CN104651339A - 微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法 - Google Patents

微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基，包括菌种种子培养基及发酵培养基。本发明还公开了一种微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，在摇瓶发酵的基础上，对所筛选的微泡菌属进行了发酵罐的发酵培养，进行了发酵条件优化的探究，研究其在发酵罐中的产酶规律，有效的提高了褐藻胶裂解酶产量，最后对微泡菌属ALW1发酵产褐藻胶裂解酶进行了中试放大发酵，为今后的大规模生产提供了重要的技术参数指导。

Description

微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵的技术领域，尤其涉及一发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法。
背景技术
褐藻胶是由α-L-古罗糖醛酸及其C5差向异构体β-D-甘露糖醛酸组成的高分子线性聚合物。褐藻胶由于其相对分子质量大及溶解度较低等性质导致应用受到一定的限制，近年来随着低聚糖的研究深入，其较高的生物活性也逐渐受到重视，在医药、食品、工业等领域展现出广泛的应用前景。
褐藻寡糖可以通过物理降解、化学降解、以及酶降解法得到，其中，酶解法由于其反应条件温和，可控性强、产率高等特点逐渐取代物理化学法，可用褐藻胶裂解酶作为工具酶来制备生物活性的褐藻胶寡糖. 褐藻胶裂解酶可以降解藻类细胞壁制备原生质，用于藻类基础研究，褐藻胶裂解酶本身具有一定的药用价值，用于治疗由致病菌P. aeruginosa引起的肺炎，在解决P. aeruginosa生物膜耐药性强、所致感染难以根治方面具有巨大前景。
目前，我国对褐藻胶裂解酶的研究比较基础，国内外的研究也主要集中于菌种分离、基因工程菌的构建及酶学性质的改善、酶解产物的构效等方面,而有关褐藻胶裂解酶的发酵工艺及发酵动力学的研究报道很少，褐藻酸裂解酶工业用酶的缺乏成为褐藻与褐藻酸高值化加工的瓶颈。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基，利用一株能降解褐藻胶的微泡菌属（Microbulbifersp.ALW1）（来源于中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号：23821），采用本发明的培养基后，可以有效提高发酵生产褐藻胶裂解酶的单位产量。
本发明的另一目的在于提供利用上述培养基进行微泡菌属发酵褐藻胶裂解酶的方法，通过种子活化、摇瓶发酵、罐上发酵及中试放大发酵的逐级放大培养步骤，确定最佳的发酵条件，进而提高最终发酵液中褐藻胶裂解酶的单位产量。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
一种微泡菌属ALW1发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基，包括种子培养基及发酵培养基；
所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L， K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
所述发酵培养基为：海藻酸钠1g/L， NaCl 60 g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L， FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min。
本发明还涉及所述微泡菌属ALW1利用如上所述培养基生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，包括以下步骤：
种子的活化与制备：将上述微泡菌属ALW1菌种接至有种子培养基的摇瓶中培养，获得摇瓶种子液。
摇瓶发酵：摇瓶种子液接种至装有适用于微泡菌属产褐藻胶裂解酶的发酵培养基的摇瓶之中，25℃，180r/min培养60 h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液。
罐上发酵：摇瓶种子液接种至装有发酵培养基的5 L发酵罐中，25℃培养72h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液。
中试放大发酵：摇瓶种子液接种至装有发酵培养基的20 L的发酵罐中，25℃培养72 h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液；或者摇瓶种子液接种至装有种子培养基的20L发酵罐中，25℃培养18h，获得发酵罐种子液，再将发酵罐种子液接种至装有发酵培养基的200 L发酵罐中，25℃培养72h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液。
作为实施例的优选方式，所述种子的活化与制备，将-20℃保藏的甘油管菌种解冻后接于装有种子培养基250 mL摇瓶中，25℃，180 r/min发酵48h，获得摇瓶种子液。
作为实施例的优选方式，所述摇瓶发酵，将培养好的摇瓶种子液以5%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，25℃，180 r/min发酵60h。
作为实施例的优选方式，所述罐上发酵，将培养好的摇瓶种子液按照5%的接种量接入装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，25℃，100r/min发酵72 h。
作为实施例的优选方式，所述中试放大发酵，将培养好的种子按照5%的接种量接入装有10 L发酵培养基的20 L罐中，25℃发酵72 h。
作为实施例的优选方式，所述中试放大发酵，将培养好的摇瓶种子液按照5%的接种量接入装有5 L种子培养基的20 L罐中，25℃发酵18h，获得发酵罐种子液，再将发酵罐种子液接种至装有100 L发酵培养基的200 L罐中，25℃发酵72 h。
本发明采用上述技术方案后，在摇瓶发酵的基础上，对本发明人所筛选的微泡菌属进行了发酵罐的发酵培养，进行了发酵条件优化工艺的探究，研究其在发酵罐中的产酶规律，有效提高了褐藻胶裂解酶的产量，最后对微泡菌属ALW1发酵产褐藻胶裂解酶进行了中试放大试验，为今后的大规模生产提供了重要的技术参数指导。
附图说明
图1微泡菌属ALW1培养平板；
图2微泡菌属ALW1产褐藻胶裂解酶的罐上发酵曲线；
图3微泡菌属ALW1产褐藻胶裂解酶的20L罐上发酵曲线；
图4微泡菌属ALW1产褐藻胶裂解酶的200L罐上发酵曲线。
具体实施方式
下列实施例中采用的检测方法：
生物量的测定:均匀吸取1.0 ml 发酵液，12000 r/min离心10 min，去掉上清液后用蒸馏水梯度稀释至6倍，以蒸馏水作空白，600 nm 波长测吸光值。
褐藻胶裂解酶活力的测定:均匀取1.0mL发酵液，12000 r/min离心10min，准确吸取0.3mL上清液，用50 mmol/L NaH2PO4—Na2HPO4缓冲液（pH 7.0）稀释4倍，取250μL稀释液，添加500 μL 溶于50 mmol /L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH 7.0）的0.5%的海藻酸钠（溶解后保温于40℃水浴中），40℃ 温浴30min，加0.5 mL DNS沸水浴5 min后立即冷却，稀释到5 mL，测540 nm处的吸光值，然后依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，以检测发酵液中褐藻胶裂解酶的活力。以沸水浴灭活5 min的酶液作为对照。以上述条件下1 min催化产生1 μg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
实施例1：微泡菌属ALW1的筛选
本发明首先在海带样品中分离得到了一株能降解褐藻胶的微泡菌属（Microbulbifer sp.ALW1）（CICC保藏编号：23821），再采用本发明的培养基后，可以有效提高微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的单位产量。将海带样品加入摇瓶中培养，培养液梯度稀释涂布平板，挑取单菌落接入海藻酸钠为唯一碳源的发酵培养基中，检测发酵液酶活力，获得含有褐藻胶裂解酶活力的菌株，如图1所示。经鉴定为微泡菌属属，命名为微泡菌属ALW1。
实施例2：微泡菌属ALW1的摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶
（1）将-20℃保藏的甘油管菌种解冻后接于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中,25℃，180r/min培养48h，获得摇瓶种子液。所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（2）将培养好的摇瓶种子液以5%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，25℃，180 r/min发酵60 h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。所述发酵培养基为：海藻酸钠1g/L，NaCl 60 g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min
（3）均匀取1.0 mL含褐藻胶裂解酶的发酵液，12000 r/min离心10min，测定所得清液的琼胶酶活力为117.12U/mL。
实施例3：微泡菌属ALW1的罐上发酵生产褐藻胶裂解酶
（1）将-20℃保藏的甘油管菌种解冻后接于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，25℃，180r/min培养48h，获得摇瓶种子液。所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（2）将培养好的摇瓶种子液按照5%的接种量接入装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，25℃，100r/min发酵72 h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。所述发酵培养基为：海藻酸钠1g/L，NaCl 60 g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min ，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（3）取样检测发酵过程的生物量、褐藻胶裂解酶活力变化，结果如图2所示。发酵至36 h时酶活力达到最大值144.2 U/mL。
实施例4：微泡菌属ALW1发酵生产褐藻胶裂解酶的中试放大发酵
（1）将-20℃保藏的甘油管菌种解冻后接于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中25℃，180 r/min发酵48 h，获得摇瓶种子液。所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L， K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（2）将培养好的摇瓶种子液按照5%的接种量接入装有10 L发酵培养基的20 L罐中，25℃发酵72h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。所述发酵培养基为：海藻酸钠1g/L，NaCl 60 g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（3）取样检测发酵过程的褐藻胶裂解酶活力变化，结果如图3所示。20 L罐上发酵产酶规律与5L罐基本一致， 20 L罐琼胶酶活力最高达到57.02U/mL。
实施例5：微泡菌属ALW1发酵生产褐藻胶裂解酶的中试放大发酵
（1）将-20℃保藏的甘油管菌种解冻后接于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中25℃培养48h，获得活化的微泡菌属ALW1摇瓶种子液。所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（2）将培养好的摇瓶种子液按5%接种量接于装有5L种子培养基的20L发酵罐中，25℃，150r/min发酵18h，获得发酵罐种子液。所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min
（3）将培养好的发酵罐种子液按照5%的接种量接入装有100 L发酵培养基的200 L罐中，25℃发酵72 h。所述发酵培养基为：海藻酸钠1g/L， NaCl 60 g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L， FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
（4）取样检测发酵过程的褐藻胶裂解酶活力变化，结果如图4所示。200 L罐上发酵产酶规律与5L罐和20 L罐基本一致，200 L罐酶活力最高达到43.54U/mL 。
本发明在摇瓶发酵的基础上，对本发明人所筛选的微泡菌属进行了发酵罐的发酵培养，进行了发酵条件优化探究，研究其在发酵罐中的产酶规律，有效提高了褐藻胶裂解酶产量，最后对微泡菌属ALW1发酵产褐藻胶裂解酶进行了中试放大试验，为今后的大规模生产提供了重要的技术参数指导。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种微泡菌属ALW1发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基，其特征在于：包括种子培养基及发酵培养基；
所述种子培养基为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L， K2HPO4 2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min；
所述发酵培养基为：海藻酸钠1g/L， NaCl 60 g/L，K2HPO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L， FeSO4·7H2O 0.06g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min。
2.如权利要求1所述的微泡菌属ALW1生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
种子的活化与制备：将上述微泡菌属ALW1菌种接至种子培养基中活化，获得摇瓶种子液；
摇瓶发酵：摇瓶种子液接种至装有适用于微泡菌属ALW1产褐藻胶裂解酶发酵培养基的摇瓶之中，25℃培养60 h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液；
罐上发酵：摇瓶种子液接种至装有发酵培养基的5 L发酵罐中，25℃培养72 h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液；
中试放大发酵：摇瓶种子液接种至装有发酵培养基的20 L的发酵罐中，25℃培养72 h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液；或者摇瓶种子液接种至装有种子培养基的20L发酵罐中，25℃培养18h，获得发酵罐种子液，再将发酵罐种子液接种至装有发酵培养基的200 L发酵罐中，25℃培养72h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液。
3.如权利要求2所述的微泡菌属ALW1生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，其特征在于：所述种子的活化与制备：将-20℃保藏的甘油管菌种解冻后接于装有种子培养基的摇瓶中，25℃培养48 h，获得活化的摇瓶种子液。
4.如权利要求2所述的微泡菌属ALW1生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，其特征在于：所述摇瓶发酵，将培养好的摇瓶种子液以5%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，25℃，180 r/min发酵60 h。
5.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述罐上发酵，将培养好的摇瓶种子液按照5%的接种量接入装有4 L发酵培养基的5 L发酵罐中，25℃，100 r/min发酵72 h。
6.如权利要求2所述的微泡菌属ALW1生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，其特征在于：所述中试放大发酵，将培养好的种子按照5%的接种量接入装有10 L发酵培养基的20 L罐中，25℃发酵72 h。
7.如权利要求2所述的一种微泡菌属ALW1发酵生产褐藻胶裂解酶的发酵方法，其特征在于：所述中试放大发酵，将培养好的摇瓶种子液按照5%的接种量接入装有5 L种子培养基的20 L罐中，25℃发酵18h，获得发酵罐种子液，再将发酵罐种子液接种至装有100 L发酵培养基的200 L罐中，25℃发酵72 h。
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