盐度优选为25～35g/L，更优选为30g/L。
在本发明中，所述稀释卤水溶液优选海水经常规物理蒸发方法，得到浓缩海水后再经水稀释，得到稀释卤水溶液。本发明对所述海水的来源没有特殊限定，采用常规海水即可。
本发明将得到的活化液接种于CM液体培养基中进行第一培养，得到第一种子液；所述活化液与CM液体培养基的体积比为(3～5)mL:(200～400)mL；所述第一培养的时间为2～3d。
在本发明中，所述活化液与CM液体培养基的体积比为(3～5)mL:(200～400)mL，优选为(3.2～4.5)mL:300mL。
在本发明中，所述第一培养的条件优选包括：所述第一培养的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述第一培养的转速优选为100～200rpm，更优选为150rpm；所述第一培养的时间优选为2.5d。在本发明中，所述第一培养优选在500mL锥形瓶中进行。
在本发明中，所述第一种子液的细胞浊度优选为OD600＝5～8。
本发明将得到的第一种子液接种于CM液体培养基中进行第二培养，得到第二种子液；所述第一种子液与CM液体培养基的体积比为(3～5)L:(20～40)L；所述第二培养的时间为20～28h。
在本发明中，所述第二培养的条件优选包括：所述第二培养的DO水平优选为5～15％，更优选为10％；所述第二培养的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述第二培养的转速优选为100～200rpm，更优选为150rpm。在本发明中，所述第二培养优选在50L发酵罐中进行。
在本发明中，所述第二培养的时间优选为24h。
在本发明中，所述第一种子液与CM液体培养基的体积比优选为(3.2～4.5)L:30L。
在本发明中，所述第二种子液的细胞浊度优选为OD600＝10～15。
本发明将得到的第二种子液接种于CM液体培养基中进行第三培养，得到第三种子液；所述第二种子液与CM液体培养基的体积比为(20～40)L:(200～400)L；所述第三培养的时间为20～28h。
在本发明中，所述第三培养的温度优选为35～40℃。更优选为37℃；所述第三培养的时间优选为24h；所述第三培养的DO水平优选为5～15％，更优选为10％；所述第三培养的转速优选为100～200rpm，更优选为150rpm。在本发明中，所述第三培养优选在500L发酵罐中进行。
在本发明中，所述第二种子液与CM液体培养基的体积比优选为(22～35)L:300L。
在本发明中，所述第三种子液的细胞浊度优选为OD600＝40～50。
本发明将得到的第三种子液接种于CM培养基中进行发酵，得到聚3-羟基丁酸酯；所述第三种子液与CM液体培养基的体积比为(200～400)L:(2000～4000)L；所述发酵的总时间为45～50h，在发酵的前25h时每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加氯化铵1.5～2.5g、磷酸二氢钾0.4～0.6g和葡萄糖25～35g；在发酵25h后，每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加葡萄糖25～35g。
在本发明中，所述第三种子液与CM液体培养基的体积比优选为(250～350)L:3000L。
在本发明中，所述发酵的总时间优选为48h，在发酵的前24h时每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加氯化铵2g、磷酸二氢钾0.5g和葡萄糖30g；在发酵24h后，每6～7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加葡萄糖30g。
在本发明中，所述发酵的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述发酵的转速优选为100～200rpm，更优选为150rpm；所述发酵的DO水平优选为5～15％，更优选为10％。在本发明中，所述发酵优选在5000L发酵罐中进行。
在本发明中，所述CM液体培养基以稀释卤水溶液为溶剂，每升包括：酵母提取物10～15g，酸水解酪蛋白7.5～9g，葡萄糖30～40g；优选包括酵母提取物11～14g，酸水解酪蛋白8～8.5g，葡萄糖32～38g；所述CM液体培养基的pH值为7～8，优选为7.5。
在本发明中，所述稀释卤水溶液的盐度为25～35g/L，优选为30g/L。在本发明中，所述稀释卤水溶液优选海水经常规物理蒸发方法，得到浓缩海水后再经水稀释，得到稀释卤水溶液。本发明对所述海水的来源没有特殊限定，采用常规海水即可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株盐单胞菌100-16-2及盐单胞菌100-16-2制备聚3-羟基丁酸酯的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
菌体PHB积累扩大发酵培养(5000L发酵罐)，采用以下步骤：
种子液制备：取200μL保存于甘油管中的盐单胞菌100-16-2菌种于盛有5mL灭菌CM培养基试管中，活化2d(37℃，150r/min)，得到活化液；
向500mL锥形瓶中加入300mL灭菌CM培养基，加入3mL活化液，于摇床中扩大培养3d(37℃，150r/min)，得到第一种子液；
在50L发酵罐中配30L CM培养基灭菌，加入3L第一种子液，DO水平为10％，pH 7.5，培养24h，得到第二种子液；
将第二种子液30L转入500L发酵罐(300LCM培养基，培养条件同上一步骤)继续培养24h，得到第三种子液。
在5000L发酵罐中配3000L CM培养基灭菌，转入300L第三种子液，设发酵温度37℃，DO水平为10％，pH 7.5，发酵开始后每6～7h取发酵液，检测葡萄糖的浓度。当发酵液中葡萄糖的浓度低于10g/L时，在发酵前24h时，每升补加氯化铵2g、磷酸二氢钾0.5g和葡萄糖30g，在发酵14h后，当发酵液中葡萄糖的浓度低于10g/L时，每升补加葡萄糖30g，发酵的总时间为48h。
CM液体培养基以盐度为30g/L的稀释卤水为溶剂，每升包括：酵母提取物10g，酸水解酪蛋白7.5g，C6H12O6·H2O 30g，pH值为7.5。
发酵结束后，检测发酵液中PHB的含量，检测所得菌体PHB含量为细胞干重的80％，发酵菌体干重为32g/L。
由以上实施例可以得出，将本发明提供的盐单胞菌100-16-2菌株采用逐级扩大培养，最终实现了在2000～4000L下发酵，聚3-羟基丁酸酯的含量为菌株细胞干重的80％，发酵菌体干重为32g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用盐单胞菌（Halomonas sp .）100-16-2菌株制备聚3-羟基丁酸酯的方法，包括以下步骤：
1）将盐单胞菌100-16-2菌株用CM液体培养基进行活化，得到活化液；所述盐单胞菌100-16-2菌株的保藏编号为CGMCC NO:13730；
2）将所述步骤1）得到的活化液接种于CM液体培养基中进行第一培养，得到第一种子液；
所述活化液与CM液体培养基的体积比为(3~5)mL:(200~400)mL；
所述第一培养的时间为2~3天；
3）将所述步骤2）得到的第一种子液接种于CM液体培养基中进行第二培养，得到第二种子液；
所述第一种子液与CM液体培养基的体积比为(3~5)L:(20~40)L；
所述第二培养的时间为20~28h；
4）将所述步骤3）得到的第二种子液接种于CM液体培养基中进行第三培养，得到第三种子液；
所述第二种子液与CM液体培养基的体积比为(20~40)L:(200~400)L；
所述第三培养的时间为20~28h；
5）将所述步骤4）得到的第三种子液接种于CM培养基中进行发酵，得到聚3-羟基丁酸酯；
所述第三种子液与CM液体培养基的体积比为(200~400)L:(2000~4000)L；
所述发酵的总时间为45~50h，在发酵的前25h时每6~7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加氯化铵1.5~2.5g、磷酸二氢钾0.4~0.6g和葡萄糖25~35g；在发酵25h后，每6~7h检测一次发酵液中葡萄糖的浓度，所述发酵液中的葡萄糖浓度低于10g/L时，每升补加葡萄糖25~35g；
所述CM液体培养基以稀释卤水溶液为溶剂，每升包括：酵母提取物10~15g，酸水解酪蛋白7.5~9g，葡萄糖30~40g，所述CM液体培养基的pH值为7~8；
所述稀释卤水溶液的盐度为25~35g/L；
所述步骤4）第三培养的DO水平为10%；
所述步骤5）发酵的DO水平为10%；
所述步骤1）活化的条件包括：所述活化的温度为35~40℃，所述活化的时间为1.5~2.5天，所述活化的转速为100~200rpm；
所述步骤2）第一培养的条件包括：所述第一培养的温度为35~40℃，所述第一培养的转速为100~200rpm；
所述步骤3）第二培养的条件包括：所述第二培养的DO水平为5~15%，所述第二培养的温度为35~40℃；
所述步骤4）第三培养的温度为35~40℃。
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