CN102250968B

CN102250968B - 一种发酵生产1,3-丙二醇的方法

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Publication number: CN102250968B
Application number: CN 201110199548
Authority: CN
Inventors: 刘德华; 周胜; 罗吉安
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: CN102250968A

Abstract

本发明属于生物化工技术领域，公开了一种发酵生产1，3-丙二醇的方法，包括：培养基制备，种子培养及发酵产1，3-丙二醇的步骤，通过在发酵培养基中添加苹果酸，终浓度为0.1～10.0g/L；添加时机选择在从菌种进行发酵的开始至对数生长期。所添加的苹果酸可以促进菌体三羧酸循环，提供更多还原性辅酶及能量。本发明适于1，3-丙二醇的有氧发酵过程。本发明的优点在于：可促进生产菌对底物甘油的利用，显著提高1，3-丙二醇的浓度和生产强度，降低生产成本。

Description

一种发酵生产1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，特别是提供了一种外源添加苹果酸促进微生物合成1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂，应用于耐压高润滑剂、染料、油墨、防冻剂等行业。PDO用于油墨可提高墨水的吸附性、稳定性等。PDO可用来合成杂环、药物中间体、聚酯和聚氨酯，尤其是可作为聚酯PTT的单体。PDO潜在的用途还包括制造热塑性聚胺酯(TPU)和聚氯乙烯(PVC)中使用的聚合物增塑剂。它作为二醇可以取代1，4-丁二醇和新戊二醇等中间体。由于PDO同样具有二醇官能团，可用于生产聚氨酯，例如用于制造聚酯多醇和作为链增长剂，在这方面PDO将可能与酯基多醇，如聚己内酯和聚二醇相竞争，可代替用作TPU链增长剂的两种主要二醇1，4-丁二醇和二(2-羟乙基)醚。以PDO为单体合成的聚酯和聚氨酯，显示了比以1，2-丙二醇、丁二醇、乙二醇为单体合成的聚合物更好的性能和更好的光稳定性，因而吸引了工业界的关注。

PDO迅速发展的主要原因是它可以用作合成聚酯PTT的单体，而PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循还利用性等。由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

生产PTT纤维的关键在于单体原料PDO的来源。PTT占领市场的关键在于价格，而PTT的价格主要取决于PDO的价格。过去由于不能廉价制得PDO，制约了PTT的研制和市场开拓。直到90年代中期PDO实现了工业化生产，使得PDO价格大大降低，PTT才开始工业化生产和应用。

Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。

目前1，3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1，3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

生物合成法生产PDO是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1，3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1，3-丙二醇转化率和1，3-丙二醇生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性，因此具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

在利用微生物发酵甘油生产1，3-丙二醇的过程中，甘油作为碳源与能源进行氧化和还原歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，产生供细胞生长所必需的ATP，在产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力NADH，生成PDO。克雷伯氏菌合成1，3-丙二醇的还原代谢途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由PDO氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成PDO。氧化途径中丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又会分解为CO₂和H₂。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中产生ATP，而在经乙醛形成乙醇的两步反应中要消耗2摩尔还原力。在pH值较低的条件下，丙酮酸经α-乙酰乳酸产生3-羟基-2-丁酮并转化为2，3-丁二醇。此外，发酵产物中还有乳酸和琥珀酸等。另外，细胞生长也可为PDO生成提供还原力。

目前生物合成法生产1，3-丙二醇存在产物在发酵液中终浓度较低，甘油转化率以及生产强度较低等问题，因而缺乏市场竞争力。

为了促进1，3-丙二醇的生产，已经报导的有不同发酵方式，添加辅助底物、维生素或电子受体，构建基因工程菌等方面的研究成果。主要有以下几种方法：

1)采用微氧或有氧条件下发酵生产1，3-丙二醇(修志龙等，一种微生物微氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，中国专利公开号：CN1348007；刘德华等，微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，中国专利公开号：ZL200510086677)

2)采用添加葡萄糖做辅底物在厌氧条件下发酵生产1，3-丙二醇(张健等，以葡萄糖为辅助底物发酵生产1，3-丙二醇的研究，现代化工，2002，22(6)：32-35。)

3)采用外源添加维生素C或维生素E等还原剂的方法促进1，3-丙二醇的生产(李春等，外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，专利公开号：1446919A)。

4)采用外源添加反丁烯二酸等电子受体的方法促进1，3-丙二醇的生产(刘德华等，一种外源添加反丁烯二酸促进微生物合成1，3-丙二醇的方法，专利公开号：ZL1304582)

5)采用基因工程方法改造生产菌种提高生产性能(李季伦等，产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与应用，专利公开号：ZL200510127744；刘德华等，构建基因工程菌增强1，3-丙二醇生产菌株抗逆性的方法，专利公开号：CN101381696；张延平等，醛脱氢酶基因敲除对克雷伯氏菌合成1，3-丙二醇的影响，化工学报，2006，57(11)：2689-2692)。

通过代谢及酶学分析发现，影响1，3-丙二醇合成有两方面的关键因素。一是菌体内与1，3-丙二醇合成相关的关键酶活性的大小，包括甘油脱氢酶，甘油脱水酶及1，3-丙二醇氧化还原酶的活性变化；另一个影响因素是菌体内NADH含量或NAD/NADH的比例。如果为菌体提供更多还原性辅酶NADH及能量ATP，将有效提高1，3-丙二醇合成关键酶活性，降低菌体内NAD/NADH比例，从而使1，3-丙二醇浓度及生产强度显著提高。

苹果酸是三羧酸循环中重要的中间产物，是四碳的羟基丁二酸。在苹果酸-天冬氨酸循环中也起重要的作用。苹果酸可以参与微生物的发酵过程，可以作为微生物生长的碳源，因此可以用于食品发酵剂，比如可以做酵母生长促进剂。苹果酸作为三羧酸循环中间产物，添加培养基可以补充三羧酸循环，提高三羧酸循环水平。有氧条件下1个三羧酸循环循环能生成3个NADH和1个FADH₂，它们参与电子传递链分别产生3个和2个ATP分子，另有GTP生成TAP分子1个，总计产生12分子ATP。细胞内能量ATP和还原性辅酶NADH的增加可以促进菌体生长，提高还原途径关键酶活性。目前的研究中还未有外源添加苹果酸促进微生物合成1，3-丙二醇的报导。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种发酵生产1，3-丙二醇的方法。

为了实现本发明目的，本发明一种发酵生产1，3-丙二醇的方法，其包括培养基制备、种子培养和发酵产1，3-丙二醇步骤，在发酵过程中，往发酵液中添加苹果酸，促进三羧酸循环，提供更多还原性辅酶及能量ATP，提高菌体内1，3-丙二醇合成关键酶的活性，降低菌体内NAD/NADH比例，从而促进生产菌对底物甘油的利用，显著提高1，3-丙二醇浓度及生产强度。

其中，往发酵液中添加苹果酸的终浓度为0.1～10.0g/L，优选为0.67～5g/L，更有选为2.01～5g/L，最优选为3.35～5g/L。

其中，往发酵液中添加苹果酸的时机为发酵开始至发酵菌的对数生长期期间，优选为发酵菌的对数生长初期。

其中，所述的发酵产1，3-丙二醇的菌株为本领域公知的任何菌株，优选为克雷伯氏菌，最优选为克雷伯氏菌CGMCC1.9131。

本发明提供的方法适用于1，3-丙二醇的有氧发酵过程。

本发明的特点在于添加苹果酸促进菌体三羧酸循环，提供更多还原性辅酶NADH及菌体代谢所需能量ATP，从而提高菌体内1，3-丙二醇合成关键酶的活性，降低NAD/NADH的比例，使1，3-丙二醇浓度及生产强度显著提高。本发明操作简单，不需要增加额外的设备和人工，仅通过添加较少的苹果酸，显著提高1，3-丙二醇的生产强度，获得较高的1，3-丙二醇浓度，降低了发酵生产成本。

附图说明

图1添加苹果酸对克雷伯氏菌发酵甘油产1，3-丙二醇的影响。

图2添加苹果酸对克雷伯氏菌发酵菌体生长的影响。

图3添加苹果酸对克雷伯氏菌发酵甘油产生副产物的影响(实验组)。

图4未添加苹果酸对克雷伯氏菌发酵甘油产生副产物的影响(对照组)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)菌种：克雷伯氏菌Klebsiell apneumoniae CGMCC1.9131。

(2)培养基

LB培养基(g·L^-1)：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂10g/L，调节至pH 7.0。用于克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。

种子及发酵培养基见表1：

表1培养基组成表(L^-1)

其中，微量元素溶液的配方见下表。

表2微量元素溶液配方(L^-1)

(3)培养方式：

A、种子活化

从甘油管保藏的菌种接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。

B、种子培养

种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量100mL，接入斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1。

C、发酵培养

摇瓶发酵培养：250mL三角瓶，100mL发酵培养基，接种量1％，培养温度37℃，150r·min^-1摇床培养，CaCO₃调节pH。为了考察不同浓度苹果酸的影响，分别设置0.67g/L、2.01g/L、3.35g/L三个加入不同浓度苹果酸的实验组，NaOH调节pH至7.0；对照组不加入苹果酸。

(4)发酵结果

发酵8小时，结果见表3。

表3添加不同浓度苹果酸后发酵甘油生产1，3-丙二醇

从摇瓶发酵8小时结果可以得出添加不同浓度苹果酸后，均促进了菌体的生长与代谢。添加0.67、2.01、3.35g/l苹果酸后菌体生物量比分别对照提高4.26％、7.66％、15.74％；甘油消耗速率分别比对照提高7.52％、13.16％、15.79％；1，3-丙二醇浓度分别比对照提高10.60％、21.39％、27.48％；1，3-丙二醇生产强度分别比对照提高11.0％、22.05％、27.56％；1，3-丙二醇质量得率分别比对照提高2.92％、7.10％、10.23％；同时促进了副产物丁二酸、乳酸、乙酸及2，3-丁二醇的代谢。

发酵12小时，结果见表4。

表4添加不同浓度苹果酸后发酵甘油生产1，3-丙二醇

从摇瓶发酵12小时结果可以得出添加不同浓度苹果酸后，均促进了菌体的生长与代谢。添加0.67、2.01、3.35g/l苹果酸后菌体生物量比分别对照提高2.28％、12.81％、23.12％；甘油消耗速率分别比对照提高7.65％、14.37％、21.10％；1，3-丙二醇浓度分别比对照提高7.05％、13.45％、21.36％；1，3-丙二醇生产强度分别比对照提高7.10％、13.55％、21.29％；1，3-丙二醇质量得率与对照基本相当；同时促进了副产物丁二酸、乳酸、乙酸的代谢。

发酵24小时，结果见表5。

表5添加不同浓度苹果酸后发酵甘油生产1，3-丙二醇

从摇瓶发酵24小时结果可以得出添加不同浓度苹果酸后，均促进了菌体的生长与代谢。添加0.67、2.01、3.35g/l苹果酸后菌体生物量比分别对照提高0.48％、18.98％、28.22％；在24小时，底物甘油均已完全消耗；产物1，3-丙二醇浓度分别比对照提高1.87％、7.86％、7.07％；1，3-丙二醇质量得率分别比对照提高1.97％、7.86％、7.21％；同时促进了副产物丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇的代谢。

实施例2

(1)菌种：同实施例1。

(2)种子培养基同实施例1，发酵培养基除甘油浓度为15g/l外，其它组成同实施例1。

(3)培养方式：

A、种子活化

B、种子培养

种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量50mL，接入斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1。

C、发酵培养

在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1％，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm。发酵前期实验罐中加入苹果酸至5.0g/L，NaOH调节pH至7.0；对照组不加入苹果酸。发酵温度均恒定在37℃，发酵过程中体系pH通过流加40％的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，对数生产期甘油浓度控制在1-5g/l，进入平台期后，甘油浓度控制在10-30g/l。

(4)发酵结果

发酵进行48小时，菌体生长、1，3-丙二醇及副产物生产情况结果见图1～4及表6。

表6添加苹果酸后发酵甘油生产1，3-丙二醇菌体生长、1，3-丙二醇及副产物生产

情况

从5L搅拌发酵罐流加甘油发酵48小时结果可以得出添加5g/L苹果酸后，促进了菌体对甘油的利用，菌体生长比对照提高26.33％甘油消耗速率比对照提高3.51％，1，3-丙二醇浓度比对照提高6.20％，1，3-丙二醇生产强度比对照提高5.88％，1，3-丙二醇质量得率比对照提高2.52％，同时促进了副产物丁二酸、乳酸及2，3-丁二醇的合成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括培养基制备、种子培养和发酵产1,3-丙二醇步骤，其特征在于，在发酵过程中，往发酵液中添加苹果酸，发酵液中添加苹果酸的终浓度为0.67g/L、2.01g/L或3.35g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加苹果酸的时机为在发酵开始至发酵菌达到对数生长期。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，添加苹果酸的时机为发酵菌达到对数生长初期。

4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述的发酵菌株为克雷伯氏菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵为有氧发酵。