CN102653746A - 微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 - Google Patents
微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102653746A CN102653746A CN2012101069039A CN201210106903A CN102653746A CN 102653746 A CN102653746 A CN 102653746A CN 2012101069039 A CN2012101069039 A CN 2012101069039A CN 201210106903 A CN201210106903 A CN 201210106903A CN 102653746 A CN102653746 A CN 102653746A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- beta
- liquid
- low temperature
- galactosidase
- low
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明所述的一种微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法是将产生β-半乳糖苷酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温β-半乳糖苷酶微生物发酵方法。该发明生产的低温β-半乳糖苷酶主要应用于食品工业、环保、医药等领域，可以降低生产成本，减少工艺流程，提高生产效率，增加经济效益，改善产品质量。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)又称为乳糖酶，β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，是一种无毒副作用的生物酶制剂。它能够在特定的条件下水解β-D-半乳糖苷键(β-1，4-糖苷键)，将乳糖水解成α-D-葡萄糖和β-D-半乳糖，同时乳糖酶具有转移半乳糖苷的作用，能把半乳糖连接到乳糖上，生成低聚半乳糖(李玉强等，食品添加剂，2001)。早期β-半乳糖苷酶生产方法主要是从哺乳动物组织和一些植物中提取，存在生产成本高、纯度低、生产工艺复杂等问题(张莉，东北农业大学学报，2009)；利用微生物发酵生产β-半乳糖苷酶工艺比较简单、生产成本较低、纯度高(周春雷等，极地研究，2010)。目前国内对微生物发酵生产β-半乳糖苷酶的研究集中于中、高温酶，主要是β-半乳糖苷酶产生菌筛选、理化性质及酶分子特性的研究(刘文玉等，新疆农业科学，2007；李玉强等，食品添加剂，2001)，对低温β-半乳糖苷酶的研究尚在起步阶段，产业化、规模化生产及应用还未见报道。与中、高温木聚糖酶相比，低温β-半乳糖苷酶具有更松散、柔顺的分子结构，使其在自然条件下具有高酶活及高催化效率，从而提高底物利用率，降低能耗，缩短作用过程的时间；另外，低温β-半乳糖苷酶对热敏感，可通过温和的热处理使其变性失活，从而控制酶水解程度，使产品品质不受影响，这将有助于低温β-半乳糖酶的推广和使用(李兴峰等，中国食品学报，2003)，这些优势都是中、高温β-半乳糖苷酶所无法比拟的。利用低温β-半乳糖苷酶在降低生产成本及降低能耗方面的巨大优势，可从根本上摆脱中、高温酶的加热、冷却设备和工艺，这将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如疾病、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。因此，微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶具有广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明是提供一种微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10～16℃液体发酵生产低温β-半乳糖苷酶，这种生产方法获得的低温β-半乳糖苷酶粗酶液酶活可达115U/ml，如再经过分离和纯化可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。添加该酶制剂只需在10～16℃催化就可明显提高原料的转化率。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
本发明所述的一种微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法具体包括以下步骤：
(1)将产生β-半乳糖苷酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；
(4)将(3)的发酵液4,000～8,000rpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；
(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为β-半乳糖苷酶粗酶液；
(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。β-半乳糖苷酶产生菌(例如，CICC菌种编号：10138或6046)，菌种先活化、低温驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温β-半乳糖苷酶，低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25％甘油制成的菌悬液、在-80℃条件下可以长期保藏。
具体实施方式
实施例一：
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母膏15.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 2.5g，蒸馏水1.0L，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：乳糖5.0～15.0g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏5.0～15.0g，NaCl 4.0～8.0g，K2HPO4 2.0～4.5g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
③液体种子培养基：蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏12.0～16.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO4 1.5～3.5g，琼脂15.0～25.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基：乳糖15.0～25.0g，蛋白胨5.0～15.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO4 1.0～3.5g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生β-半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃培养24～36h而后按5～8％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～5％接种量接入10L液体发酵培养基中，在10～12℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；
(6)将(5)的发酵液4,000～8,000rpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀。
(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为β-半乳糖苷酶粗酶液。
(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例二：
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母膏15.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 2.5g，蒸馏水1.0L，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：乳糖5.0～15.0g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏5.0～15.0g，NaCl 4.0～8.0g，K2HPO4 2.0～4.5g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
③液体种子培养基：蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏12.0～16.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO4 1.5～3.5g，琼脂15.0～25.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基：乳糖15.0～25.0g，蛋白胨5.0～15.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO41.0～3.5g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生β-半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃培养24～36h而后按5～8％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5～7％接种量接入50L液体发酵培养基中，在12～14℃培养96～120h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；
(6)将(5)的发酵液4,000～8,000rpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀。
(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为β-半乳糖苷酶粗酶液。
(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例三：
(1)培养基制备
①菌种活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母膏15.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 2.5g，蒸馏水1.0L，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基：乳糖5.0～15.0g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏5.0～15.0g，NaCl 4.0～8.0g，K2HPO42.0～4.5g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
③液体种子培养基：蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏12.0～16.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO41.5～3.5g，琼脂15.0～25.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
④发酵产酶培养基：乳糖15.0～25.0g，蛋白胨5.0～15.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO41.0～3.5g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)将产生β-半乳糖苷酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃培养24～36h而后按5～8％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的7～9％接种量接入100L液体发酵培养基中，在14～16℃培养72～96h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；
(6)将(5)的发酵液4,000～8,000rpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀。
(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为β-半乳糖苷酶粗酶液。
(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
Claims (3)
1.一种微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：
(1)将产生β-半乳糖苷酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(2)按常规方法将低温驯化后的β-半乳糖苷酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶结束；
(4)将(3)的发酵液4,000～8,000rpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；
(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm离心，收集到的上清为β-半乳糖苷酶粗酶液；
(6)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(6)之后进一步包括：将步骤(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为：
(1)菌种低温驯化培养基：乳糖5.0～15.0g，蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏5.0～15.0g，NaCl 4.0～8.0g，K2HPO4 2.0～4.5g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(2)液体种子培养基：蛋白胨8.0～12.0g，酵母膏12.0～16.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO4 1.5～3.5g，琼脂15.0～25.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(3)发酵产酶培养基：乳糖15.0～25.0g，蛋白胨5.0～15.0g，NaCl 4.0～7.0g，K2HPO4 1.0～3.5g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101069039A CN102653746A (zh) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | 微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101069039A CN102653746A (zh) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | 微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102653746A true CN102653746A (zh) | 2012-09-05 |
Family
ID=46729477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012101069039A Pending CN102653746A (zh) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | 微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102653746A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104630187A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-05-20 | 大连大学 | 微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法 |
| CN109182307A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-11 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法 |
| CN109207402A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-15 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法 |
| CN112980816A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-18 | 山东禹王工业技术研究院有限公司 | 一种β-半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005052043A (ja) * | 2003-08-01 | 2005-03-03 | Tokyo Univ Of Agriculture | 乳糖分解酵素、それを産生する微生物および乳製品 |
| CN1807610A (zh) * | 2006-01-23 | 2006-07-26 | 迟乃玉 | 微生物发酵生产低温纤维素酶的方法 |
| CN1932004A (zh) * | 2005-09-16 | 2007-03-21 | 新疆农业科学院微生物应用研究所 | 低温β－半乳糖苷酶菌株、低温β－半乳糖苷酶及其生产工艺 |
| CN102093987A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 大连大学 | 微生物发酵生产低温植酸酶的方法 |
-
2012
- 2012-04-12 CN CN2012101069039A patent/CN102653746A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005052043A (ja) * | 2003-08-01 | 2005-03-03 | Tokyo Univ Of Agriculture | 乳糖分解酵素、それを産生する微生物および乳製品 |
| CN1932004A (zh) * | 2005-09-16 | 2007-03-21 | 新疆农业科学院微生物应用研究所 | 低温β－半乳糖苷酶菌株、低温β－半乳糖苷酶及其生产工艺 |
| CN1807610A (zh) * | 2006-01-23 | 2006-07-26 | 迟乃玉 | 微生物发酵生产低温纤维素酶的方法 |
| CN102093987A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 大连大学 | 微生物发酵生产低温植酸酶的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘文玉 等: "低温β-半乳糖苷酶的研究进展", 《新疆农业科学》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104630187A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-05-20 | 大连大学 | 微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法 |
| CN109182307A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-11 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法 |
| CN109207402A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-15 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法 |
| CN109207402B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-07-23 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法 |
| CN109182307B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-07-23 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法 |
| CN112980816A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-18 | 山东禹王工业技术研究院有限公司 | 一种β-半乳糖苷酶发酵培养基及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1807610B (zh) | 微生物发酵生产低温纤维素酶的方法 | |
| CN102093987B (zh) | 微生物发酵生产低温植酸酶的方法 | |
| CN108441528B (zh) | 一种高效产细菌纤维素的培养基 | |
| CN102093988B (zh) | 微生物发酵生产低温脂肪酶的方法 | |
| CN102676480B (zh) | 一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法 | |
| CN102229920B (zh) | 一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的方法 | |
| CN104893997B (zh) | 一种低温生产几丁质酶的菌株及其发酵方法 | |
| CN105176883A (zh) | 一株高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其液体发酵方法 | |
| CN104611267A (zh) | 一种生活垃圾低温高效降解功能复合菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN104630166A (zh) | 微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法 | |
| CN102653746A (zh) | 微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 | |
| CN104894024B (zh) | 一株假交替单胞菌突变菌株及其应用 | |
| CN102093990B (zh) | 微生物发酵生产低温淀粉酶的方法 | |
| CN102093989B (zh) | 微生物发酵生产低温生淀粉糖化酶的方法 | |
| CN104630167A (zh) | 海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法 | |
| CN102653737A (zh) | 海洋微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN102093992B (zh) | 微生物发酵生产低温蛋白酶的方法 | |
| CN105602917A (zh) | 一种橙皮苷酶的生产方法及应用 | |
| Khalid-Bin-Ferdaus et al. | Commercial production of alpha amylase enzyme for potential use in the textile industries in Bangladesh | |
| CN105505896A (zh) | 一种转葡糖苷酶的制备方法 | |
| CN102653749A (zh) | 微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法 | |
| CN107365730B (zh) | 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法 | |
| CN102653747A (zh) | 海洋微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 | |
| CN104711208B (zh) | 一种具有高的淀粉分解能力的乳酸菌 | |
| CN102766656A (zh) | 一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120905 |