CN1276962C

CN1276962C - 一种偶联生产生物柴油和1,3－丙二醇的方法

Info

Publication number: CN1276962C
Application number: CNB2004101004792A
Authority: CN
Inventors: 修志龙; 牟英; 张代佳; 孙亚琴
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2006-09-27
Anticipated expiration: 2024-12-23
Also published as: CN1648207A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及到一种偶联生产生物柴油和1，3-丙二醇的技术。本发明的特征在于将脂肪酶催化甲醇或乙醇与油脂反应生成生物柴油和微生物转化甘油为1，3-丙二醇两个过程通过膜过滤偶联起来，使两个过程同时进行。本发明的效果和益处是消除了短链醇和甘油对脂肪酶的抑制，延长了固定化酶的使用寿命，同时免除了甘油分离提取的工序，降低了生产成本，节省了时间，提高了生产效率，为生物柴油和1，3-丙二醇的工业化生产提供了经济可行的工艺。

Description

一种偶联生产生物柴油和1，3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及到一种偶联法生产生物柴油和1，3-丙二醇的方法。

背景技术

生物柴油是指由可再生的油脂原料通过转酯反应得到的长链脂肪酸酯，是一种可以替代普通柴油使用的环保燃油。目前，世界的石油储量正在逐渐减少，而且油品燃烧后排放的废气引起的环境污染也是人类面临的一大问题，因此，开发可再生环保型替代性的燃料已成为当前最重要的课题之一。

目前，生产生物柴油的方法主要有化学法和生物酶法。化学法采用过量的甲醇或乙醇在氢氧化钠或氢氧化钾催化下与油脂反应，高温高压可以加快反应速度，醇过量有利于反应向正方向进行，但反应结束后需要用水洗涤、酸中和、蒸馏回收过量的醇和副产物甘油，得到的粗甘油中含有盐，难以直接利用，甘油精制耗能较大，致使精制甘油价格较高，且有废液排放。生物酶法是利用脂肪酶将甲醇或乙醇与油脂中的甘油进行交换形成脂肪酸甲酯或乙酯(生物柴油)及副产物甘油，此法具有反应条件温和、醇用量少、无污染物排放等优点，但反应时间较长，酶价格较高，而且甲醇和乙醇对脂肪酶的活性有抑制作用。通常采用固定化酶的方法解决酶反复使用的问题，但副产物甘油容易附着在载体表面，影响了传质和酶催化效率，给大规模生产带来困难。

生物柴油生产过程中的副产物甘油是发酵法生产1，3-丙二醇的原料，而1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作药物合成中间体。1，3-丙二醇最主要的用途是作为聚合物单体合成性能优异的高分子材料，不但可以使聚酯塑料具有自然循环的可生物降解特性，而且是制造性能优异的新型聚酯纤维聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的重要单体原料，可替代乙二醇、1，2-丙二醇，1，4-丁二醇等中间体生产聚酯及作为碳链延伸剂。PTT是纺织工业中一种新型聚酯化学纤维，具有许多优良的性能，如尼龙样的弹性恢复、抗紫外、臭氧及氮氧化物的着色性、低静电、低水吸附、全色范围内无需添加任何特殊化学品而呈现出的良好的连续印染性等。它具有广阔的应用前景，是目前合成纤维新品种开发的热点，因此，开发低成本的1，3-丙二醇已成为科研工作者关注的热点问题。以甘油为原料通过微生物转化生成1，3-丙二醇的研究始于1881年，但直到20世纪80年代才逐渐引起人们的重视。与以石油为原料的化学合成法相比，生物法具有利用可再生资源、反应条件温和、操作简便安全、副产物少、无环境污染等特点，但其原料甘油较高的价格成为微生物法生产1，3-丙二醇产业化最大的障碍，而化学法生产生物柴油的副产物甘油含盐较多，不利于直接利用它来生产1，3-丙二醇。

为了解决上述问题，本发明采用生物酶法催化油脂和甲醇或乙醇反应生成生物柴油，同时利用亲水性超滤膜将副产物甘油分离出来，经微生物转化为1，3-丙二醇，使酶催化与微生物转化两个过程同时进行，实现生物柴油和1，3-丙二醇的偶联生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种偶联生产生物柴油和1，3-丙二醇的技术，将脂肪酶催化短链醇与油脂反应生成生物柴油和微生物转化甘油为1，3-丙二醇两个过程通过超滤膜偶联起来，使两个过程同时进行。在生物柴油生产过程中，短链醇采用分段或连续滴加的方式加入，这样可以避免过量的有机溶剂导致酶中毒；通过超滤膜透析过滤可以及时去除生物柴油生产过程中的副产物甘油，延长固定化酶的使用寿命；甘油直接经微生物细胞转化为1，3-丙二醇，免除了甘油的分离纯化工序，降低了生产1，3-丙二醇的原料成本，节省了时间，提高了生产效率。

本发明的技术方案是首先采用生物酶催化法将油脂转酯生成生物柴油，同时利用亲水性的中空纤维超滤膜或平板膜将副产物甘油分离出来，在膜的另一侧用微生物直接将甘油转化为1，3-丙二醇。

实现本发明方法的步骤如下：

1)微生物培养基的制备：培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。另外还需要钠、钾、镁、钙等阳离子以及锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼等微量元素，每种微量元素的含量大约在0.01mg/L～50mg/L的范围内，培养基需在120℃下灭菌15～20分钟方能使用。

2)种子培养：在摇瓶中进行，摇床转速为100～300r/min，温度为27～40℃，培养时间为9～30h。微生物细胞是克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、柠檬菌(Citrobacter)或丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)。

3)发酵培养：在细胞培养器中进行，接种量为5％～20％，搅拌转速为100～400r/min，温度为27～40℃。发酵过程中可以向培养器中通氮气或空气，通气量为0.2～4vvm。发酵方式为批式流加发酵，发酵的时间为10～70h。1，3-丙二醇发酵甘油初始浓度为2～15％，pH为6～8，产物1，3-丙二醇的浓度可达到10～85g/L。

4)酶催化与微生物转化偶联过程：将经预处理去除杂质的原料油脂和占油脂质量10～30％的固定化酶加入酶反应器中，控制反应温度为30～60℃，搅拌的同时添加甲醇或乙醇，搅拌转速为100～300r/min，甲醇或乙醇采用分段或连续滴加的方式加入，分段加入可以分为3～30段，连续滴加甲醇和乙醇的稀释速率分别为0.003～0.02h^-1和0.005～0.03h^-1，反应进行1～5h后，用循环泵将反应液(不含固定化酶)泵入亲水性平板超滤膜或中空纤维膜的一侧，膜的另一侧为上述1，3-丙二醇的发酵液(含微生物细胞)，整个反应过程15～50h，油脂的转化率可达80～97％，甘油的利用率达到90～99％。

所用脂肪酶来源于米黑毛霉(Mucor miehei)、皱褶假丝酵母(Candidaantarctica)、柱晶假丝酵母(Candida Cylindracea)的固定化脂肪酶，原料油脂是废油脂、菜籽油、大豆油、桐子油、棕榈油、黄连木油、蓖麻油或工程微藻油，短链醇为甲醇和乙醇。

5)膜过滤条件：所用的超滤膜为不对称、亲水性的超滤膜，所用膜材料是有机膜或无机陶瓷膜，有机膜指聚醚砜、纤维素酯、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚脂肪酰胺和聚丙烯腈，陶瓷膜是指氧化铝膜、二氧化钛膜、二氧化硅膜、二氧化锆膜及其复合膜，切割分子量在10～50kDa之间，可以是平板膜或中空纤维膜。膜两侧分别泵入酶催化反应液和1，3-丙二醇发酵液，当使用中空纤维膜时，建议管程走酶催化反应液，壳程走1，3-丙二醇发酵液，膜两侧液体流量与酶反应器和细胞培养器的体积之比分别为3.6～7.2h^-1和4.8～9.6h^-1。膜的操作压力为0.1MPa～0.5Mpa，两侧的压力接近，反应液一侧的压力略高于发酵液(0.001MPa～0.05Mpa)。膜的操作温度取决于细胞培养的温度，通常为27～40℃，反应液一侧的温度略高于发酵液，两侧的温度差在0～5℃之间。当两侧的温度相差较大时，用膜前后的换热器冷却或加热反应液。

所用膜材料是有机膜或无机陶瓷膜，有机膜指聚醚砜、纤维素酯、聚酰亚胺/聚醚酰亚胺、聚脂肪酰胺和聚丙烯腈，无机陶瓷膜是指氧化铝膜、二氧化钛膜、二氧化硅膜、二氧化锆膜及其复合膜。

本发明的效果和益处在于利用了超滤膜将脂肪酶催化和微生物转化两个过程偶联起来，实现生物柴油与1，3-丙二醇的联产。在酶催化过程中，采用分段或连续滴加的方式加入甲醇或乙醇，可以减少甚至消除过量的短链醇导致的脂肪酶中毒失活；通过膜超滤可以及时除去酶催化过程中形成的副产物甘油，延长固定化酶的使用寿命；甘油在膜的另一侧经微生物细胞直接转化为1，3-丙二醇，节省了甘油分离的费用，降低了生产成本，缩短了整个生产的时间，可节约能源，提高了生产效率。

附图说明

附图是本发明偶联法生产生物柴油和1，3-丙二醇的工艺流程示意图。

具体实施方式

以下详细结合技术方案和附图详细叙述本发明的实施例：

实施例1

1)菌种和酶：发酵的菌种为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，是一种兼性厌氧菌，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，菌种保藏号是1.1736。固定化脂肪酶Novozym 435购自诺和诺德公司，来源于Candidaantarctica，固定在一种大孔丙烯酸树脂上。

2)培养基：分种子培养基和发酵培养基两种，分述如下：

A.种子培养基(1L)：

甘油：20g K₂HPO₄·3H₂O：4.454g

KH₂PO₄：1.3g (NH₄)₂SO₄：2.0g

MgSO₄·7H₂O：0.2g 酵母粉：1.0g

CaCO₃：2.0g 微量元素TE1：2mL

2％CaCl₂溶液：1mL 0.5％FeSO₄溶液：1mL

微量元素TE1组成(1L)：

饱和盐酸：0.9mL ZnCl₂：70mg

MnCl₂·4H₂O：100mg H₃BO₃：60mg

CoCl₂·6H₂O：200mg NiCl₂·6H₂O：25mg

NaMoO₄·2H₂O：35mg CuCl₂·2H₂O：20mg

B.发酵培养基组成(1L)：

(NH₄)₂SO₄：6.61g KH₂PO₄：1.36g

MgCl₂·6H₂O：0.26g CaCl₂：0.29g

柠檬酸：0.42g 酵母粉：1.0g

甘油：40g 微量元素TE2：5mL

微量元素TE2组成(1L)：

饱和盐酸：10mL ZnCl₂：0.379g

FeCl₃·6H₂O：5.4g MnCl₂·4H₂O：0.17g

CoCl₂·6H₂O：0.47g H₃BO₃：0.06g

CuCl₂·2H₂O：0.47g NaMoO₄·2H₂O：0.005g

3)发酵过程：分种子培养和发酵培养两种，其中种子培养在500mL的三角瓶中进行，装液量为100mL，摇床转速为200r/min；发酵培养在全自动细胞培养器中进行，工作体积为2L，实际装液量为1L，甘油初始浓度为4％，接种量为10％，转速控制为200r/min，氮气的通气量0.4vvm，用2mol/L氢氧化钠调节pH为7.0，温度控制在37℃。

4)将2kg大豆油加入反应器中，同时加入300g的固定化脂肪酶Novozym435，加热至40℃，加入甲醇22.3g(醇油摩尔比为0.3∶1)开始反应，反应过程中搅拌转速为170r/min，每1小时加甲醇一次，共加甲醇266g，用泵强制反应液循环，通过平板膜，膜的另一侧为1，3-丙二醇发酵液。

5)平板膜为不对称性亲水醋酸纤维素膜，切割分子量为40kDa，面积为400cm²，操作条件为：温度38℃，压力0.12MPa，酯化反应液和1，3-丙二醇发酵液流速与反应器的体积比分别为5.4h^-1和7.2h^-1。酶催化的反应液用膜前换热器冷却至38±1℃，过膜后用换热器加热至40±2℃。

实验所得到的结果如下：

反应进行了30h，发酵液中1，3-丙二醇的浓度为52.76g/L，乙醇浓度为7.22g/L，乙酸浓度为4.85g/L，2，3-丁二醇浓度为4.28g/L，生产出生物柴油1753g。

实施例2

1)1，3-丙二醇发酵菌种、培养基以及发酵过程同实施例一。

2)2kg菜籽油加入反应器中，同时加入320g固定化脂肪酶Novozym 435，加热至45℃，加入乙醇11g(醇油摩尔比为0.1∶1)开始反应，反应过程中搅拌转速为170r/min，乙醇采用滴加的方式加入，稀释速率为0.01h^-1，共加乙醇380g，用泵强制反应液循环，通过中空纤维膜，膜的另一侧为1，3-丙二醇发酵液。

3)中空纤维膜为醋酸纤维素超滤膜，切割分子量为10kDa，表面积为0.5m²，操作压力为0.13Mpa，温度为38℃，膜的管程为酯化反应液，流速与酶催化反应器的体积比为6.0h^-1，壳程为1，3-丙二醇发酵液，流速与细胞培养器的体积比为8.4h^-1

4)酶催化的反应液用膜前换热器冷却至38±1℃，过膜后用换热器加热至45±2℃。

实验所得结果如下：

反应进行了34h，发酵液中1，3-丙二醇的浓度为55.48g/L，乙醇浓度为10.48g/L，乙酸浓度为6.10g/L，2，3-丁二醇浓度为5.10g/L，生产出生物柴油1711g。

Claims

1.一种偶联生产生物柴油和1，3-丙二醇的方法，是将脂肪酶催化短链醇与油脂反应生成生物柴油和微生物转化甘油为1，3-丙二醇两个过程通过膜过滤偶联起来，使两个过程同时进行；酶法所用脂肪酶来源于米黑毛霉(Mucor miehei)、皱褶假丝酵母(Candida antarctica)、柱晶假丝酵母(Candida Cylindracea)的固定化脂肪酶，原料油脂是废油脂、菜籽油、大豆油、桐子油、棕榈油、黄连木油、蓖麻油或工程微藻油，短链醇为甲醇和乙醇，转酯反应条件为：温度30～60℃，搅拌速度100～300r/min，甲醇或乙醇采用分段或连续流加的方式，分段流加分为3～30个时段，连续滴加甲醇稀释速率为0.003～0.02h^-1，乙醇稀释速率为0.005～0.03h^-1，反应时间为10～30h，转化率达到80～97％；微生物法将甘油转化为1，3-丙二醇，所述微生物是克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、柠檬菌(Citrobacter)和丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)，发酵过程中菌种的接种量为5％～20％，细胞培养器搅拌转速为100～400r/min，温度为27～40℃，氮气或空气的通气量为0.2～4vvm，甘油初始浓度为2％～15％，pH为6.0～8.0，产物1，3-丙二醇的浓度达到10～85g/L；该工艺所用膜为不对称性的亲水超滤膜，膜器件是平板膜或中空纤维膜，其特征在于：

1)将脂肪酶催化甲醇或乙醇与油脂反应生成生物柴油和微生物转化甘油为1，3-丙二醇两个过程通过膜过滤偶联起来，使两个过程同时进行；

2)所用膜材料是有机膜或无机陶瓷膜，有机膜指聚醚砜、纤维素酯、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚脂肪酰胺和聚丙烯腈，陶瓷膜是指氧化铝膜、二氧化钛膜、二氧化硅膜、二氧化锆膜及其复合膜，切割分子量为10～50kDa；

3)膜的操作压力为0.1MPa～0.5Mpa，膜两侧分别为酶催化反应液和1，3-丙二醇发酵液，反应液一侧的压力比发酵液高0.001MPa～0.05Mpa，液体流量与酶反应器和细胞培养器的体积之比分别为3.6～7.2h^-1和4.8～9.6h^-1；

4)膜的操作温度取决于细胞培养的温度，通常为27～40℃，反应液一侧的温度比发酵液一侧高0～5℃，当两侧的温度差超出上述范围时，用膜前后串联的两个换热器冷却或加热反应液。