CN102041278A - 一种生产丁二醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产丁二醇的方法，采用种子培养基活化粘质沙雷氏菌，再分别进行摇床培养和3.7L生物反应器培养，从而制得含有含有2，3-丁二醇的发酵培养液。本发明的优点：提高了2，3-丁二醇的产量，转化率以及生产能力，解决了菌体污染和资源的回收利用问题；可以节能减排。

Description

一种生产丁二醇的方法

【技术领域】

本发明涉及生产2，3-丁二醇技术领域，具体地说，是一种生产丁二醇的方法。

【背景技术】

2，3-丁二醇(2，3-butanediol，简称BD，下同)广泛应用于化工、食品以及航空航天等各个领域，其热值27200kJ/kg，同乙醇(29100kJ/kg)接近，可用作燃料，还可用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、香熏剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等。它脱水成甲乙酮，可用作树脂、油漆的溶剂；脱水成丁二烯，可用于合成橡胶；它还可以代替1，4～丁二醇，用于聚酯和聚亚安酯的合成；同甲乙酮缩合并进行加氢形成辛烷，可用来生产高级航空用油。2，3-丁二醇与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可加到奶油中改善风味；在我国2，3-丁二醇还被添到白酒中，以改善白酒的风味。

目前的生物技术领域相关工业的发酵体积已位居世界前3位，每年产生的废菌体已达500万吨，生产如此巨量的废菌体需消耗大量能源(电、热、水等)和资源(粮食资源、有机和无机氮等)，而限于我国当前的行业整体水平，这些废菌体的回收利用和环保处理水平低下，其结果是造成能源和资源的极大浪费和严重的环境污染。

我国经济发展的目标是促进经济的可持续发展，因此，资源的回收利用极为重要。资源短缺、环境恶化和人口增加，三因素迭加已经成为制约我国经济社会稳定、快速发展的最大制约力。因而国家提出，“十一五”期间节能减排目标是单位国内生产总值能耗降低20％左右、主要污染物排放总量减少10％，这是建设资源节约型、环境友好型社会的必然选择；是推进经济结构调整，转变增长方式的必由之路。

回收发酵液中的粘质沙雷氏菌的菌体，不仅可以显著提高发酵生产2，3-丁二醇的生产率(缩短发酵时间)、主要生物质碳源的转化率和产物产量，还可以大大减少菌体排放对环境的污染问题。

大量微生物菌体在失活后被用来当做肥料，可以通过液体直接形成肥料，也可以是固体底物的堆积肥料；还有些菌体常被作为废物处理，在污水处理厂中分解，或是被燃烧。

目前回收利用菌体的方法主要有：破壁提取菌体可溶性成分，作为微生物培养的培养基成分，其中包括机械破碎法和菌体自溶法；利用活菌体，即生产过程直接回收利用活菌体。如啤酒生产中酵母的部分回收利用；环境保护中活性污泥的回收利用。

前者研究的比较多，主要有：(1)德国比勒费尔德大学研究了克雷伯氏菌的发酵和大肠杆菌B-3996的重组株发酵生产L-苏氨酸过程中的菌体回收利用，用高压匀浆法和蛋白酶处理法来降解和溶解细菌菌体细胞，处理后的菌体以培养基的形式被放回原过程中进行再利用；(2)生产工业酶和抗生素等产品的需氧过程中产生了大量的废菌体，可把这些菌体用做饲料和食物成分，或是作为发酵培养基的成分，将细菌的细胞分解，可溶的部分与不可溶的残留物分离，对生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌体和生产核黄素的枯草芽孢杆菌进行洗涤和浓缩，再进行菌体的自溶或加酶增加其自溶能力，但通过自溶，蛋白质的完全水解是不可能的，所以提取物的进一步处理很必要；(3)菌体循环作为改进藻类培养系统能量效率的一种方法：藻类的培养是通过增加碳源来实现的，既能代替又能补充光，水解藻类菌体能作为这些藻类生长的碳源和能源，在闭合系统中这个循环过程很重要；(4)生产丁醇和丙酮的丙酮丁醇梭菌菌体的回收利用：此发酵过程可为连续和分批培养，将培养基放入超滤区，则包含菌体的残留物部分循环进入发酵区，从而进行循环利用；(5)将菌体进行干燥，干燥后回收的菌体与生产过程的菌体混合；(6)啤酒生产中酵母的部分回收利用：啤酒发酵后，大量的泥状酵母可制成干燥酵母，既可压成片状供药用，也可做为饲料的添加剂，提高饲料的营养成份。

活菌体的利用实例主要有：(1)啤酒生产中的酵母，除了破壁利用，还可以回收利用其活菌体，继续酿造啤酒；(2)环境保护中，处理污水时，常用活细菌、原生动物和其他微生物的凝絮团吸附、分解有机物或毒素，这种活性污泥常被回收再利用。

华东理工大学(本申请人)公开了一种发酵生产2，3-丁二醇的方法，中国公开号CN1884560，将粘质沙雷氏菌种子液接种于培养基中，通入空气，搅拌，RQ控制在0.9～1.2之间；然后补入产物促进因子，补充蔗糖水溶液和氨基酸水溶液，RQ控制在1.5～1.8之间；最后补入蔗糖水溶液将RQ控制在1.9～2.2之间，发酵培养，即获得含有2，3-丁二醇的发酵培养液。利用粘质沙雷氏菌发酵生产2，3-丁二醇已有很大进展，但是发酵生产过程中产生的大量菌体的排放不仅是一个严重的环境问题，而且还导致大量碳源氮源等生物质资源的流失，对节能减排带来压力。

现存的回收利用菌体可溶性成分的方法均为资源回收利用的有效方法，但是，这个过程常包含溶解、过滤、分离和干燥等不可缺少的阶段，因此也会造成资源能源的浪费，不能实现节能减排的最终目的；而回收利用活菌体的实例目前研究的比较少，因此，回收利用活菌体来提高产物产量、提高生物质资源利用率和减少能源消耗是本领域迫切需要研究发展的新方法。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生产丁二醇的方法，以提高生物质资源利用率、减少能源消耗和促进清洁生产。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

(1)采用种子培养基活化粘质沙雷氏菌：

种子培养基中的组分按重量百分比为：葡萄糖0.5～1.5％，酵母粉0.01～1％，蛋白胨0.01～1％，硫酸铵0.1～1％，磷酸二氢钾30～50％，氯化钠0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，水为余量；灭菌后接种前用无菌的氢氧化钠溶液将摇瓶种子液调至pH 6.5～7.8，把甘油管保藏的种子接入种子培养基中；在温度为28～32℃，转速185～195r/min，摇瓶培养12小时(h)，以5％的接种量转接一次，同样的条件下摇瓶培养，摇瓶的装液量为500ml三角瓶装50ml种子液；

所述的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的，编号为粘质沙雷氏菌CICC10187；

所述的温度优选为30℃，转速优选为190r/min；

所述的种子培养基中的组分按重量百分比优选为，葡萄糖1％，酵母粉0.1％，蛋白胨0.2％，硫酸铵0.6％，磷酸二氢钾41％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，水57％；灭菌后接种前用无菌的氢氧化钠溶液将摇瓶种子液调至pH值优选为7.2；

(2)在摇瓶培养中，摇瓶的装液量为500ml三角瓶装50ml发酵液，摇瓶发酵培养基中的组分按重量百分比为：蔗糖8～10％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨1～3％，酵母粉0.1～1％，柠檬酸0.1～2％，硫酸锰0.001～0.1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.00001～0.01％，水为余量；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵液调至pH为6.5～7.8；将种子液以4～6％的接种量接入发酵培养基中培养；发酵过程中后期以45～55％的蔗糖水溶液补料，使发酵液中蔗糖的浓度控制在0～20g/l，0～15h补入干重为0～1.2g的菌体，pH在9小时时调至5.8～6.2，通过硫酸溶液和氢氧化钠溶液维持pH在5.8～6.2，在温度为28～32℃，转速185～195r/min，进行下发酵培养30～38小时，可得含有2，3-丁二醇的发酵培养液；

所述的摇瓶发酵培养基中的组分按重量百分比优选为，蔗糖9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，柠檬酸1％，硫酸锰0.01％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.002％，水87.388％；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵液调至pH值优选为7.2；

所述的温度优选为30℃，转速优选为190r/min；

在3.7L生物反应器培养中，发酵罐装液量为3.7L装发酵液1.8L，3.7L生物反应器发酵培养基中的组分按重量百分比为：蔗糖5～15％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨1～3％，酵母粉0.1～1％，柠檬酸0.1～2％，硫酸锰0.001～0.1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.00001～0.01％，醋酸钾0.1～1％，硝酸钠0.01～1％，水为余量；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵罐中的发酵液调至pH为6.5～7.8；3.7L生物反应器培养条件为发酵温度为28～32℃，通气流量0.5～1.5vvm，气压0.1～0.2；转速前6小时控制在450rpm，后每小时增加50转，至10小时达到650rpm，维持到18小时，18小时后每5小时降低50rpm，降低到400rpm时维持至发酵结束，蔗糖浓度通过流加维持在4.8～5.2g/L；15小时时补入干重为2g摇瓶菌体，pH在9小时时调至5.8～6.2，通过磷酸溶液和氢氧化钠溶液维持pH在5.8～6.2，发酵培养37～50小时，可得含有2，3-丁二醇的发酵培养液；

所述的3.7L生物反应器发酵培养基中的组分按重量百分比优选为，蔗糖9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，柠檬酸1％，硫酸锰0.01％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.002％，醋酸钾0.6％，硝酸钠0.2％，水86.588％；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵罐中的发酵液调至pH值优选为7.2；

所述的3.7L生物反应器培养条件为发酵温度优选为30℃，通气流量1vvm，气压0.15。

在摇瓶和生物反应器培养的具体反应机理：粘质沙雷氏菌把蔗糖(suc)分解成葡萄糖，葡萄糖作为唯一的碳源和能源物质，通过糖酵解作用，葡萄糖代谢产生丙酮酸，丙酮酸是一种重要的中间代谢产物，一分子丙酮酸和焦磷酸硫胺素(TPP)脱羧产生乙酰TPP，这个化合物与另一分子丙酮酸缩合形成乙酰乳酸，乙酰乳酸在乙酰乳酸羧化酶的作用下形成乙偶姻，最后在还原型辅酶(NADH)及2，3-丁二醇脱氢酶的作用下得到了2，3-丁二醇，最后一步是可逆的。

本发明一种生产丁二醇的方法的积极效果是：

(1)本发明发现与对照组相比，添加组不仅提高了2，3-丁二醇的产量，转化率以及生产能力，还在一定程度上解决了菌体污染和资源的回收利用问题；

(2)本发明2，3-丁二醇生产过程与微生物生物质循环利用的集成化方法的，可以节能减排。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种生产丁二醇的方法的具体实施方式。

实施例1

(1)粘质沙雷氏菌的种子培养：

摇床培养，培养时间为24小时，12小时时转接一次，培养温度为30℃，190r/min，培养基的组分和重量含量为：葡萄糖1％；酵母粉0.1％；蛋白胨0.2％；(NH₄)₂SO₄ 0.6％；K₂HPO₄ 1％；NaCl 0.05％；MgSO₄ 0.05％；灭菌后接种前以NaOH溶液调pH 6.6；

(2)发酵培养：

以5％的接种量(体积比)接种，摇床培养，培养温度为30℃，190r/min，培养基的组分和重量含量为：蔗糖(suc)9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌；蛋白胨2％；酵母粉0.5％；柠檬酸1％；MnSO₄ 0.01％；KH₂PO₄ 0.05％；MgSO₄ 0.05％；FeSO₄ 0.002％；以及余量的水；灭菌前以NaOH溶液调pH为7.5；摇瓶的装液量为500ml三角瓶装50ml发酵液；

从9h后，每3h用4M/LNaOH或3M/LH₃PO₄调pH6.0；12h时，分别在O组、A组、B组和C组中加入发酵培养30h，干重为0g、0.1233g、0.2466g、0.3699g的活菌体；从15h后，根据其糖耗情况开始补糖，直到36h发酵结束。

采用本发明，B组情况最佳，使得2，3-丁二醇产量达到54.65g/L，转化率达0.32g/g suc，生产能力为1.52g/L·h；而对照组2，3-丁二醇产量为45.08g/L，转化率为0.28g/g suc，生产能力为1.25g/L·h。

实施例2

(1)粘质沙雷氏菌的种子培养：

摇床培养，培养时间为24小时，12小时时转接一次，培养温度为30℃，190r/min，培养基的组分和重量含量为：葡萄糖1％；酵母粉0.1％；蛋白胨0.2％；(NH₄)₂SO₄ 0.6％；K₂HPO₄ 1％；NaCl 0.05％；MgSO₄ 0.05％；灭菌后接种前以NaOH溶液调pH 7.2；

(2)发酵培养：

以5％的接种量(体积比)接种，摇床培养，培养温度为30℃，195r/min，培养基的组分和重量含量为：蔗糖9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌；蛋白胨2％；酵母粉0.5％；柠檬酸1％；MnSO₄ 0.01％；KH₂PO₄ 0.05％；MgSO₄ 0.05％；FeSO₄ 0.002％；以及余量的水；灭菌前以NaOH溶液调pH为7.2；摇瓶的装液量为500ml三角瓶装50ml发酵液。

同时进行两批发酵，分别在9h和12h时，将部分菌体离心，添加到另一批发酵液中。具体如下：

pH在9h时调至6，通过H₂SO₄溶液和NaOH溶液维持pH在6.2；根据其糖耗情况开始补糖，直到36h发酵结束。

采用本发明，A2组32h情况最佳，使得2，3-丁二醇产量达到69.3g/L，转化率达0.399g/g suc，生产能力为2.17g/L·h；而对照组2，3-丁二醇产量为48.6g/L，转化率为0.324g/g suc，生产能力为1.52g/L·h。

实施例3

(1)粘质沙雷氏菌的种子培养：

摇床培养，培养时间为24小时，12小时时转接一次，培养温度为30℃，190r/min，培养基的组分和重量含量为：葡萄糖1％；酵母粉0.1％；蛋白胨0.2％；(NH₄)₂SO₄ 0.6％；K₂HPO₄ 1％；NaCl 0.05％；MgSO₄ 0.05％；灭菌后接种前以NaOH溶液调pH 7.4；

(2)发酵培养：

以5％的接种量(体积比)接种，摇床培养，培养温度为30℃，185r/min，培养基的组分和重量含量为：蔗糖9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌；蛋白胨2％；酵母粉0.5％；柠檬酸1％；MnSO₄ 0.01％；KH₂PO₄ 0.05％；MgSO₄ 0.05％；FeSO₄ 0.002％；以及余量的水；灭菌前以NaOH溶液调pH为7.2；摇瓶的装液量为500ml三角瓶装50ml发酵液。

同时进行两批发酵，分别在12h和15h时，将部分菌体离心，添加到另一批发酵液中。具体如下：

pH在9h时调至6，通过H₂SO₄溶液和NaOH溶液维持pH在6.0左右；根据其糖耗情况开始补糖，直到36h发酵结束。

采用本发明，B2组35h情况最佳，使得2，3-丁二醇产量达到62.06g/L，转化率达0.344g/g suc，生产能力为1.77g/L·h；而对照组2，3-丁二醇产量为44.33g/L，转化率为0.29g/g suc，生产能力为1.27g/L·h。

实施例4

(1)粘质沙雷氏菌的种子培养：

挑平板上的单菌落进行摇瓶活化，共两瓶，每瓶50ml，30℃，195转/min活化12h；培养基的组分和重量含量为：葡萄糖1％；酵母粉0.1％；蛋白胨0.2％；(NH₄)₂SO₄ 0.6％；K₂HPO₄ 1％；NaCl 0.05％；MgSO₄ 0.05％；灭菌后接种前以NaOH溶液调pH 7.2；

(2)发酵培养：

利用3.7L发酵罐发酵培养，接种量5％，发酵温度30℃，转速前6h控制450rpm，后每小时增加50转，至10h达到650rpm，维持到18h，18h后每5h降低50rpm，降低到400rpm时维持至发酵结束；pH在9h时调至6，通过H₃PO₄和NaOH维持pH在6.0；培养基的组分和重量含量为：蔗糖9％；蛋白胨2％；酵母粉0.5％；柠檬酸1％；MnSO₄ 0.007％；KH₂PO₄ 0.05％；KAc 0.6％；NaNO₃0.2％；FeSO₄ 0.002％；MgSO₄ 0.05％；发酵罐起始装液量为3.7L发酵罐装1.6L发酵培养基；通气流量1vvm，气压0.15。

15.5小时后开始流加补入蔗糖和氮源，到发酵结束，共补入100g/100ml的蔗糖155ml，30g/100ml的酵母粉50ml。56小时发酵结束。2，3-丁二醇产量为95.93g/L，转化率为0.1487g/g suc，生产能力为1.86g/L·h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种生产丁二醇的方法，其特征在于，包括如下步骤，

(1)采用种子培养基活化粘质沙雷氏菌

种子培养基中的组分按重量百分比为，葡萄糖0.5～1.5％，酵母粉0.01～1％，蛋白胨0.01～1％，硫酸铵0.1～1％，磷酸二氢钾30～50％，氯化钠0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，水为余量；灭菌后接种前用无菌的氢氧化钠溶液将摇瓶种子液调至pH 6.5～7.8，把甘油管保藏的种子接入种子培养基中；在温度为28～32℃，转速185～195r/min条件下，摇瓶培养12小时，以5％的接种量转接一次，同样的条件下摇瓶培养；

(2)在摇瓶培养中，摇瓶发酵培养基中的组分按重量百分比为，蔗糖8～10％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨1～3％，酵母粉0.1～1％，柠檬酸0.1～2％，硫酸锰0.001～0.1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.00001～0.01％，水为余量；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵液调至pH为6.5～7.8；将种子液以4～6％的接种量接入发酵培养基中培养；发酵过程中后期以45～55％的蔗糖水溶液补料，使发酵液中蔗糖的浓度控制在0～20g/l，0～15h补入干重为0～1.2g的菌体，pH在9小时时调至5.8～6.2，通过硫酸溶液和氢氧化钠溶液维持pH在5.8～6.2，在温度为28～32℃，转速185～195r/min，进行下发酵培养30～38小时，可得含有2，3-丁二醇的发酵培养液；

在3.7L生物反应器培养中，3.7L生物反应器发酵培养基中的组分按重量百分比为，蔗糖5～15％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨1～3％，酵母粉0.1～1％，柠檬酸0.1～2％，硫酸锰0.001～0.1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.00001～0.01％，醋酸钾0.1～1％，硝酸钠0.01～1％，水为余量；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵罐中的发酵液调至pH为6.5～7.8；3.7L生物反应器培养条件为发酵温度为28～32℃，通气流量0.5～1.5vvm，气压0.1～0.2；转速前6小时控制在450rpm，后每小时增加50转，至10小时达到650rpm，维持到18小时，18小时后每5小时降低50rpm，降低到400rpm时维持至发酵结束，蔗糖浓度通过流加维持在4.8～5.2g/L；15小时时补入干重为2g摇瓶菌体，pH在9小时时调至5.8～6.2，通过磷酸溶液和氢氧化钠溶液维持pH在5.8～6.2，发酵培养37～50小时，可得含有2，3-丁二醇的发酵培养液。

2.根据权利要求1所述的一种生产丁二醇的方法，其特征在于，在其步骤为(1)中，

所述的种子培养基中的组分按重量百分比优选为，葡萄糖1％，酵母粉0.1％，蛋白胨0.2％，硫酸铵0.6％，磷酸二氢钾41％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，水57％；灭菌后接种前用无菌的氢氧化钠溶液将摇瓶种子液调至pH值优选为7.2。

3.根据权利要求1所述的一种生产丁二醇的方法，其特征在于，在其步骤为(1)中，温度优选为30℃，转速优选为190r/min。

4.根据权利要求1所述的一种生产丁二醇的方法，其特征在于，在其步骤为(2)中，在摇瓶培养中，

所述的摇瓶发酵培养基中的组分按重量百分比优选为，蔗糖9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，柠檬酸1％，硫酸锰0.01％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.002％，水87.388％；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵液调至pH值优选为7.2。

5.根据权利要求1所述的一种生产丁二醇的方法，其特征在于，在其步骤为(2)中，在摇瓶培养中，温度优选为30℃，转速优选为190r/min。

6.根据权利要求1所述的一种生产丁二醇的方法，其特征在于，在其步骤为(2)中，在3.7L生物反应器培养中，

所述的3.7L生物反应器发酵培养基中的组分按重量百分比优选为，蔗糖9％，蔗糖单独配制以及单独灭菌，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，柠檬酸1％，硫酸锰0.01％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.002％，醋酸钾0.6％，硝酸钠0.2％，水86.588％；灭菌前用氢氧化钠溶液将发酵罐中的发酵液调至pH值优选为7.2。

7.根据权利要求1所述的一种生产丁二醇的方法，其特征在于，在其步骤为(2)中，在3.7L生物反应器培养中，

所述的3.7L生物反应器培养条件为发酵温度优选为30℃，通气流量1vvm，气压0.15。