CN114990028B - 一种高产短链脂肪酸的丁酸梭菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产短链脂肪酸的丁酸梭菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明提供了一种丁酸梭菌GD1‑1，所述丁酸梭菌GD1‑1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62455，保藏日期为2022年06月01日。该丁酸梭菌GD1‑1菌株能在厌氧环境下短期发酵就可产生大量短链脂肪酸。本发明提供的菌株丁酸梭菌GD1‑1为目前短链挥发性脂肪酸的产量低和发酵时间长等缺点，提供一种短链挥发性脂肪酸的产量高、安全无毒、操作简单的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产短链脂肪酸的丁酸梭菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
短链脂肪酸（SCFA）是指碳原子数为1~6的饱和脂肪酸，包括乙酸（C2）、丙酸（C3）、丁酸（C4）、异丁酸（iC4）、戊酸（C5）、异戊酸（iC5）和己酸（C6）。短链脂肪酸不仅是白酒风味物质的重要组成成分，是白酒中酯类风味物质形成的前体物质，而且作为肠道微生物的代谢产物，对维持机体健康有重要意义，同时在生物燃料、橡胶、树脂合成工业、生物抑菌剂和制药工业上有重要应用。
目前，短链脂肪酸的工业合成主要是利用污泥或者餐厨垃圾等进行厌氧发酵后期投加甲烷抑制剂并搅拌混合，在反应器里生成短链脂肪酸。这些方法制备的短链脂肪酸，为化工物料，主要用于生物脱氮除磷的外加碳源，提高脱氮除磷的效率，难以在食品及医药领域应用。同时，这些生产方法需要高能耗并造成严重污染。与典型的化学合成方法相比，微生物发酵生产短链脂肪酸酸由于以下优点而越来越受到关注：(1)反应条件温和，对环境友好；(2)操作简单，安全无毒，产量高；（3）该过程有效地利用了有机废物。
公开号为CN112280811B的中国发明专利文本中公开了利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法，主要以食品级物料作为发酵底物，利用多菌共生发酵技术，生产短链脂肪酸。公开号为CN110669697A的中国发明专利申请文本中公开了一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌。但目前文献已报道的利用微生物发酵生产短链脂肪酸产量都不高，综合考虑短链脂肪酸的产量及安全性的基础上，高产短链脂肪酸的制备方案、生产工艺等都需要进一步研究。
发明内容
本发明提供了一种丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1及利用丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1发酵高产短链脂肪酸的方法。该丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1菌株能在厌氧环境下短期发酵就可产生大量短链脂肪酸。可有效解决现有的产短链脂肪酸菌种普遍存在产量低，产酸周期长等问题。
本发明提供了一种丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62455，保藏日期为2022年06月01日。
所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1是从安徽省一家浓香型白酒工厂的窖泥样品中分离得到，该菌株经测序分析，测序序列通过BioEdit剪切后，将可靠序列片段上传至NCBI核酸比对网站进行比对，选取序列同源性最高的序列，使用MEGA 5 .0软件构建系统发育树。经过对GD1-1菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定菌株为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，且命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)GD1-1。
所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1菌株形态：将所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种在RCM琼脂平板中，35℃培养18 h，观察菌株菌落形态，可见菌株GD1-1的菌落边缘不规则，菌落颜色为奶油色，在扫描电子显微镜下，放大10000倍观察菌株GD1-1，菌体呈梭杆状，端圆、直或弯曲，产芽孢，显示为革兰氏阳性菌。
本发明还提供了一种含有上述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在微生物菌剂中的添加量：丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的OD600值至少为1.2。
本发明还提供了上述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在制备短链脂肪酸中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述短链脂肪酸包括但不限于乙酸、丁酸、己酸。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物中含有上述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1活菌株、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1干菌株、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1代谢产物、灭活的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)GD1-1中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在组合物中的添加量：丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的OD600值至少为1.2。
在本发明的一种实施方式中，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的代谢产物为短链脂肪酸。
在本发明的一种实施方式中，所述短链脂肪酸包括但不限于乙酸、丁酸、己酸。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于饲料添加剂、食品添加剂、窖泥强化剂、白酒风味物质调和剂、生物燃料、医药。
在本发明的一种实施方式中，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在产品中的添加量：丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的OD600值至少为1.2。
本发明还提供了一种提高丁酸梭菌GD1-1生产短链脂肪酸能力的培养基，所述培养基包括：葡萄糖 5~30 g/L、氯化钠 3~5 g/L、酵母粉 5~10 g/L、蛋白胨5~10 g/L、牛肉膏5~10g/L、乙酸钠 3~11 g/L、L-半胱氨酸 0.2~1.0 g/L、生物素 0.002~0.006 g/L、无水乙醇 0~20 g/L、可溶性淀粉 0.5~1.0g/L。
在本发明的一种实施方式中，葡萄糖 30g/L、氯化钠 5g/L、酵母粉 10g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、乙酸钠 11 g/L、L-半胱氨酸 0.6 g/L、生物素 0.004 g/L、无水乙醇20g/L、可溶性淀粉1 g/L。
本发明还提供上述丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1发酵高产短链脂肪酸的方法，所述方法为，将上述丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1接种至发酵培养基中进行发酵，制备得到短链脂肪酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：葡萄糖 5~30 g/L、氯化钠 3~5 g/L、酵母粉 5~10 g/L、蛋白胨5~10 g/L、牛肉膏 5~10g/L、乙酸钠 3~11 g/L、L-半胱氨酸 0.2~1.0 g/L、生物素 0.002~0.006 g/L、无水乙醇 0~20 g/L、可溶性淀粉 0.5~1.0g/L。
在本发明的一种实施方式中，葡萄糖 30g/L、氯化钠 5g/L、酵母粉 10g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏 10g/L、乙酸钠 11 g/L、L-半胱氨酸 0.6 g/L、生物素 0.004 g/L、无水乙醇20g/L、可溶性淀粉 1 g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述短链脂肪酸包括但不限于乙酸、丁酸、己酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵条件为，将丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1菌种接种于适用于产短链脂肪酸的培养基内，控制温度35℃、pH 7.0、装液量90%静置培养9 d，并最终获得培养液的步骤。
在本发明的一种实施方式中，所述培养液中短链脂肪酸的含量通过GC-MS 法进行检测。
本发明还提供了丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1或所述微生物菌剂在制备富含短链脂肪酸的产品中的应用。
有益效果
（1）本发明提供了一种丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1，所述丁酸梭菌GD1-1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，该丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1菌株能够高效的制备短链脂肪酸，本发明通过优化了发酵培养基，提高了丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1对于短链脂肪酸的产量。
（2）本发明提供了一种利用丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1发酵高产短链脂肪酸的方法，采用本发明的方法，制备得到乙酸的产量可以达到1.66±0.12 g/L，丁酸的产量可以达到6.02±0.22 g/L，己酸的产量可以达到5.42±0.16 g/L。
生物材料保藏
一株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1，分类学命名为：Clostridium butyricum，已于2022年06月01日日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62455，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的菌落形态图。
图2：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的电镜图。
图3：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的镜检图。
图4：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的系统进化树图。
图5：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的酒精度耐受性图。
图6：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的温度耐受性图。
图7：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的pH耐受性图。
图8：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的乙酸耐受性图。
图9：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的丁酸耐受性图。
图10：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的己酸耐受性图。
图11：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的发酵周期图。
图12：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同碳源中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图13：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同氮源中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图14：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同葡萄糖添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图15：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同氮源添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图16：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同氯化钠添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图17：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同乙酸钠添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图18：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同L-半胱氨酸盐添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图19：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同生物素添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图20：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同无水乙醇添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图21：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同淀粉添加量中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图22：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同接种量时发酵液的短链脂肪酸产量图。
图23：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同温度下发酵液的短链脂肪酸产量图。
图24：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同pH中发酵液的短链脂肪酸产量图。
图25：本发明中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1在不同装液量时发酵液的短链脂肪酸产量图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
乙酸、丁酸和己酸含量的检测：
将丁酸梭菌GD1-1菌株接种到最优发酵培养基中在优化后的条件下培养，发酵结束后，用一次性的注射器吸取适量发酵液过 0.2 μm微孔滤膜；并取1mL装于进样瓶采用外标法通过GC/MS进行定性定量分析。测定GD1-1在发酵产乙酸、丁酸和己酸的情况。每个样品做三个重复。
气相色谱条件：DB-WAX UI谱柱(30 m×0 .25mm，0 .25 μm)，程序升温40℃保持1min， 以20 ℃/min升高至150℃，再以10 ℃升高至250 ℃保持2 min。分流比30:1，载气为氦气(He)， 流速1 mL/min，氢气(H2)40 mL/min，氧气(O2)300 mL/min，检测器为火焰离子检测器。
质谱条件：电子电离源，传输线温度250℃，电子能量为70eV，光电倍增管电压为350V，质量扫描范围为30～350 amu。
实施例1：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的获得
1、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GD1-1的分离和筛选
采用五点采样法采集了中国安徽省一家浓香型白酒工厂的窖泥样品。每点各取50g左右窖泥，混匀后装于塑封袋内，迅速置于冰盒内运回。称取窖泥样品10 g，加入盛有100mL无菌水及10粒玻璃珠（Φ=3mm）的三角瓶中，25℃，200 r/min，振荡20 min。
将窖泥悬浮液于80℃水浴10 min杀死营养体细胞，分别接种体积分数5%于富集培养基中，富集培养基含有以下物质（每1000 mL）：葡萄糖5 g，氯化钠5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，乙酸钠3 g，牛肉膏10 g，可溶性淀粉1 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1 L，pH6.8，121 ℃灭菌 20 min。在35 ℃下培养4天。然后吮吸200 μL窖泥培养液，涂在固体板上，放入厌氧瓶中，35 ℃培养至菌落生长。选择在平板上生长的单个菌落，并在固体平板上划线三次。
将单个菌落接种于100 mL厌氧瓶中，35 ℃厌氧培养12小时，培养2代，获得种子液。将种子液接种到接种量为5%的发酵培养基中，35 ℃厌氧静培养10天。
最终筛选出一株高产短链脂肪酸的菌株，将其命名为GD1-1。
2、丁酸梭菌GD1-1的鉴定
（1）菌株形态、培养特征观察
将步骤1复筛获得的己酸产率最高的菌株接种在RCM琼脂平板中，35℃培养18 h，观察菌株菌落形态可见菌株GD1-1的菌落边缘不规则（图1），菌落颜色为奶油色，在扫描电子显微镜下（图2~3），放大10000倍观察菌株GD1-1，菌体呈梭杆状，端圆、直或弯曲，产芽孢，显示为革兰氏阳性菌。
（2）生理生化特性测定
生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏系统细菌学手册》进行，生理生化实验结果如表1所示。
表1 生理生化鉴定结果
注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。
（3）菌株分子生物学鉴定及其系统发育树的构建
1）DNA的提取
将纯化后不同形态的单菌落接种至液体发酵培养基中，35 ℃培养10 d，吸取2 mL培养液于无菌离心管中，13000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集菌体沉淀(共2~3次)。菌体沉淀使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒并按操作步骤提取基因组DNA。
2）PCR扩增及系统发育树的构建
将步骤1）得到的DNA溶液作为扩增模板，采用细菌通用引物27F-1492R进行PCR扩增；PCR扩增体系为：5×Buffer(含Mg2+)10 μL，200 μmol/LdNTPs 1 μL，正反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，模板DNA 3 μL，加无菌水补足至50 μL；扩增条件为：94 ℃预变性4min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 .5 min，共 30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物在南京派森诺基因技术有限公司测序。测序序列通过BioEdit剪切后，将可靠序列片段上传至NCBI核酸比对网站进行比对，选取序列同源性最高的序列，使用MEGA 5 .0软件构建系统发育树。基于16SrDNA的系统发育进化树如图4所示。经测序鉴定，菌株GD1-1的16SrDNA序列为：
TTCCCGTAGAGTTCTCCCCCAATCGCTGACCCTACATTAGGTCGCTGCCTCGCTTACGCGTTAGCTCACGAACTTTGGGTATTGCCAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCAACTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTTCAGCCTACAATCCGAACTGAGATCGGTTTTATAGTTTTGCTCACTCTCGCGAGGTTGCATCTCATTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCCGGTTAACCCGGGCAGTCTCGCTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTTCCTGCCACCGAAGTGGCTTCCTCCATTACAGAGTAATTCAGGAGATGTCAAGTCTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATACTTAATGCGTTAGCGGCGGCACAGAGGTCATGACAACCCCTACACCTAGTATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGTGTCAGTTACAGTCCAGAAAGGCGCCTTCGCCACTGGTATTCTTCCTAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCTCCTTTCCTCTCCTGCACTCTAGATATCCAGTTTGGAATGCAGCACCCAGGTTAAGCCCGAGTATTTCACATCCCACTTAAATATCCACCTACGCTCCCTTTACGCCCAGTAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTCCTCCTTGGGTACCGTCATTATCGTCCCCAAAGACAGAGTTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCACTCACGCGGCGTTGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCTCATAGCGGATTACTCCTTTAATTGCTGTACCATGCGGTACTACAATCTTATGCGGTATTAATCTTCCTTTCGAAAGGCTATTCCCCTCTATGAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAATCCACTCCCGAAGAAGCTTCATCGCTCGACTTGCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAAATAAAAAAATCTTTA。
经过对GD1-1菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定GD1-1为丁酸梭菌Clostridium butyricum，且命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1。
实施例2：丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1耐受性检测
1、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的酒精耐受性检测
将实施例1得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种至在RCM液体培养基上，分别添加乙醇1 %vol、4 %vol、7 %vol、10 %vol、13 %vol、16 %vol后，在35℃的培养箱中厌氧培养36 h后，分别测定OD600nm，以波长600 nm处的OD值作为指标，考察丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的酒精耐受性。
结果如图5所示，随着酒精浓度的提高，菌体浓度不断下降，但在酒精浓度16 %vol时仍具有一定的生长能力，OD600nm约为0.9，耐受性较好。白酒糟醅的酒精浓度一般不超过10%vol，因此丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在白酒糟醅中均具有一定生存能力。
2、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的温度耐受性
将实施例1得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种至RCM液体培养基上，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃培养箱中厌氧培养36 h后，分别测定OD600nm，以波长600nm处的OD值作为指标，考察丁酸梭菌(Clostridium butyricum)GD1-1的温度耐受性。
结果如图6所示，在20~50 ℃的温度范围内，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)GD1-1均能够有效生长。其中最适生长温度分别为25℃。丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1温度适应范围广，能广泛适应不同季节白酒发酵，并具备应用于酱香型白酒发酵的潜质。
3、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的pH耐受性
将实施例1得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种至RCM液体培养基上，分别调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0后，在35℃培养箱中厌氧培养36 h后，分别测定OD600nm，以波长600 nm处的OD值作为指标，考察丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的pH耐受性。
结果如图7所示，当pH为4~5时，丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1具备有良好的生长能力，pH为7~8时，丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1达到最高生物量。继续提 pH至9.0，菌体浓度逐渐下降，但pH为10.0时，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)GD1-1仍能较好的生长。丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1具备一定程度的耐酸性，能够耐受白酒环境。
4、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的乙酸耐受性
将实施例1得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种至RCM液体培养基上，分别添加乙酸10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L后，在35℃培养箱中厌氧培养36 h后，分别测定OD600nm，以波长600 nm处的OD值作为指标，考察丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的乙酸耐受性。
结果如图8所示，随着乙酸含量的增加，菌体浓度逐渐下降，但丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在乙酸含量为40 g/L时仍能生长，具有很好的乙酸耐受能力。
5、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的丁酸耐受性
将实施例1得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种至RCM液体培养基上，分别添加丁酸10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L后，35℃培养箱中厌氧培养36 h后，测定分别OD600nm，以波长600 nm处的OD值作为指标，考察丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的丁酸耐受性。
结果如图9所示，随着丁酸含量的增加，菌体浓度逐渐下降，但丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在丁酸含量为30 g/L时仍能有效生长，具有很好的丁酸耐受能力。
6、丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的己酸耐受性
将实施例1得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种至RCM液体培养基上，分别添加己酸10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L后，35℃培养箱中厌氧培养36 h后，测定分别OD600nm，以波长600 nm处的OD值作为指标，考察己酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的己酸耐受性。
结果如图10所示，随着己酸含量的增加，菌体浓度逐渐下降，但丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在己酸含量为30 g/L以上时生长很微弱，丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1具有一定的己酸耐受能力，但不如丁酸耐受能力和乙酸耐受能力。
实施例3：丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1在产短链脂肪酸中的应用
具体步骤如下：
（1）配制RCM培养基斜面（每1000 mL）：
葡萄糖5 g，氯化钠5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，乙酸钠3 g，牛肉膏10 g，可溶性淀粉1 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 6.8，121 ℃灭菌 20 min。
（2）丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的活化
将已经保存的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种到RCM培养基斜面上，在35 ℃下培养24 h，制备得到丁酸梭菌GD1-1种子液。
（3）发酵制备短链脂肪酸
将步骤（2）制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液以5%（v/v）的接种量，接种至100 mLRCM发酵培养基内，在35℃温度下厌氧发酵，每24 h取样。采用 GC-MS 法测定发酵液中乙酸、丁酸和己酸含量，结果见图11及表2所示。
表2：丁酸梭菌GD1-1发酵制备短链脂肪酸
结果显示：在丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1的发酵周期中，0~3 d内，乙酸含量不断上升，超过3 d后呈缓慢下降趋势；
0~2 d内丁酸含量无明显变化，在第3 d开始产生丁酸，并在第7 d时达到峰值，随后丁酸含量呈下降的趋势。
0~3 d己酸含量无明显提升，4 d后己酸开始明显增加，在第9 d达到峰值，此时己酸产量最高为3.92±0.14 g/L，可确定丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的最佳发酵时间为9 d。
实施例4：优化培养基提高丁酸梭菌（Clostridium butyricumGD1-1）在产短链脂肪酸中的能力
本实施例中所涉及的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1菌株的种子液的制备步骤如下：
将活化好的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种到RCM活化培养基中，在35 ℃下培养12 h。
RCM活化培养基（每1000 mL）：葡萄糖5 g，氯化钠5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，乙酸钠3 g，牛肉膏10 g，可溶性淀粉1 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，蒸馏水1 L，pH 6.8，121℃灭菌20 min。
1、碳源的选择
（1）选取乙酸钠、葡萄糖、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖为碳源，添加量为10 g/L，分别添加至RCM发酵培养基中取代当中碳源（葡萄糖），其他成分、含量不变，分别制备得到含有不同碳源（10 g/L）的改良的RCM发酵培养基。
（2）种子液的制备：将已经保存的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1接种到RCM培养基斜面上，在35 ℃下培养24 h，从斜面上刮一环单菌落接种到25mL RCM液态培养基中，在35 ℃下培养12 h，得到丁酸梭菌GD1-1种子液；
将丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1种子液以5%（v/v）的接种量分别接种至步骤（1）得到的改良的RCM发酵培养基（不同碳源的培养基）中，在35℃温度下厌氧培养9 d后，检测短链脂肪酸的产量。在短链脂肪酸产量的基础上，确定丁酸梭菌GD1-1 的最佳碳源，结果见图12。
由图12可知，丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1 利用葡萄糖、果糖和蔗糖时表现出良好的短链脂肪酸产量，其中葡萄糖效果最好，己酸达到 4.12± 0.12 g/L，乙酸产量达到2.06±0.17 g/L，丁酸产量达到4.52 ±0.18 g/L。
单独使用乙酸钠作为碳源时，丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1几乎无短链脂肪酸产出。
2、氮源的选择
（1）选择氯化铵、硝酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和复合有机氮源（按照1:1:1比例配方的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉）作为氮源，添加量为10 g/L，分别添加至RCM发酵培养基中取代当中氮源（酵母膏和蛋白胨），其他成分、含量不变，分别制备得到含有不同氮源（10 g/L）的改良的RCM发酵培养基。
（2）按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并将种子液以5%（v/v）的接种量分别接种至上述改良的RCM发酵培养基（不同氮源的培养基）中，在35℃厌氧培养9天后，分析己酸的产量，确定C. butyricumGD1-1的最佳氮源。结果见图13。
从图13可见，丁酸梭菌C.butyricumGD1-1 利用有机氮源时产短链脂肪酸能力优于利用无机氮源，且使用酵母粉、蛋白胨、和牛肉膏组成的复合有机氮源时短链脂肪酸产量最高。因此，选用复合有机氮源作为C.butyricumGD1-1的氮源。
3、单因素优化GD1-1发酵培养基在确定RCM培养基的最佳碳源、氮源后，将RCM发酵培养基中的碳源、氮源分别更换为：10 g/L葡萄糖、10 g/L复合有机氮源（按照1:1:1比例配方的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉），其他成分、含量不变，得到RCM培养基-1。
在RCM培养基-1的基础上，分别确定葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、乙酸钠、可溶性淀粉、无水乙醇、生物素、和 L-半胱氨酸盐对于短链脂肪酸含量的影响。
（1）制备含有不同浓度的葡萄糖的改良的RCM培养基
在RCM培养基-1的基础上，将葡萄糖添加量分别更新为：5g/L、10g/L 、20 g/L 、30g/L 、40 g/L 、50 g/L，分别制备得到含有不同浓度的葡萄糖的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的葡萄糖的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9 d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的葡萄糖添加量葡萄糖对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图14所示，随着葡萄糖添加量的增加，丁酸梭菌C.butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量也在先增加后减少。当添加量达到3%时，三种酸产量均在最高点附近，总酸含量最高，因此，葡萄糖的最佳添加量为3%。
（2）制备含有不同浓度的氮源的改良的RCM培养基
在（1）中最优葡萄糖添加量的基础上，将复合氮源添加量分别更新为：0g/L、10g/L、15 g/L 、20 g/L 、25 g/L 、30 g/L、35 g/L、40 g/L， 分别制备得到含有不同浓度的复合氮源的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的复合氮源的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的氮源添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图15所示，随着氮源添加量的增加，丁酸梭菌C. butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量也在先增加后减少。当添加量达到30g/L时，三种酸产量均在最高点附近，总酸含量最高，因此，复合有机氮源的最佳添加量为30g/L。
（3）氯化钠对短链脂肪酸含量的影响
在上述最优葡萄糖添加量、最佳氮源添加量的基础上，将氯化钠添加量分别更新为：0 g/L、3g/L 、5 g/L 、7 g/L 、9 g/L， 分别制备得到含有不同浓度的氯化钠的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的氯化钠的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9 d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的氯化钠添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图16所示，随着氯化钠添加量的增加，丁酸梭菌C.butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量也在缓慢的增加。当添加量达到3 g/L时，总酸含量最高，因此，氯化钠的最佳添加量为3 g/L。
（4）乙酸钠对短链脂肪酸含量的影响
在上述最优葡萄糖添加量、最佳氮源添加量的基础上，将乙酸钠添加量分别更新为：0 g/L、3g/L 、5 g/L 、7 g/L 、9 g/L、11 g/L， 分别制备得到含有不同浓度的氯化钠乙酸钠的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的乙酸钠的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9 d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的乙酸钠添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图17所示，随着乙酸钠添加量的增加，丁酸梭菌C. butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量先增加后持平。当添加量达到7 g/L时，总酸含量最高，因此，乙酸钠的最佳添加量为7g/L。
（5）L-半胱氨酸对短链脂肪酸含量的影响
在上述最优葡萄糖添加量、最佳氮源添加量的基础上，将L-半胱氨酸添加量分别更新为：0 g/L、0.2 g/L 、0.4 g/L 、0.6 g/L 、0.8 g/L 、1 g/L， 分别制备得到含有不同浓度的L-半胱氨酸的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的L-半胱氨酸的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的L-半胱氨酸添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图18所示，随着L-半胱氨酸添加量的增加，丁酸梭菌C. butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量也在缓慢的增加后缓慢减少。当添加量达到0.4 g/L时，总酸含量最高，因此，L-半胱氨酸的最佳添加量为0.4 g/L。
（6）生物素对短链脂肪酸含量的影响
在上述最优葡萄糖添加量、最佳氮源添加量的基础上，将生物素添加量分别更新为：0 g/L、0.002 g/L 、0.004 g/L 、0.006 g/L 、0.008 g/L，分别制备得到含有不同浓度的生物素的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的生物素的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9 d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的生物素添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图19所示，随着生物素添加量的增加，丁酸梭菌C. butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量也在缓慢的增加。当添加量达到0.004 g/L时，总酸含量达到最高值，因此，生物素的最佳添加量为0.004 g/L。
（7）无水乙醇对短链脂肪酸含量的影响
在上述最优葡萄糖添加量、最佳氮源添加量的基础上，将无水乙醇添加量分别更新为：0 g/L、20 g/L 、40 g/L 、60 g/L 、80 g/L、100 g/L， 分别制备得到含有不同浓度的无水乙醇的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的无水乙醇的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的无水乙醇添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图20所示，随着无水乙醇添加量的增加，丁酸梭菌C. butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量先增加后减少。当添加量达到20 g/L时，总酸含量达到最高值，因此，无水乙醇的最佳添加量为20g/L。
（8）可溶性淀粉对短链脂肪酸含量的影响
在上述最优葡萄糖添加量、最佳氮源添加量的基础上，将可溶性淀粉添加量分别更新为：0 g/L、0.5 g/L 、1.0 g/L 、1.5 g/L 、2.0 g/L、2.5 g/L， 分别制备得到含有不同浓度的可溶性淀粉的改良的RCM培养基；
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）的接种量接种于上述含有不同浓度的可溶性淀粉的改良的RCM培养基中，在35℃静置培养9d，初始pH为6.8，以发酵液中短链脂肪酸含量为指标，研究不同的可溶性淀粉添加量对短链脂肪酸含量的影响。
结果如图21所示，随着可溶性淀粉添加量的增加，丁酸梭菌C. butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量缓慢增加。当添加量达到1.0 g/L时，总酸含量达到最高值，因此，可溶性淀粉的最佳添加量为1.0 g/L。
4、培养条件优化
在优化完成后的C.butyricumGD1-1发酵培养基的基础上，通过单因素实验优化C.butyricumGD1-1 产短链脂肪酸发酵条件，单因素主要为接种量、温度、初始pH和装液量。
（1）接种量对短链脂肪酸含量的影响
RCM改良培养基的制备：葡萄糖 30g/L、氯化钠 3g/L、酵母粉 10g/L、蛋白胨 10g/L、牛肉膏 10g/L、乙酸钠 7 g/L、L-半胱氨酸 0.4 g/L、生物素 0.004 g/L、无水乙醇 20g/L、可溶性淀粉 1g/L 。
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并分别将种子液按5%（v/v）、3%（v/v）、6%（v/v）、9%（v/v）、12%（v/v）的接种量接种于上RCM改良培养基中，初始 pH 为 7,35℃下静置培养 9 d，研究不同接种量5%（v/v）、3%（v/v）、6%（v/v）、9%（v/v）、12%（v/v）对C.butyricumGD1-1 产短链脂肪酸的影响。
结果显示：相同培养条件下，随着接种量的增加，菌株C.butyricumGD1-1的短链脂肪酸产量随之增加，当接种量为 7%时，总酸产量最高（图22）；
（2）温度对短链脂肪酸含量的影响
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并将种子液按5%（v/v）的接种量接种于RCM改良培养基中，初始 pH 为 7，分别在 31℃、34℃、37℃、40℃条件下静置9d后，测定在不同温度条件下发酵9 d后的短链脂肪酸含量。
结果显示：在温度实验范围内，菌株C.butyricumGD1-1短链脂肪酸随温度的提高而增大，35℃时总酸产量达到最高，随后随着温度的升高，短链脂肪酸产量开始下降（图23）；
（3）初始 pH 对短链脂肪酸含量的影响
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并将种子液按5%（v/v）的接种量接种于RCM改良培养基中，分别在pH 4.0、5.0、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、8.0、9.0，温度 35℃，发酵时间为：9 d，测定不同pH条件下短链脂肪酸含量。
结果显示：菌株C.butyricumGD1-1 在中性条件下短链脂肪酸产量较好（图24）。当4<pH<7 时，短链脂肪酸产量随 pH 升高而升高，当pH＞7 时，pH 上升短链脂肪酸产量下降；
（4）装液量对短链脂肪酸含量的影响
按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液，并将种子液按5%（v/v）的接种量接种于RCM改良培养基中，初始 pH 为 7，温度 35℃，分别将装液量设置为 30%、40% 、50% 、60% 、70% 、80%和90%，发酵时间为：9d，检测发酵结束后溶液中短链脂肪酸含量。
结果显示：菌株C.butyricumGD1-1 短链脂肪酸的产量随装液量的提升而增加，在装液量90%时达到峰值（图25）。最终确定菌株C.butyricumGD1-1最优发酵条件为：接种量为7%、温度 35℃、pH 7、装液量 90%。
5、按照步骤1的方法制备得到的丁酸梭菌GD1-1种子液；将菌株C.butyricumGD1-1种子液接种于含有葡萄糖 30g/L、氯化钠 3g/L、酵母粉 10g/L、蛋白胨 10g/L、牛肉膏10g/L、乙酸钠 7 g/L、L-半胱氨酸 0.4 g/L、生物素 0.004 g/L、无水乙醇 20g/L、可溶性淀粉 1g/L的改良RCM培养基中，接种量为 7%，在温度 35℃、pH 7条件下进行发酵，同时设置装液量为90%，培养9 d后，用一次性的注射器吸取适量发酵液过 0.2 μm微孔滤膜；并取1mL装于进样瓶采用外标法通过GC/MS进行定性定量分析。测定GD1-1在发酵产乙酸、丁酸和己酸的情况。每个样品做三个重复。结果如表3所示。
表3 短链脂肪酸产量
结果显示，本发明的菌株GD1-1能够高产短链脂肪酸。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种丁酸梭菌(Clostridium butyricum) GD1-1，其特征在于，所述丁酸梭菌GD1-1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62455，保藏日期为2022年06月01日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的丁酸梭菌GD1-1或其发酵液，或丁酸梭菌GD1-1裂解物，或丁酸梭菌GD1-1冻干粉。
3.权利要求1所述的丁酸梭菌GD1-1在制备短链脂肪酸中的应用。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的丁酸梭菌GD1-1活菌株、丁酸梭菌GD1-1干菌株、丁酸梭菌GD1-1代谢物、灭活的丁酸梭菌GD1-1中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述丁酸梭菌GD1-1在组合物中的添加量：OD600值至少为1.2。
6.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述的丁酸梭菌GD1-1；所述产品包括饲料添加剂、食品添加剂、窖泥强化剂、白酒风味物质调和剂、生物燃料或药品。
7.一种生产短链脂肪酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的丁酸梭菌GD1-1种子液添加至培养基中发酵制备得到短链脂肪酸；所述培养基包括：葡萄糖 5~30 g/L、氯化钠3~5 g/L、酵母粉 5~10 g/L、蛋白胨5~10 g/L、牛肉膏 5~10g/L、乙酸钠 3~11 g/L、L-半胱氨酸 0.2~1.0 g/L、生物素 0.002~0.006 g/L、无水乙醇 0~20 g/L和可溶性淀粉 0.5~1.0g/L。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、丁酸和己酸。
9.权利要求1所述的丁酸梭菌GD1-1或权利要求2所述的微生物菌剂在制备富含短链脂肪酸的产品中的应用。
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