CN102653749A - 微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述的一种微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法是将产生溶菌酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的壳聚糖酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温壳聚糖酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温壳聚糖酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温壳聚糖酶主要应用于制备具有独特生理活性和功能的壳寡糖，用于环保、医药、食品、化妆品、生态农业病虫害防治、以及其他壳聚糖酶应用行业。可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，减少工艺流程，增加经济效益，改善并提高产品质量。
背景技术
壳聚糖酶(Chitosanase，EC 3.2.1.132)是一类催化壳聚糖分子中β-1，4-糖苷键断裂，专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶(逄玉娟等，中国海洋大学学报，2005)。水解壳聚糖制备功能性低分子量壳寡糖，在功能食品、保健药品等行业具有广泛的应用，还具有抗细菌、真菌、调节机体免疫及抗癌等功能(屠洁，江苏农业科学，2009)。目前国内外对微生物发酵生产壳聚糖酶研究与应用主要集中于中温壳聚糖酶和高温壳聚糖酶；有关微生物发酵生产的低温壳聚糖酶的研究处于起步阶段，主要是菌株选育、发酵条件、酶学性质及酶分子特性等研究(阳丽等，化学工程与装备，2010；陈小娥等，食品与发酵工业，2004；季更生等，食品科学，2010)；微生物发酵生产的低温壳聚糖酶产业化、规模化生产及应用还未见报道(黄永春等，化工进展，2002)。微生物发酵生产的低温壳聚糖酶与高温、中温壳聚糖酶相比具有很大的应用优势，因为低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(黄益等，生物技术，2008)，这将有助于微生物发酵生产的低温壳聚糖酶的推广和使用。微生物发酵生产的低温壳聚糖酶的应用将对传统的农业、食品、医药、化工、能源和环保等领域产生深远的影响(王宏钦等.工业微生物，2000；方文建等，中国医药工业杂志，2006)。微生物发酵生产的低温壳聚糖酶用于壳寡糖生产相比于化学方法合成壳寡糖以及中温、高温酶转化方法，具有反应条件温和、寡糖得率高、对环境污染小、产物安全性高等优势，降低生产成本，减少生产工艺流程，提高生产效率(戴大章，功能高分子学报，2005)。可以从根本上摆脱中温酶、高温酶以及化学合成等方法生产壳寡糖的加热、冷却设备和工艺。微生物发酵生产的低温壳聚糖酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明是提供一种微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10～16℃液体发酵生产低温壳聚糖酶的方法，发酵液酶活力最高达到170U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。添加该酶制剂在低于30℃催化就可明显提高原料的转化率。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
本发明所述的一种微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法具体包括以下步骤：
(1)将产生壳聚糖酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的壳聚糖酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温壳聚糖酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。壳聚糖酶产生菌(例如，CGMCC菌种编号：4.477等)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温壳聚糖酶，低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25％甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式
实施例一：
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖2.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂20.0g，pH值7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨7.0～13.0g，酵母提取物3.0～7.0g，葡萄糖1.5～2.5g，NaCl 3.0～7.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
③液体种子培养基：葡萄糖1.5～2,5g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母提取物3.0～7.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.5g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O0.4～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基：壳聚糖5.0～15.0g，葡萄糖1.0～4.0g，蛋白胨5.0～15.0g，酵母提取物3.0～8.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.6g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O 0.2～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生壳聚糖的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的壳聚糖酶产生菌在10～16℃培养48～72h而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入10L的产酶培养基中，在10～12℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温壳聚糖酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温壳聚糖酶制剂。
实施例二：
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖2.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂20.0g，pH值7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨7.0～13.0g，酵母提取物3.0～7.0g，葡萄糖1.5～2.5g，NaCl 3.0～7.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
③液体种子培养基：葡萄糖1.5～2,5g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母提取物3.0～7.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.5g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O0.4～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基：壳聚糖5.0～15.0g，葡萄糖1.0～4.0g，蛋白胨5.0～15.0g，酵母提取物3.0～8.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.6g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O 0.2～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生壳聚糖的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的壳聚糖酶产生菌在10～16℃培养48～72h而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5～7％的接种量接入50L的产酶培养基中，在12～14℃培养96～120h时，即微生物发酵生产低温壳聚糖酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温壳聚糖酶制剂。
实施例三：
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖2.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂20.0g，pH值7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：蛋白胨7.0～13.0g，酵母提取物3.0～7.0g，葡萄糖1.5～2.5g，NaCl 3.0～7.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
③液体种子培养基：葡萄糖1.5～2,5g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母提取物3.0～7.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.5g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O0.4～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基：壳聚糖5.0～15.0g，葡萄糖1.0～4.0g，蛋白胨5.0～15.0g，酵母提取物3.0～8.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.6g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O 0.2～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生壳聚糖的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的壳聚糖酶产生菌在10～16℃培养48～72h而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7～9％的接种量接入100L的产酶培养基中，在14～16℃培养72～96h时，即微生物发酵生产低温壳聚糖酶结束；
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温壳聚糖酶制剂。
Claims (3)
1.一种微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法，其包括以下步骤：
(1)将产生壳聚糖酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的壳聚糖酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温壳聚糖酶结束；
(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；
(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(5)之后进一步包括：将步骤(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、发酵产酶培养基分别为：
(1)菌种低温驯化培养基：蛋白胨7.0～13.0g，酵母提取物3.0～7.0g，葡萄糖1.5～2.5g，NaCl 3.0～7.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)液体种子培养基：葡萄糖1.5～2,5g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母提取物3.0～7.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.5g，NaCl 3.0～7.0g，MgSO4·7H2O0.4～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(3)发酵产酶培养基：壳聚糖5.0～15.0g，葡萄糖1.0～4.0g，蛋白胨5.0～15.0g，酵母提取物3.0～8.0g，K2HPO4 0.5～0.9g，KH2PO4 0.1～0.6g，NaCl3.0～7.0g，MgSO4·7H2O 0.2～0.6g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
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