CN101974573A

CN101974573A - 以木薯淀粉发酵生产微生物油脂及其制备生物柴油的方法

Info

Publication number: CN101974573A
Application number: CN2010102825570A
Authority: CN
Inventors: 朱笃; 张志斌; 颜日明; 曾庆桂
Original assignee: Jiangxi Normal University
Current assignee: Jiangxi Normal University
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2011-02-16

Abstract

以木薯淀粉发酵生产微生物油脂及其制备生物柴油的方法，属于生物能源领域。包括微生物油脂的制备和利用微生物油脂制备生物柴油的方法，即以皮状丝胞酵母B3为产油脂菌种，木薯淀粉糖化液为碳源，在一定培养条件下分批发酵培养微生物，经干燥、提取获得微生物油脂；以该微生物油脂为原料，在催化剂作用下进行转酯化反应，得到生物柴油，副产物为甘油。本发明的优点是：利用木薯淀粉为原料发酵生产微生物油脂，既充分利用了木薯淀粉资源，又可降低微生物油脂生产的原料成本；建立了微生物油脂转化生物柴油的工艺，工艺操作简便、环境友好、易于控制，具有良好的工业化应用前景。

Description

以木薯淀粉发酵生产微生物油脂及其制备生物柴油的方法

技术领域

本发明属于生物能源技术领域，特别涉及一种以木薯淀粉发酵生产微生物油脂及其制备生物柴油的方法。

背景技术

生物柴油是近年来基于环境恶化和能源危机发展起来的一种可替代化石燃料的可再生新能源，是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源。目前国内外对于生物柴油制备的研究主要集中于植物油或餐饮废弃油脂方面，但利用植物油为原料成本高，其成本占到总生产成本的70～85％，以餐饮废弃油为原料，也存在原料难以收集和运输的困难，这些都严重地制约了生物柴油的产业化进程，因此寻找一种廉价的原料成为了生物柴油产业化的关键。

微生物油脂(microbial oil)又称单细胞油脂(single cell oil)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物油的脂肪酸组成和一般植物油相近，因此微生物油脂可替代植物油脂生产生物柴油。目前微生物油脂主要是用粮食或糖蜜通过液态发酵来生产，生产成本高昂，所以寻找新的发酵方法和丰富而廉价的发酵原料来生产微生物油脂势在必行。

淀粉类生物质原料作为一种新的可再生原料在新型能源生产方面有着非常广泛的用途，目前淀粉类原料已经成功用于乙醇、乳酸、柠檬酸等产品的发酵生产，而在微生物油脂方面也有相关报道，如清华大学刘德华等(专利公开号CN 1923960A)发明利用酵母产油菌生产微生物油脂并制备生物柴油，所用的碳源为葡萄糖、木质类纤维素水解液及淀粉类水解液为原料生产微生物油脂，并提出相关的生物柴油合成方法。淀粉包括玉米淀粉、薯类淀粉、变性淀粉等，而薯类淀粉中以木薯淀粉为最，其被称为“薯类淀粉之王”(黄洁，李开绵，叶剑秋，等.中国木薯产业化的发展研究与对策，中国农学通报，2006，22(5)：421～426)。用木薯淀粉发酵仅见生产生物燃油丁醇的报告(王燕飞.以木薯为原料制取燃油生物丁醇的方法，中国专利，公开号CN 101165188A)，而关于利用其为原料发酵生产微生物油脂并合成生物柴油的方法更是未见报道。目前利用发酵法生产微生物油脂同时合成生物柴油也有相关专利报道，如中科院大连化学物理研究所赵宗保等(专利公开号CN 101037639A)发明以海洋滩涂植物大米草为原料，提出采用酵母工程菌将大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生物柴油的工艺；宋元达(专利公开号CN 101445741A)发明的一种以农副厂品加工废弃物和工业废水为主要原料来培养一种产油脂的酵母，以及以此微生物油脂为原料通过酶催化的油脂交酯化反应来生产生物柴油的工艺。以上这些发明以农副产品废弃物为发酵原料，原料的前期预处理步骤繁琐且可利用的还原糖得率较低，在大规模工业化生产上存在一定缺陷。

考虑到以上所述方面，我们首次设计了一种利用木薯淀粉作为发酵碳源生产微生物油脂和生物柴油的方案。皮状丝胞酵母菌株B3将淀粉糖化液中的碳源转化为油脂并在细胞内大量积累，积累的油脂提取后经过转酯反应而生成生物柴油。这不仅降低生产生物柴油的原料成本，也巧妙的填补了利用木薯淀粉来生产生物柴油的技术空缺，为木薯淀粉的全面开发利用提供了一种新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种由木薯淀粉生产微生物油脂及其制备生物柴油的方法，以实现木薯淀粉原料的充分开发利用，生产可替代植物油脂的生物柴油。

本发明所述利用微生物发酵油脂制备生物柴油的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)所述木薯淀粉处理过程为：

A以水与淀粉类原料质量比为1～6∶1的比例将木薯淀粉原料加入自来水中混匀成淀粉浆；

B调节淀粉浆pH值在5.0～7.0，向淀粉浆中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为1～10U/g淀粉干重，在80～100℃条件下，液化1～3小时，得到淀粉液化液；

C将淀粉液化液pH值调节在3.5～6.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000U/g淀粉干重，在50～70℃条件下糖化0.5～3小时，得到淀粉糖化液；

上述加水量与淀粉类原料质量比优选为1～4∶1。

上述α-淀粉酶的加酶量优选为2～6U/g淀粉干重，糖化酶的添加量优选为200～400U/g淀粉干重。

(2)发酵过程

将产油酵母菌在斜面培养基中进行转接活化，然后在种子培养基中进行种子培养，再转接5～15％的菌种到发酵培养基中，在温度为25～35℃、转速为300～500r/min下培养36～72h后，发酵结束后测定菌体的生物量；

(3)微生物油脂的提取

将微生物发酵得到大量菌体，离心干燥收集菌体，利用石油醚作为有机溶剂结合索氏提取器，于60～90℃水浴加热回流6～10h为从菌体中提取油脂。

(4)生物油脂转酯化制备生物柴油

取微生物油脂5～10g，以1.0～3.0g的甲醇作酯化剂，以微生物发酵油脂的1～10wt％KOH为催化剂，在30～100℃，反应0.5～5小时，进行转酯化反应后，经分离得到脂肪酸甲酯即生物柴油，副产物为甘油。

所述微生物发酵油脂的菌种为皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)B3，保藏编号为CCTCC NO.M 2010076，由本实验室诱变选育所得；

所述微生物发酵过程为：

以5～15％接种量接种于木薯淀粉糖化液为碳源的发酵培养基中，在温度为25～35℃、转速为300～500r/min下培养36～72h后，通气量0.5～1.5vvm实施发酵，得到含微生物油脂的菌体；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加0.5～3M的NaOH或1～3M的H₃PO₄；来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；上述各培养基均在115℃、灭菌20分钟；

所述培养基配方为：种子培养基包括葡萄糖70g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，酵母浸粉1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为6.0；发酵培养基：包括碳源为木薯淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量计为30～100g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，酵母浸3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为5.5～6.5；

所述微生物油脂转酯化生物柴油的催化剂包括酸、碱、固体碱或生物脂肪酶(Novozym435)等；所选取的反应条件，温度和时间对于不同的催化剂有不同的参数范围。

本发明具有以下优势：

1.所用的发酵原料木薯淀粉，其来源广泛，价格低廉，可种植于山野荒地，不与粮食争地等优点；通过对木薯原料的循环利用，还可促进木薯种植产业的发展，增加木薯种植农户的经济收入，具有巨大的经济、社会和生态效益。

2.利用微生物发酵油脂制备生物柴油丰富了制备生物柴油的原料，降低生产成本，环境友好，反应条件温和、具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明用木薯淀粉糖化发酵生产生物油脂和生物柴油的工艺流程图。

具体实施方式

一般性说明：

本发明所选用的菌株为皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)B3，由本申请发明人所在实验室筛选并保藏在中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO.M 2010076，；

实施例1

1.木薯淀粉预处理

以水与淀粉类原料质量比为3∶1的比例将木薯淀粉原料加入自来水中混匀成淀粉浆；调节淀粉浆pH值在5.5，向淀粉浆中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为2U/g淀粉干重，在90℃条件下，液化2小时，得到淀粉液化液；将淀粉液化液pH值调节在4.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量为400U/g淀粉干重，在60℃条件下糖化2小时，得到淀粉糖化液，测定其还原糖浓度为215g/L，作为发酵培养基碳源备用；

2.发酵

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3

(2)培养基：种子培养基：葡萄糖70g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，酵母浸粉1g/L，MgSO₄·7H₂O0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为6.0。

发酵培养基：包括碳源为木薯淀粉糖化液，其用量以其含还原糖量计为60g/L，NH₄NO₃1g/L，酵母浸粉3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为6.0；

(3)发酵方式：将固体斜面培养的菌种接至种子培养基中培养24h，以10％接种量接种于木薯淀粉糖化液为碳源的发酵培养基中，发酵罐体积为2L；在温度为28℃、转速为300r/min下培养48h后，通气量1.5vvm实施发酵，得到含微生物油脂的菌体；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加1M的NaOH或1M的H₃PO₄；来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；

(4)发酵结果

48h发酵完后，其生物量达到20.2g/L。利用石油醚作为有机溶剂结合索氏提取器，于80℃水浴加热回流6h为从菌体中提取油脂，油脂含量达到33.5％。

实施例2

1.木薯淀粉预处理同实施例1

2.发酵

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3

(2)培养基：种子培养基同实施例1

发酵培养基：包括碳源为木薯淀粉糖化液，其用量以其含还原糖量计为80g/L，NH₄NO₃0.5g/L，酵母浸粉3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为6.0；

(3)发酵方式同实施例1，发酵培养时间为60h；

(4)发酵结果

60h发酵完后，其生物量达到28.2g/L。利用石油醚作为有机溶剂结合索氏提取器，于80℃水浴加热回流6h为从菌体中提取油脂，油脂含量达到36.5％。

实施例3

1.木薯淀粉预处理

以水与淀粉类原料质量比为4∶1的比例将木薯淀粉原料加入自来水中混匀成淀粉浆；调节淀粉浆pH值在5.5，向淀粉浆中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为6U/g淀粉干重，在90℃条件下，液化2小时，得到淀粉液化液；将淀粉液化液pH值调节在4.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量为300U/g淀粉干重，在60℃条件下糖化2h，得到淀粉糖化液，测定其还原糖浓度为240g/L，作为发酵培养基碳源备用；

2.发酵

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3

发酵培养基：包括碳源为木薯淀粉糖化液，其用量以其含还原糖量计为60g/L，NH₄NO₃0.5g/L，酵母浸粉3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为6.0；

(3)发酵方式：将固体斜面培养的菌种接至种子培养基中培养24h，以10％接种量接种于木薯淀粉糖化液为碳源的发酵培养基中，发酵罐体积为2L；在温度为28℃、转速为300r/min下培养48h后，通气量1.5vvm实施发酵，得到含微生物油脂的菌体；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加2M的NaOH或1M的H₃PO₄；来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；

(4)发酵结果

48h发酵完后，其生物量达到19.3g/L。利用石油醚作为有机溶剂结合索氏脂肪提取器，于80℃水浴加热回流6h为从菌体中提取油脂，油脂含量达到34.2％。

实施例4

1.木薯淀粉预处理同实施例3

2.发酵

(1)菌种：皮状丝孢酵母B3

发酵培养基：包括碳源为木薯淀粉糖化液，其用量以其含还原糖量计为80g/L，NH₄NO₃1g/L，酵母浸粉3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为6.0；

(3)发酵方式同实施例3，发酵时间为60h；

(4)发酵结果

60h发酵完后，其生物量达到30.3g/L。利用石油醚作为有机溶剂结合索氏脂肪提取器，于80℃水浴加热回流6h为从菌体中提取油脂，油脂含量达到38.5％。

实施例5

取微生物油脂300mg，加5mL甲醇及0.2mL 1.0M的KOH-甲醇溶液加热回流8min，冷却加入正庚烷5mL，在40℃水浴中放置20min，加水5ml，静置分层，取正庚烷层，利用气相色谱分析其成分。具体分析结果如表1所示。从表1可以看出，微生物发酵油脂的组成主要含有不同的脂肪酸，其中软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸含量较多，其组成含量与植物油类似，可作为转酯化制备生物柴油的原料。

表1为微生物发酵油脂不同脂肪酸的组成和含量

实施例6

以国标GB/T 5530-2005的方法，测定该油脂的酸价为10～20mgKOH/g，油品酸价过高，如果直接用碱催化法制备，不但要消耗过多的碱催化剂，而且会影响转化率。需对原料油进行脱酸处理，将原料油与甲醇按质量比为2∶1混合，常温搅拌30min后静置分层，取油层，重复上述操作3次，使原料油的酸价降到0.5～1.0mgKOH/g。

取脱酸后的原料油脂置于三口烧瓶中，然后按醇油摩尔比8∶1的比例加入一定量的甲醇；打开搅拌器并加入油重1.0％的氢氧化钾；反应温度控制在65℃，反应2.0h后将混合液转移至分液漏斗中静置分层(静置时间8h)。上层为脂肪酸甲酯(微生物柴油)，下层为反应副产物甘油，过滤掉甘油，减压蒸去甲醇及水等杂质即得浅黄色的微生物柴油。

实施例7

以微生物发酵油脂为原料，自行研制开发的负载比为30％的改性固体催化剂KOH/Al2O3为催化剂，催化剂用量5Wt％，醇油摩尔比为10∶1，在500mL三口烧瓶中，反应温度为60℃，搅拌回流反应2.5h。反应结束后，离心分离出催化剂，然后将滤液倒入分液漏斗中静置分层，上层减压蒸馏出过量的甲醇后得到产品生物柴油，转化率为93.2％，同时分离得到副产品甘油。

Claims

1.一种以木薯淀粉发酵生产微生物油脂及其制备生物柴油的方法，其特征在于：包括微生物油脂的制备和利用微生物发酵油脂制备生物柴油的方法，即以皮状丝胞酵母B3为产油菌种，木薯淀粉糖化液作为碳源，在一定培养条件下分批发酵培养微生物，经干燥、提取获得微生物油脂；以该微生物油脂为原料，在催化剂作用下进行转酯化反应，得到生物柴油，副产物为甘油。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用微生物发酵生产油脂及其制备生物柴油的步骤如下：

(1)木薯淀粉原料处理过程

将木薯淀粉原料加入自来水中混匀成淀粉浆；调节淀粉浆pH值，向淀粉浆中加入α-淀粉酶，在适当温度条件下，液化得到淀粉液化液；将淀粉液化液pH值调节后加入糖化酶，得到淀粉糖化液，测定其还原糖浓度范围；

(2)发酵过程

(3)微生物油脂的提取

将微生物发酵得到大量菌体离心、干燥收集，利用石油醚作为有机溶剂结合索氏提取器，于60～90℃水浴加热回流6～10h从菌体中提取油脂。

(4)生物油脂转酯化制备生物柴油

取微生物油脂5～10g，以1.0～3.0g的醇作酯化剂，以微生物油脂的1～10wt％碱为催化剂，在30～100℃，反应0.5～5h，进行转酯化反应后，经分离得到脂肪酸甲酯即生物柴油，副产物为甘油。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)木薯淀粉处理过程为：

A以水与淀粉类原料质量比为1～6∶1的比例将木薯淀粉原料加入自来水中混匀成淀粉浆，优选4∶1；

B调节淀粉浆pH值在5.0～7.0，优选5.5～6.0；向淀粉浆中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为1～10U/g淀粉干重，优选2～6U/g；在80～100℃条件下，液化1～3h，得到淀粉液化液；

C将淀粉液化液pH值调节在3.5～6.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000U/g淀粉干重，pH值调节优选4.0～5.0，糖化酶的添加量优选200～400U/g；在50～70℃条件下糖化0.5～3.0h，得到木薯淀粉糖化液；

D测定糖化液中还原糖的浓度，其浓度范围为100～300g/L；

上述木薯淀粉糖化液作为发酵培养基的碳源备用。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)微生物发酵油脂的菌种为皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)B3，保藏编号为CCTCC NO.M 2010076，由本实验室诱变选育所得。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)发酵过程为：

A将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于28～30℃，150～200r/min摇床培养20～30h；

B以5～15％接种量接种于木薯淀粉糖化液为碳源的发酵培养基中，在温度为25～35℃、转速为300～500r/min下培养36～72h，通气量0.5～1.5vvm实施发酵，得到含微生物油脂的菌体；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加0.5～3M的NaOH或1～3M的H₃PO₄；来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；上述各培养基均在115℃、灭菌20min。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)种子培养基配方为：葡萄糖70g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，酵母浸粉1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O0.4g/L，pH为6.0。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)发酵培养基配方为：碳源为木薯淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量计为30～100g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，酵母浸粉3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为5.5～6.5。

8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)微生物油脂转酯化生物柴油的催化剂包括酸、碱、固体碱或生物脂肪酶(Novozym 435)等；所选取的反应条件、温度和时间对于不同的催化剂有不同的参数范围。