CN103013870B - 一种2, 3-丁二醇高产菌株及其筛选方法和发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种2, 3-丁二醇高产菌株，其特征在于：名称为Serratia marcescens G12，分类命称为Serratia marcescens，保藏编号为：CGMCC No. 6770，保藏日期： 2012 年 11 月 02 日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明2, 3-丁二醇高产菌株为生产2, 3-丁二醇的理想的候选菌株，其发酵后2, 3-丁二醇的产量达到37.4 g/L，底物转化率达到理论转化率的79.62%。

Description

一种2, 3-丁二醇高产菌株及其筛选方法和发酵方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及2, 3-丁二醇生产菌株，尤其是一种2, 3-丁二醇高产菌株及其筛选方法和发酵方法。

背景技术

2, 3-丁二醇（2, 3- butanediol，2, 3-BD），又称二甲基甲醇，2, 3-丁二醇是一种无色无味的液体，吸水性很强，熔点是23-27°C，沸点是178-182°C，冰点-60°C，能与水混溶，溶于乙醇、乙醚。

2, 3-丁二醇可以作为重要的化工原料和药物中间体。有较低的凝固点可以作为防冻剂，2, 3-丁二醇及其衍生品可以用做塑料、溶剂和药物载体；脱氢可形成双乙酰和乙偶姻，它们在日常生活中作为增味剂、人造奶油和化妆品。

化学合成2, 3-丁二醇是以石油裂解时产生的四碳碳氢化合物为原料，通过高温高压水解获得，但此方法不易操作，并且由于石油资源的短缺和石油化学产品价格的增长，很难实现工业化生产，微生物生产2, 3-丁二醇克服了化学法的困难，受到人们的关注。

2, 3-丁二醇是微生物混合酸代谢途径的代谢产物，产生2, 3-丁二醇的微生物主要有肺炎克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、产气肠杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和粘质沙雷氏菌等。在这些微生物中，粘质沙雷氏菌是革兰氏阴性菌并且在环境中存在较广。粘质沙雷氏菌能在5-40°C和pH 5-9的环境下生长，另外，粘质沙雷氏菌的能利用的底物范围较广，它经常被用作生产2, 3-丁二醇的研究，具有较好的应用前景。

在大多数微生物代谢过程中，乙偶姻是2, 3-丁二醇代谢的副产物，并且2, 3-丁二醇是乙偶姻代谢的终产物。因此，先通过丙酮酸钠固体平板法、MR-VP实验初筛生产乙偶姻的微生物，再利用气相色谱检测微生物生产2, 3-丁二醇的产量。

通过检索，发现与专利申请相关的如下几篇专利公开文献：

1、一株短小芽孢杆菌及其在生产2, 3-丁二醇中的应用（CN102041240A），公开了一株产2, 3-丁二醇的短小芽孢杆菌，其中所述短小芽孢杆菌定名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) SDM，该菌已于2010年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCCNo. M2010307。本发明所述菌株能以可再生资源为碳源，通过溶解氧分段控制策略，得到2, 3-丁二醇的浓度达到70 g/L，生产强度为1.46 g/L.h。且所述菌株具有生物安全性，发酵生产的2, 3-丁二醇具有广泛的用途。

2、利用秸秆生产2, 3-丁二醇菌种筛选及发酵方法（CN101967457A），本发明首先提供从活性污泥中筛选产2, 3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的方法，经过筛选得到产2, 3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的菌株YB-4，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005。同时提供了利用该菌株发酵秸秆生产2, 3-丁二醇的方法：该菌株在以汽爆秸杆为碳源，酵母膏为氮源的发酵培养基中30-37℃培养4-7d后，2, 3-丁二醇的产量为秸秆干重的8％-12％(2, 3-丁二醇/秸秆干重，W/W)。本发明为以秸秆原料生产2, 3-丁二醇，不需要添加纤维素酶，大幅度降低了生产成本。

3、肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2, 3-丁二醇的方法（CN101531979），涉及肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2, 3-丁二醇的方法，肺炎克雷伯氏菌为Klebsiella pneumoniae ECU-21，保藏编号为CGMCC No.2850，其制备方法为：从平板上取一环菌落接入种子培养基，接种后的种子培养基置于 37℃培养箱中静置培养，后将培养12小时后的种子培养基转接至发酵培养基进行发酵培养；接种后用橡胶塞密封发酵摇瓶，并通入N₂吹扫使之形成厌氧培养环境，多余气体由排气口排出，气体排净后用气袋连接排气口收集发酵产生的氢气，液相产物中得到2, 3-丁二醇；培养温度为37℃，采用磁力搅拌器进行搅拌，转速为150 rpm，培养时间为12～15h。本发明的优点：在厌氧的条件下发酵联产氢气和2, 3-丁二醇，增加了生产的附加值，且反应条件简单易行，具有广阔的工业应用开发前景。

通过对比，本发明专利申请与上述几篇专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的是通过从未加工的牛奶中分离到能高产2, 3-丁二醇的菌株，为生产2, 3-丁二醇的提供较广的理想候选菌株，并且通过单因素试验和正交试验设计对筛选到的菌株培养基进行优化，提供一种降低生产成本的生产2, 3-丁二醇的方法以及降低筛选成本、减少工作量、提高效率的2, 3-丁二醇高产菌株的筛选方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种2, 3-丁二醇高产菌株，名称为Serratia marcescens G12，分类命名为粘质沙雷氏菌 Serratia marcescens，保藏编号为：CGMCC No. 6770，保藏日期： 2012 年 11月 02 日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

一种2, 3-丁二醇高产菌株发酵生产2, 3-丁二醇的方法，发酵培养基为：每L中含有：甘油130 g、蛋白胨16 g、酵母粉5g、K₂HPO₄ 1g和MnSO₄?7H₂O 0.025 g，余量为水。

而且，发酵的接种与培养条件为：按1-10%的种子液接种量，将Serratia marcescens G12种子液接入发酵培养基中，培养温度30-40°C，在摇床上150-170rpm振荡培养70-75h。

而且，发酵的接种与培养条件为：按5%的种子液接种量，将Serratiamarcescens G12种子液接入发酵培养基中，培养温度35°C，在摇床上160 rpm振荡培养72 h。

而且，发酵培养后2, 3-丁二醇的产量达到37.400 g/L，底物转化率达到理论转化率的79.62%。

一种2, 3-丁二醇高产菌株的筛选方法，筛选过程中采用丙酮酸钠固体平板法、MR-VP实验法和气相色谱法。

而且，所述的2, 3-丁二醇高产菌株的筛选方法步骤如下：

⑴在无菌条件下取未加工的牛奶样品和质量浓度为0.9%的无菌生理盐水按体积比为1：9的比例混均，依次稀释到10^-6后，涂布在丙酮酸钠培养基中,35°C培养24-48h，观察结果；

⑵挑选在丙酮酸钠培养基上变红的菌落接种到MR-VP培养液中，于转速220 rpm，35°C下培养48 h后，取出部分MR-VP培养液，按每2 mL培养液加入5滴甲基红的比例向其中加入甲基红；再向剩余的培养液中按每3 mL MR-VP培养液加入0.6 mL的α-甲萘酚和每3 mLMR-VP培养液加入0.2 mL的质量分数为40% KOH的比例加入α-甲萘酚和KOH，静置20 min，观察液体颜色变化；

⑶选取 MR-VP实验中加入甲基红变黄并且加入α-甲萘酚和KOH时，发酵液变红的菌株，接种、发酵培养后，取上清液使用气相色谱法检测2, 3-丁二醇和乙偶姻的含量，选取在相同培养基和培养条件下2,3-丁二醇产量较高，而副产物乙偶姻的产量较低的菌株，即为所需2,3-丁二醇生产菌株。

而且，所述的2, 3-丁二醇高产菌株的筛选方法，所述步骤⑶中气相色谱法的条件为：

上清液离心后用0.22 μm的膜过滤；

内标物：异戊醇；

具体气相条件为：起始柱温95°C保留1 min；然后以10°C /min升到150°C，150°C保留2 min；最后2°C /min升到160℃，保留2min；氮气、氢气和空气流速分别是2、30、250 mL/min；

进样口和氢气火焰检测器的温度是250°C。

本发明的优点和积极效果是：

⑴本发明2, 3-丁二醇高产菌株为生产2, 3-丁二醇的理想的候选菌株，其发酵后2, 3-丁二醇的产量达到37.4 g/L，底物转化率达到理论转化率的79.62%。

⑵本发明2, 3-丁二醇高产菌株发酵生产2, 3-丁二醇的方法的培养基为通过单因素试验和正交试验设计对该菌株的培养基进行优化后确定的，该菌株能利用甘油高产2, 3-丁二醇，在利用甘油为碳源时，发酵液中pH较稳定，且甘油为生产生物柴油的副产物，可以降低微生物生产2, 3-丁二醇的成本和增加生产生物柴油的价值，为生物柴油副产物甘油的利用提供一条途径，为微生物生产2, 3-丁二醇的工业化提供技术支持。

⑶本发明2, 3-丁二醇高产菌株的筛选方法采用丙酮酸钠固体平板法和MR-VP实验法筛选代谢产生乙偶姻、双乙酰等中性物质的菌株，通过气相色谱法进一步定量检测菌株生产2, 3-丁二醇的能力，筛选到高产2, 3-丁二醇的菌株，与直接通过发酵培养，气相色谱法定量检测方法相比，降低筛选成本，减少工作量，提高筛选效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均为市售产品；所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的仪器如无特殊说明，均为常规仪器。

一种2, 3-丁二醇高产菌株，名称为Serratia marcescens G12，分类命名为粘质沙雷氏菌 Serratia marcescens，保藏编号为：CGMCC No. 6770，保藏日期： 2012 年 11 月 02 日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明从未加工牛奶中分离到一株产2, 3-丁二醇的菌株#12，其16SrRNA基因序列分析结果显示，该菌株为粘质沙雷氏菌。通过单因素试验和正交试验设计获得优化培养基配方：甘油（130 g/L）、蛋白胨（16 g/L）、酵母粉（5g/L）、K₂HPO₄（1 g/L）和MnSO₄?7H₂O（0.025 g/L）。确认实验发酵结果显示，2, 3-丁二醇的产量达到37.4 g/L，底物转化率达到理论转化率的79.62%。实验结果表明该菌为生产2, 3-丁二醇的理想的候选菌株。

一种2, 3-丁二醇高产菌株的筛选方法和发酵方法，包括以下步骤：

（1）生产2, 3-丁二醇微生物的筛选

在无菌条件下取0.1 mL牛奶样品和0.9 mL的无菌生理盐水混均，即稀释10倍，依次稀释到10^-6，取100μl涂布在丙酮酸钠培养基固体平板中，35°C培养24 h观察结果。

挑选在丙酮酸钠培养基上变红的菌落接种到5 mL MR-VP培养基中。摇床转速220 rpm，35°C下培养48 h后取2 mL培养液加入5滴甲基红，培养液将变成红色或黄色，其取决于微生物代谢合成什么样的产物。向剩余的培养液中加入0.6 mL的α-甲萘酚和0.2 mL的40% KOH，静置20min，观察液体颜色变化。

 在MR-VP筛选的菌株接种到5 mL液体种子培养基中，在35°C、220rpm振荡培养16 h。取1mL种子液接种量接种到30 mL种子培养基中35°C、160 rpm培养8 h作为二级种子。按5%的接种量接种到30 mL（容量250 mL三角瓶）发酵培养基中，然后35°C培养72 h，发酵液12000 rpm离心10 min。取上清液用气相色谱检测2, 3-丁二醇和乙偶姻的含量。

（2）2, 3-丁二醇的气相色谱分析

2, 3-丁二醇和乙偶姻的测定利用Aglient 7890A HP-INNOWax 1909IN-213(30 m*0.32 mm*0.25 μm)。上清液离心后再用0.22 μm的膜过滤。内标物：异戊醇。具体气相条件为：起始柱温95°C保留1min；然后以10°C /min升到150°C，150℃保留2min；最后2°C/min升到160°C，保留2 min；氮气、氢气和空气流速分别是2、30、250 mL/min。进样口和氢气火焰检测器的温度是250°C。

（3）菌株16S rRNA 分离鉴定

酚-氯仿提取法提取12菌株16S rRNA，通用引物27F和1492R为引物PCR扩增菌株的16S rRNA。

引物序列如下：

27F： 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’

1492R：5’ACGGGCGGTGTGTRC 3’ 。

PCR扩增体系50μL，扩增条件为：

①：94°C预变性5min；②：94°C变性40s，51°C退火2min，72°C延伸3min，运行33个循环；3：72°C延伸10min。

PCR 产物经过纯化后，进行DNA 序列测定。将所得的DNA序列通过Blast检索，在GenBank中的已知序列中进行同源性分析，确定与分离菌株同源程度最高的序列，利用Ribosomal Database Project II软件Classifier，对分离的菌株进行分类。

（4） 分离菌株发酵培养基优化

挑取单菌落接种到含5 mL种子液的试管中，35°C在摇床上220 rpm振荡培养16 h。再吸取1 mL种子接种到30 mL种子液中，35°C在摇床上160 rpm振荡培养8 h。按5%的接种量接到30 mL发酵培养基中35°C在摇床上160 rpm振荡培养72 h。

利用单因素实验分析碳源和氮源的种类及浓度、生长因子的浓度对2,3-丁二醇产量的影响。即以基础培养基为基础分别以麦芽糖、甘油、木糖、葡萄糖、果糖、柠檬酸钠为碳源，研究不同碳源对2, 3-丁二醇产量的影响；以蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、尿素、玉米浆氮源，研究不同氮源对2, 3-丁二醇产量的影响；再分析碳源、氮源、生长因子浓度对2, 3-丁二醇产量的影响。

通过正交试验设计确定最优的培养基。

采用上述方法筛选保藏编号为：CGMCC No. 6770的2, 3-丁二醇高产菌株，步骤如下：

一、生产2, 3-丁二醇微生物的筛选

目的菌的筛选：在无菌条件下取0.1 mL未加工的牛奶样品和0.9 mL的无菌生理盐水（盐浓度0.9%）混均，即稀释10倍，依次稀释到10^-6，取100μl涂布在丙酮酸钠培养基（丙酮酸钠培养基配方为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨 10.0 g/L，玉米浆 5.0 g/L，硫酸锰 0.05g/L，丙酮酸钠 5.0 g/L，氯化钠 5.0 g/L，琼脂 15.0 g/L）中，35°C培养48 h，然后上层培养基（上层培养基：固体丙酮酸钠培养基加热融化后，冷却至40-50°C，然后添加质量分数为0.5%肌酸3 ml和质量分数为7.5%的α-甲萘酚3 ml。）摇匀后立即倒入上述丙酮酸钠培养基平板上。

挑选在丙酮酸钠培养基上变红的菌落接种到5 mL MR-VP培养基（蛋白胨 7 g/L、葡萄糖 5 g/L、磷酸氢二钾 5 g/L，pH 7.0）中。于摇床转速220 rpm，35°C下培养48 h后，取2 mLMR-VP培养液加入5滴甲基红。再向剩余的培养液中加入0.6 mL的α-甲萘酚和0.2mL的40% KOH，静置20 min，观察液体颜色变化。当加入甲基红时发酵液变黄，表示菌株不产酸或只产少量酸，当加入α-甲萘酚和KOH时，发酵液变红，说明菌株代谢产生乙偶姻或双乙酰。

二、气相色谱定量检测2, 3-丁二醇

选取 MR-VP实验中加入甲基红变黄并且加入α-甲萘酚和KOH时，发酵液变红的菌株接种到5 mL液体种子培养基中，在35°C、220 rpm振荡培养16 h。取1 mL种子液接种量接种到30 mL种子培养基中35°C、160 rpm培养8h作为二级种子。按5%的接种量接种到30 mL（容量250 mL三角瓶）发酵培养基中，然后35°C培养72h，发酵液12000rpm离心10 min。取上清液用气相色谱检测2, 3-丁二醇和乙偶姻的含量。

气相色谱检测条件如下：

2, 3-丁二醇和乙偶姻的测定利用Aglient 7890A HP-INNOWax 1909IN-213(30 m*0.32 mm*0.25 μm)；

上清液离心后再用0.22 μm的膜过滤；

内标物：异戊醇。具体气相条件为：起始柱温95°C保留1 min；然后以10°C /min升到150°C，150°C保留2 min；最后2°C /min升到160°C，保留2 min；氮气、氢气和空气流速分别是2、30、250 mL/min；

进样口和氢气火焰检测器的温度是250°C。

三、菌株16S rRNA 分离鉴定：酚-氯仿提取法提取菌株G12 16SrRNA，通用引物27F和1492R为引物PCR扩增菌株的16S rRNA。引物序列如下：

27F： 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’

1492R：5’ACGGGCGGTGTGTRC 3’ 。

PCR扩增体系50 μL，扩增条件为：

①：94°C预变性5 min；②：94°C变性40 s，51°C退火2 min，72°C延伸3 min，运行33个循环；③：72°C延伸10 min。

PCR 产物经过纯化后，进行DNA 序列测定。将所得的DNA序列通过Blast检索，在GenBank中的已知序列中进行同源性分析，确定与分离菌株同源程度最高的序列，利用Ribosomal Database Project II软件Classifier，对分离的菌株进行分类。

分析结果显示菌株G12与Serratia marcescens Db11同源度达到98%，确定为Serratia marcescens ，命名为Serratia marcescensG12。

四、分离菌株发酵培养基优化

⑴种子培养：挑取单菌落接种到含5 mL种子培养基（葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，硫酸铵 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L。调pH为7.0）的试管中，35℃在摇床上220rpm振荡培养16 h。再吸取1 mL种子接种到30mL种子培养基中，35°C在摇床上160 rpm振荡培养8 h。

⑵单因素实验对筛选到的Serratia marcescens G12培养基优化

碳源种类的优化：在培养基：酵母膏 5 g/L，玉米浆 20 g/L，MnSO₄ 0.025 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，pH7.0的基础上分别添加100g/L的麦芽糖、甘油、木糖、葡萄糖、果糖、柠檬酸钠为碳源，即为发酵培养基，按5%的接种量把培养好的种子接种到30 mL（容量250 mL三角瓶）发酵培养基中，然后35°C培养72 h。按实施例2气相检测条件分析，以甘油为碳源2, 3-丁二醇的产量最高。

甘油浓度的优化：在培养基：酵母膏 5 g/L，玉米浆 20 g/L，MnSO₄ 0.025 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，pH7.0的基础上添加甘油使甘油浓度分别达到80、90、100、110、120、130、140g/L。按5%的接种量把培养好的种子接种到30 mL（容量250 mL三角瓶）发酵培养基中，然后35°C培养72 h。按实施例2气相检测条件分析，当甘油浓度为120 g/L时2, 3-丁二醇产量最高。

按碳源种类优化培养基的方法优化发酵培养基的氮源（甘油 120 g/L，酵母膏 5 g/L，MnSO₄ 0.025 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，pH7.0，分别以10 g/L的玉米浆、蛋白胨、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl为氮源），以蛋白胨为氮源时，2, 3-丁二醇的浓度最高。

按甘油浓度优化的方法优化蛋白胨浓度（蛋白胨浓度分别为6、8、10、12、14、16、18、20 g/L），当蛋白胨浓度14 g/L时，2-3-丁二醇的产量最高。

酵母粉含有多种微生物生长所需的微量元素，因此酵母粉浓度对2,3-丁二醇的产量有很大影响。按甘油浓度优化的方法优化酵母粉的浓度（甘油120 g/L，蛋白胨14 g/L，MnSO₄ 0.025 g/L，K₂HPO₄1 g/L，pH7.0，酵母粉的浓度分别为0、3、5、7、9、11、13 g/L），考虑酵母粉的价格较高，当酵母粉浓度为5 g/L为最适浓度。

⑶结合单因素试验，选取甘油、蛋白胨、酵母粉为对象，设计了3因素3水平正交试验方案，见表1。

表 1 正交试验因素与水平

表2正交实验结果

结果见表2，通过根据极差分析的结果可以看出：对2, 3-丁二醇合成影响的主次顺序：酵母粉﹥甘油﹥蛋白胨，最佳组合为A₃B₃C₂，即最优的培养基组成：甘油130 g/L，蛋白胨16 g/L，酵母粉 5 g/L，MnSO₄ 0.025 g/L和K₂HPO₄ 1 g/L。通过验证试验，优化后的培养基2, 3-丁二醇的产量达到37.400 g/L，底物转化率达到理论转化率的79.62%。

Claims (5)

1.一种2,3-丁二醇高产菌株，其特征在于：名称为Serratia marcescens G12，分类命称为Serratia marcescens，保藏编号为：CGMCC No.6770，保藏日期：2012年11月02日，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种如权利要求1所述的2,3-丁二醇高产菌株发酵生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于：发酵培养基为：每升中含有：甘油130g、蛋白胨16g、酵母粉5g、K₂HPO₄1g和MnSO₄·7H₂O0.025g，余量为水。

3.根据权利要求2所述的发酵生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于：发酵的接种与培养条件为：按1-10%的种子液接种量，将Serratia marcescens G12种子液接入发酵培养基中，培养温度30-40℃，在摇床上150-170rpm振荡培养70-75h。

4.根据权利要求3所述的发酵生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于：发酵的接种与培养条件为：按5%的种子液接种量，将Serratia marcescens G12种子液接入发酵培养基中，培养温度35℃，在摇床上160rpm振荡培养72h。

5.根据权利要求2所述的发酵生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于：发酵培养后2,3-丁二醇的产量达到37.400g/L，底物转化率达到理论转化率的79.62%。