CN102296093A - 一种氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤，根据丙酮丁醇梭菌厌氧发酵生产丁醇时氧化还原电位变化的特性，在发酵体系中引入ORP电极，结合氧化剂过氧化氢、硫酸铁或铁氰化钾，以及还原剂维生素C、硼氢化钠或硫化钠对发酵体系的ORP进行调节，将厌氧发酵的初期ORP控制在-550±5mv，当OD600长到2后，再将ORP控制在-525±5mv。此方法操作简便，对于厌氧发酵控制参数的研究和生物基丁醇的制备研究，具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
20世纪初，丙酮、丁醇发酵是仅次于乙醇发酵的第二大发酵工业，但随着石油化工的发展，逐步被化学法替代。随着石油资源的日益紧缺，生物法生产丙酮、丁醇重新显示出优势。受世界石油资源价格、环保和全球气候变化的影响，发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。生物丁醇以其能量密度高、腐蚀性小、对水的宽容度大、可以和汽油混合等许多优于生物乙醇之处而受到世界各国的广泛关注。丁醇不仅是优良的有机溶剂和重要的化工原料，能应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业，而且还是一种极具潜力的新型生物燃料，在替代汽油作为燃料方面优于乙醇。
丁醇，又称正丁醇，是重要的有机化工原料，可用作油漆和表面涂料，也用于生产邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)等增塑剂，还用来制造醋酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、正丁胺、氨基树脂、乙二醇醚，并可用于表面涂料、皮革处理、香料、橡胶加工助剂和农用化学品等方面。随着我国化学工业和医药工业的不断发展，丁醇将有一定增长[柴国梁.国内丁醇市场分析.上海化工，2006，31(2)：49-52]。从丁醇的消费市场看，丙烯酸丁酯和醋酸丁酯需求的强劲增长将是推动丁醇消费增长的主要动力。
丙酮、丁醇发酵是丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum，简称丙丁菌)等在厌氧条件下将葡萄糖、木糖等代谢为丙酮、丁醇和乙醇的生物化学过程。丙丁菌的代谢途径开始是从葡萄糖经丙酮酸到大量乙酸、丁酸积累，然后从乙酸和丁酸形成丙酮、丁醇和乙醇。
发酵体系的氧化还原电位值是pH值、溶解氧浓度、平衡常数和大量溶解培养基中物质的氧化还原电位的综合反映[Ishizaki A，Snibai H，Hirose Y.Basic aspects ofelectrodepotential change in submerged fermentation[J].Agric.Biol.Chem.，1974，38：2399-2405]。胞外的氧化还原电位可以影响胞内的酶活、NADH/NAD+的比例，从而可以影响菌体的代谢。目前，有关氧化还原电位用于发酵过程的调控已经在许多专利中出现。中国专利CN101307339报道了江南大学孙志浩等调节厌氧发酵产琥珀酸过程中菌体生长与产酸的ORP值，选取适合于菌体生长与产酸的ORP值作为发酵控制参数，以达到提高琥珀酸产量和降低副产物浓度的目的。中国专利CN101235397报道了华东理工大学王永红等控制发酵液的氧化还原电位为-190～-150mv，使得菌体较快适应发酵环境，以高的比生长速率生长，可大大提高乳酸菌生产乳酸的产量。中国专利CN101182555报道了南京工业大学李建等将氧化还原电位控制在最适值，达到了丁二酸的高效率生产，减少了副产物生成，缩短了发酵时间。
丙酮丁醇梭菌的氧化还原电位包括两方面。一方面由于它缺乏氧化还原电位较高的细胞色素和细胞色素酶，对于许多代谢物就不能或很少氧化，能量供应就不足。因此，它不能在有氧或氧化还原电势较高的环境中生长。另一方面，当丙酮丁醇梭菌种子液接入培养基后，细胞的周围被菌液带来的还原性物质所包围，开始进行代谢。培养基中的营养物被微生物的氧化还原酶系氧化，并通过酶系的传递，使培养基中的氧及其它氧化物质被还原，细菌中获得能量，同时培养基中的氧化型物质浓度降低。也就是说，细菌本身的代谢起到了还原的作用，使自己建立了一个还原电位低到可以生长的环境，得以继续进行生长繁殖。
丙酮丁醇发酵过程是一个厌氧发酵的过程，且可分为两个时期，即产酸期、产醇期。在产酸期，pH值下降，丙丁菌细胞数目激烈增加，溶剂产生很少，主要发酵产物是乙酸、丁酸、H2和CO2等；在产醇期，丁酸和乙酸被还原，pH值上升，其减酸速率与前发酵期的升酸速率相似，其中丁酸的减少比乙酸多，转变成丙酮、丁醇等溶剂，在这个时期，发酵现象最旺盛，菌体活力最强，菌体数量最多[陈騊声.发酵法丙酮和丁醇生产技术.北京：化学工业出版社，1991]。两个发酵阶段的氧化还原电位值有一定的变化规律，产酸期ORP值较高有利于均提升长，产醇期ORP值较低有利于产醇。
现有的技术中还没有直接通过筛选合适的氧化剂与还原剂来设计合适的ORP调控策略来提高丁醇和总溶剂的产量以及提高总溶剂转化率和生产速率的专利或其他文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，以达到提高丁醇和总溶剂产量、生产速率和转化率的技术效果。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤，根据丙酮丁醇梭菌厌氧发酵生产丁醇时氧化还原电位变化的特性，在发酵体系中引入ORP电极，结合氧化剂过氧化氢、硫酸铁或铁氰化钾，以及还原剂维生素C、硼氢化钠或硫化钠对发酵体系的ORP进行调节，将厌氧发酵的初期ORP控制在-550±5mv，当OD600长到2后，再将ORP控制在-525±5mv。
其中，氧化剂过氧化氢、硫酸铁、铁氰化钾分别为浓度1～2g/L的水溶液；还原剂维生素C、硼氢化钠或硫化钠分别为为浓度1～2g/L的水溶液。
其中，所述的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16CCTCC NO：M 2010011，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)AS1.134CGMCC1.134，或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)AS1.135CGMCC 1.135。
其中，所述的菌种活化步骤中，菌种由冻存的甘油管中接入50mL血清瓶的pH为6.0～7.0的含有淀粉或糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基中，通入N2或CO2，在恒温培养箱中培养，温度为30～40℃，活化培养12～24h，用于种子培养基接种和菌种保存。
其中，所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH 6.0～7.0的含有淀粉或糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基，培养时将500mL血清瓶中加入种子培养基100～400mL，通入N2或CO2，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入活化的种子液，培养温度为30～40℃，在恒温培养箱中培养，培养时间为8～16h，用于发酵罐接种。
其中，所述的厌氧发酵生产丁醇的步骤中，发酵培养的培养基为pH 6.0～7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，发酵罐中放入pH电极和ORP电极，接种量为5％～10％(v/v)，温度为35～40℃，发酵罐通入N2或CO2以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100～200rpm，并利用强酸和强碱控制发酵过程pH在4.0～6.0，发酵的初期ORP控制在-550±5mv，当OD600长到2后，再将ORP控制在-525±5mv，发酵总时间为36～72h。
其中，所述的强碱为2mol/L的氢氧化钠水溶液，强酸为2mol/L的盐酸水溶液。
本发明的有益效果在于本发明通过ORP电极检测发酵过程的ORP值变化，加入氧化剂和还原剂，并将体系的pH控制在最适值，达到丁醇的高效率生产，提高了丁醇以及总溶剂的生产强度。本发明采用ORP电极测定丁醇发酵体系的ORP值，并利用氧化剂和还原剂控制发酵体系的ORP值，对于厌氧发酵控制参数的研究和生物基丁醇的制备研究，具有重要的理论意义和应用价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
对比例1：
菌种：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16CCTCC NO：M 2010011。
本发明所有实施例中的种子培养基、发酵培养基应理解为现有技术中任何可实现丙丁菌发酵丁醇所适用的常规培养基，在本实施例中如下配方。
活化及种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl2g/L，MgSO43g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，pH6.0。
发酵培养基(P2)：碳源(葡萄糖60g/L单独灭菌)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，NaCl 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的活化培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5％的体积比接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10％(v/v)，搅拌转速在120rpm，37℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境，控制发酵过程pH在4.0～6.0，通过校准的ORP电极测定发酵体系的ORP值，整个发酵过程中控制ORP值处于-550±5mv。当ORP低于设定值时，采用盐酸和铁氰化钾升高ORP值，当ORP值高于设定值时，采用氢氧化钠和硫化钠降低ORP值，并与不控制ORP值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。本实施例与对照组(对照组为不调控ORP，其它条件与本实施例相同)的对比结果如表1。
表1ORP(-550±5mv)与对照组的发酵结果对比
对比例2：
菌种：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16CCTCC NO：M 2010011。
本发明所有实施例中的种子培养基、发酵培养基应理解为现有技术中任何可实现丙丁菌发酵丁醇所适用的常规培养基，在本实施例中如下配方。
活化及种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl2g/L，MgSO43g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，pH6.0。
发酵培养基(P2)：碳源(葡萄糖60g/L单独灭菌)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的活化培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5％的体积百分比接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10％(v/v)，搅拌转速在120rpm，37℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。控制发酵过程pH在4.0～6.0，通过校准的ORP电极测定发酵体系的ORP值，整个发酵过程中控制ORP值处于-525±5mv。当ORP低于设定值时，采用盐酸和铁氰化钾升高ORP值，当ORP值高于设定值时，采用氢氧化钠和硫化钠降低ORP值，并与不控制ORP值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。本实施例与对照组(对照组为不调控ORP，其它条件与本实施例相同)的对比结果如表2。
表2ORP(-525±5mv)与对照组的发酵结果对比
实施例1：
菌种：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)AS1.135CGMCC 1.135。
本发明所有实施例中的种子培养基、发酵培养基应理解为现有技术中任何可实现丙丁菌发酵丁醇所适用的常规培养基，在本实施例中如下配方。
活化及种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl2g/L，MgSO43g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，pH6.0。
发酵培养基(P2)：碳源(葡萄糖60g/L，单独灭菌)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，NaCl 0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的活化培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5％的体积百分比接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10％(v/v)，搅拌转速在120rpm，37℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。控制发酵过程pH在4.0～6.0，通过校准的ORP电极测定发酵体系的ORP值，前期控制ORP值处于-550±5mv，当OD600长到2后，将ORP值调到-525±5mv。当ORP低于设定值时，采用盐酸和铁氰化钾升高ORP值，当ORP值高于设定值时，采用氢氧化钠和硫化钠降低ORP值，并与不控制ORP值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。本实施例与对照组(对照组为不调控ORP，其它条件与本实施例相同)的对比结果如表3。
表3实施例1(-550±5mv～-525±5mv)与对照组的发酵结果对比
实施例2：
菌种：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16CCTCC NO：M 2010011。
活化及种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl2g/L，MgSO43g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，pH6.0。
发酵培养基(P2)：碳源(葡萄糖60g/L，单独灭菌)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的活化培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5％的体积百分比接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10％(v/v)，搅拌转速在120rpm，37℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。控制发酵过程pH在4.0～6.0，通过校准的ORP电极测定发酵体系的ORP值，前期控制ORP值处于-550±5mv，当OD600长到2后，将ORP值调到-525±5mv。当ORP低于设定值时，采用盐酸和硫酸铁升高ORP值，当ORP值高于设定值时，采用氢氧化钠和硼氢化钠降低ORP值，并与不控制ORP值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。结果如表4。
表4实施例2(-550±5mv～-525±5mv)与对照组的发酵结果对比
实施例3：
菌种：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)AS1.134CGMCC 1.134。
活化及种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，NaCl2g/L，MgSO43g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，pH6.0。
发酵培养基(P2)：碳源(葡萄糖60g/L，单独灭菌)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl 0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为3L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的活化培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5％的体积百分比接入含有300mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10％(v/v)，搅拌转速在120rpm，37℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。控制发酵过程pH在4.0～6.0，通过校准的ORP电极测定发酵体系的ORP值，前期控制ORP值处于-550±5mv，当OD600长到2后，将ORP值调到-525±5mv。当ORP低于设定值时，采用盐酸和双氧水升高ORP值，当ORP值高于设定值时，采用氢氧化钠和维生素C降低ORP值，并与不控制ORP值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。结果如表5。
表5实施例3(-550±5mv～-525±5mv)与对照组的发酵结果对比
Claims (7)
1.一种氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤，其特征在于，根据丙酮丁醇梭菌厌氧发酵生产丁醇时氧化还原电位变化的特性，在发酵体系中引入ORP电极，结合氧化剂过氧化氢、硫酸铁或铁氰化钾，以及还原剂维生素C、硼氢化钠或硫化钠对发酵体系的ORP进行调节，将厌氧发酵的初期ORP控制在-550±5mv，当OD600长到2后，再将ORP控制在-525±5mv。
2.根据权利要求1所述的氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，氧化剂过氧化氢、硫酸铁、铁氰化钾分别为浓度1～2g/L的水溶液；还原剂维生素C、硼氢化钠或硫化钠分别为为浓度1～2g/L的水溶液。
3.根据权利要求1所述的氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16CCTCC NO：M 2010011，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)AS1.134CGMCC 1.134，或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)AS1.135CGMCC 1.135。
4.根据权利要求1所述的氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的菌种活化步骤中，菌种由冻存的甘油管中接入50mL血清瓶的pH为6.0～7.0的含有淀粉或糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基中，通入N2或CO2，在恒温培养箱中培养，温度为30～40℃，活化培养12～24h，用于种子培养基接种和菌种保存。
5.根据权利要求1所述的氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH 6.0～7.0的含有淀粉或糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基，培养时将500mL血清瓶中加入种子培养基100～400mL，通入N2或CO2，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入活化的种子液，培养温度为30～40℃，在恒温培养箱中培养，培养时间为8～16h，用于发酵罐接种。
6.根据权利要求1所述的氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的厌氧发酵生产丁醇的步骤中，发酵培养的培养基为pH 6.0～7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，发酵罐中放入pH电极和ORP电极，接种量为5％～10％(v/v)，温度为35～40℃，发酵罐通入N2或CO2以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100～200rpm，并利用强酸和强碱控制发酵过程pH在4.0～6.0，发酵的初期ORP控制在-550±5mv，当OD600长到2后，再将ORP控制在-525±5mv，发酵总时间为36～72h。
7.根据权利要求1所述的氧化还原电位调控厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的强碱为2mol/L的氢氧化钠水溶液，强酸为2mol/L的盐酸水溶液。
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Application publication date: 20111228 |