JP2005052043A - 乳糖分解酵素、それを産生する微生物および乳製品 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、低温環境下において十分な乳糖分解活性を示し、かつ穏和な熱処理により、迅速な失活が可能な乳糖分解酵素を提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、下記（１）〜（３）の理化学的性質
（１）分子量が１３９±１０ｋＤａ、
（２）ｐＨ８．５において、５〜１５℃の範囲で最大活性を示す、
（３）４５℃、１０分間の熱処理で、活性が最大活性の１０％以下に低下する、
を有する乳糖分解酵素、それを産生する微生物およびその酵素を用いて製造した乳製品である。
【選択図】 図６

Description

本発明は、乳糖分解酵素に関する。さらに詳しくは本発明は、低温で高い活性を示し、熱処理により容易に失活し、乳製品の製造に有用な乳糖分解酵素に関する。また本発明は、該乳糖分解酵素を産生する微生物および乳製品に関する。さらに本発明は、これらの製造方法に関する。

乳糖（ラクトース）分解酵素は、アミノ酸配列の相同性からグリコシルヒドロラーゼに分類される酵素である。グリコシドヒドロラーゼは二つまたはそれ以上の炭水化物単位または炭水化物と非炭水化物間のグリコシド結合を加水分解する酵素の総称で、通常アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ等の多糖を分解する酵素とは区別されるが、その意味は厳密では無い。
乳糖分解酵素は食品産業で利用され、低乳糖牛乳の製造、チーズ製造時に副産物として生成する乳清中の乳糖からガラクトース、またはグルコースの製造等に用いられている。現在市販されている乳糖分解酵素はAspergillus oryzae由来であり、５５〜６０℃に至適反応温度を有する。
しかし、食品産業における原料の処理は、栄養価、鮮度および風味維持の為に低温環境下で行われる傾向にある。低温環境下で効果的な原料処理を可能にするため、低温でも高い基質特異性と活性を示す酵素が望まれている。また、熱処理が原料に与える影響を最小限にして製品の品質を向上させるため、加熱により容易に失活する酵素が望まれている。
そのため、低温性乳糖分解酵素に関して研究がなされ、Arthrobacter属やPseudoalteromonas属の微生物により産生される酵素について幾つかの報告がなされている（非特許文献１および２参照）。
しかし、現在までに報告されている酵素の至適反応温度はいずれも２５℃以上で、５℃〜１０℃における残存活性が高く、４５℃の熱処理で失活するのに１時間程度を要する耐低温性酵素である。かかる酵素は、５℃〜１０℃の低温でも活性を維持するが、４５℃でも比較的長い時間活性を維持する。そのため、酵素を失活させる際の熱処理により製品品質に影響が出る場合がある。
ラブアンドクルズら（Loveland-Curtze, J.）,「アルスロバクター亜族に属するサイクロフィリック分離株の生化学的および分類学的分析、並びにアルスロバクターサイクロラクトフィルスの特徴（Biochemical and phylogenetic analyses of psychrophilic isolates belonging to the Arthrobacter subgroup and description of Arthrobacter psychrolactophilus）」, sp. nov. Arch. Microbiol. 171:355-63,1999. フェルナンデスら(Fernandes, S.), 「低温馴化菌からのベータ−ガラクトシダーゼの精製、特徴および乳糖加水分解への応用（Beta-galactosidase from a cold-adapted bacterium: purification, characterization and application for lactose hydrolysis)」 Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:313-321,2002.

本発明は、低温環境下において十分な乳糖分解活性を示し、かつ穏和な熱処理により、迅速な失活が可能な乳糖分解酵素を提供することを目的とする。
また本発明は、該乳糖分解酵素を産生する微生物を提供することを目的とする。
さらに本発明は、該乳糖分解酵素を用いて製造した、該乳糖分解酵素またはこれを産生する微生物を含有する乳製品を提供すること目的とする。
加えて本発明は、これらの製造方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者は、自然界より新規な好低温性乳糖分解酵素生産菌を探索し、その酵素化学的諸性質を通して、実用化の可能性を検討した。
すなわち、本発明に係る新規な好低温性乳糖分解酵素は、下記（１）〜（３）の理化学的性質、
（１）分子量が１３９±１０ｋＤａ、
（２）ｐＨ８．５において、５〜１５℃の範囲で最大活性を示す、
（３）４５℃、１０分間の熱処理で、活性が最大活性の１０％以下に低下する、
を併有する。
また本発明は、該乳糖分解酵素を産生する微生物である。
さらに本発明は、該乳糖分解酵素またはこれを産生する微生物を含有する乳製品である。
また本発明は、該乳糖分解酵素を産生する微生物を培養し、培養物から採取することを特徴とする乳糖分解酵素の製造方法である。
さらに本発明は、生乳および／または乳清を、該乳糖分解酵素の存在下、５〜１５℃の温度で酵素処理することからなる乳製品の製造方法を包含する。

本発明によれば、低温環境下において十分な乳糖分解活性を示し、かつ穏和な加熱により、迅速な熱失活が可能な乳糖分解酵素を提供することができる。
また本発明によれば、該乳糖分解酵素を産生する微生物を提供することができる。
さらに本発明によれば、該乳糖分解酵素を用いて製造した、該乳糖分解酵素またはこれを産生する微生物を含有する乳製品を提供することができる。
加えて本発明によれば、これらの製造方法を提供することができる。

（乳糖分解酵素）
本発明の乳糖分解酵素は、下記（１）〜（３）の理化学的性質、
（１）分子量が１３９±１０ｋＤａ、
（２）ｐＨ８．５において、５〜１５℃の範囲で最大活性を示す、
（３）４５℃、１０分間の熱処理で、活性が最大活性の１０％以下に低下する、
を有する乳糖分解酵素である。

本発明の乳糖分解酵素は、分子量が１３９±１０ｋＤａである。分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求められる。
本発明の乳糖分解酵素は、ｐＨ８．５において、５〜１５℃の範囲で最大活性を示す。
本発明において、酵素活性は、次の方法で測定される。酵素の基質濃度が２０ｍＭの緩衝液を調製して反応液とし、酵素反応を行い、酵素反応はYoung Jun Choiらの方法に従い、反応液に酵素液を加えることにより開始し、反応停止後は直ちに氷冷、遮光し、ＡＢＳ_415nmを測定する。空試験は酵素の替わりに蒸留水を用い、対照試験は６０℃、１０分間加熱した酵素を用いる。酵素活性は以下の式（１）から求めた数値を、検量線式（２）に代入し算出する。
測定値＝本試験−対照試験・・・（１）
検量線式：ｙ＝０．００２３ｘ＋０．００１０６・・・（２）
酵素活性の単位（Ｕｎｉｔ）は、１分間あたりに基質を１μｍｏｌ変換する酵素量とした。

また、本発明の乳糖分解酵素は、４５℃、１０分間の熱処理で、活性が最大活性の１０％以下に低下する。また、本発明の乳糖分解酵素は、５０℃で熱処理すると、５分間で、活性が最大活性の１０％以下に低下するという性質も有する。すなわち、本発明の乳糖分解酵素は、低温で高い酵素活性を示し、かつ、短時間の熱処理による失活が可能な酵素である。

本発明の乳糖分解酵素は、１０℃において、乳糖に対するミハエリス定数（Ｋｍ）が５０ｍＭであるものを包含する。ミハエリス定数は、ラインウィーバーバークプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｒｅｒ−Ｂｕｒｋプロット：南江堂発行「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一、山下仁平編集、３８７頁、１９８１年)により算出する。活性は、乳糖の加水分解により遊離するグルコースを定量することにより算出する。

また、本発明の乳糖分解酵素は、１０℃において、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）に対するミハエリス定数が２．８ｍＭであるものを包含する。
好熱性のThermus sp. A4、好熱性のBacillus sp.TA-11等から分離された耐熱性酵素は、７０℃や５５℃といった高温において、ＯＮＰＧに対する親和性が５．９ｍＭ、１３．５ｍＭである。したがって、本発明の乳糖分解酵素は、それらと比較して著しく低い反応温度で同等、またはそれ以上の基質親和性を有し、産業的な有用性がある。

本発明の乳糖分解酵素は、１ｍＭの、Ｎａ⁺、Ｍｇ²⁺、Ｌｉ⁺およびＫ⁺から選ばれる金属イオンの存在下では活性が実質的に低下せず、１ｍＭのＺｎ²⁺の存在下で活性が最大活性の５％以下に低下する。本発明の乳糖分解酵素は、１ｍＭの、Ｃａ²⁺、Ｃｕ²⁺の存在下では５０％程度、Ｍｎ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｏ²⁺の存在下ではそれ以上の阻害が認められる。
酵素の種類により、酵素活性に対する金属イオンの影響は異なる。例えば、A. psychrolactophilus B7株の場合、Ｃａ²⁺の存在によって酵素活性は６１％に低下し、Ｃｕ²⁺の存在によって完全に阻害される。これに対し、好熱性のBacillus sp.TA-11乳糖分解酵素活性はＣａ²⁺の存在による酵素活性の低下はないことが報告されている。また好熱性のThermus sp. A4においてはＣｕ²⁺により活性は６８％に低下するものの、Ｚｎ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺の存在における活性は上昇することが報告されている。
乳中には、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺イオン等が含まれている。本発明の乳糖分解酵素は、１ｍＭ ＣａＣｌ₂の存在により５０％程度の阻害が認められる。しかしながら、Ｎａ⁺、Ｋ⁺による顕著な阻害は無いので、乳中における本酵素の乳糖分解活性は十分に残存するものと考えられる。

本発明の乳糖分解酵素は、１０℃において、ｐＨ７．０〜８．５の範囲で最大活性を示す。牛乳のｐＨは、６．５〜６．８であり、そのｐＨにおいて本発明の乳糖分解酵素は十分活性を示し、長時間の処理においても十分な活性を保持することが可能である。

本発明の乳糖分解酵素は、Ｎ末端のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列で表される２０個のアミノ酸残基からなるものが好ましい。
また、本発明の乳糖分解酵素は、Ｎ末端のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列で表される３３８個のアミノ酸残基からなるものが好ましい。また、配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表されるものが好ましい。該乳糖分解酵素は、上記理化学的性質を有する限り、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加の程度は問わない。乳糖分解酵素は、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらにより好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したタンパク質である。

（微生物）
また本発明は、該乳糖分解酵素を産生する微生物である。微生物は、土壌細菌から低温下での乳糖分解活性を有するものをスクリーニングすることにより得ることができる。微生物は、アルスロバクターサイクロラクトフィラス（Arthrobacter psychrolactophilus）から分離することができる。好ましい微生物は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２９である。

（乳糖分解酵素の製造方法）
また本発明は、該乳糖分解酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該乳糖分解酵素を採取することを特徴とする乳糖分解酵素の製造方法である。
培養法としては一般に酵素の生産に用いられている方法が採用されるが、液体培養法では、特に好気性に保つために深部通気攪拌培養が好ましく、実験室的にはフラスコによる通常の振盪培養が適している。培養温度は５〜１５℃で可能であるが、好ましくは７〜１２℃に保つことが望ましい。培養のｐＨは７〜８．５付近で可能である。培養日数は１〜６日間で可能である。培地としてＹＰＬ培地等を使用することが好ましい。
培養物中に蓄積された本発明の酵素を採取するためには、通常の酵素の分離精製法が利用できる。すなわち、本発明の酵素は培養菌体中に含まれているので、まず培養物を減圧濾過または遠心分離することによって菌体を得る。菌体をリン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し、超音波破砕法やフレンチプレス法で破砕後、遠心分離し上清（細胞抽出液）を採取する。この細胞抽出液中に含まれる本酵素の精製は、通常のタンパク質の精製法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等の方法により行われる。

（乳製品）
さらに本発明は、該乳糖分解酵素またはこれを産生する微生物を含有する乳製品である。すなわち本発明の酵素で酵素処理した乳製品は、本発明の酵素または該酵素を産生する微生物を含有することがある。

（乳製品の製造方法）
さらに本発明は、生乳および／または乳清を、該乳糖分解酵素の存在下、５〜１５℃の温度で酵素処理することからなる乳製品の製造方法を包含する。
上記の酵素処理の後、少なくとも４５℃で１０分間、熱処理することにより、該乳糖分解酵素を失活させることができる。熱処理を長時間行うことは乳製品の品質に悪影響を与えるため好ましくなく、失活のための熱処理は４５℃又はそれより若干高い温度で１０〜１５分間行うことが好ましい。
乳製品として、低乳糖乳、チーズ、乳清、乳糖溶液、乳酒または発酵乳が挙げられる。以下、実施例により本発明を説明する。

（微生物のスクリーニング）
（材料）
5-bromo-4-chloro-indolyl-β−D-galactopyranoside(X-Gal)は、Molecular Probes社製(米国)を使用した。活性測定に使用するo-nitrophenyl-β−D-galactophyranoside （ONPG）は、シグマ社製を使用した。その他の試薬は、特記しない限り和光純薬工業の特級を使用した。

（器具）
分光光度計はベックマン社製「ＤＵ−７０ Spectrophotometer」を使用した。ｐＨメーターは堀場製作所製「カスタニーＡＣＴｐＨメーター」を使用した。遠心式限外濾過膜は日本ミリポア社製「ウルトラフリーＣ３」、電気泳動槽はアトー社製「ＡＥ−６５００」、泳動用電源はアトー社製「ＡＥ−８２５０」を用いた。また、酵素活性測定の恒温槽は旭テクノグラス社製「THERMO REGULATOR CTR1100」を使用し、振盪培養機はタイテック社製ＢＲ−３０００Ｌを使用した。

（方法）
北海道内で採取した土壌を、１％乳糖を含む表１に示す液体基本培地５ｍｌに少量接種し、５℃、１４０ｒｐｍで振盪培養した。微生物の増殖により濁度の上昇が認められたサンプルについて、その培養液一白金耳を新鮮な１％乳糖液体基本培地に植え継いだ。これを５回繰り返した。

次に、４０ｍｌの０．２％Ｘ−Ｇａｌを塗布した基本培地を用い、１．５％寒天平板に画線塗沫し、Ｘ−Ｇａｌを分解して青く発色するコロニーを選抜した。同様の操作を繰り返して純粋分離を行った。
純粋単離した株を、１％乳糖を含む液体基本培地１００ｍｌに植菌して、５℃、１４０ｒｐｍで生育を確認した。
濁度の上昇が認められた５試料は、Ｘ−Ｇａｌを塗布した固体基本培地上で青く発色するコロニーを形成した。またこれらの５試料は、５℃で唯一の炭素源を乳糖として生育した。その結果、低温性乳糖分解酵素を産生する単離株としてＦ１〜Ｆ５株の５株を得た。

（生育温度域の検討）
１％乳糖を含む表１に示す基本液体培地にＦ１〜Ｆ５株の各菌体をＯＤ_660nmが０．１となるよう植菌し、１３５ｒｐｍで０℃、２８℃、２９℃、３０℃で振盪培養を行った。濁度の上昇を指標に、菌体が増殖するか否かを判定した。
いずれの単離株も２０〜２５℃で最も生育が良好であった。Ｆ１〜Ｆ５株のいずれも０℃で生育が認められた。一方、２８〜２９℃でも濁度の上昇が認められたが、３０℃においては５株のいずれにおいても明確な濁度の上昇が認められなかった。このことから、単離株５株は０〜２９℃で増殖することが確認できた。

（酵素の調製）
表１に示す基本液体培地で定常期に達したＦ１〜Ｆ５株の菌体１ｍｌを、ネジ口エッペンチューブを用いて遠心(15,000rpm、10分、4℃)し、集菌した。次にガラスビーズによる破砕(4,600rpm、30秒、氷中2分、7回)を行い、遠心分離(15,000rpm、10分)により得られた上清を酵素液とした。

（酵素活性測定）
基質にはＯＮＰＧを使用し、基質濃度が２０ｍＭとなるように、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）を調製して、遮光、氷冷した。これを反応液とし、酵素反応を行った。
酵素反応はYoung Jun Choiらの方法に従い、５℃、２分間予備加温した後に、反応液７６０μｌに対して４０μｌの酵素液を加えることにより開始した。反応停止には２００μｌの１Ｍ ＮａＣＯ₃を用いた。反応停止後は直ちに氷冷、遮光し、ＡＢＳ_415nmを測定した。
空試験は酵素の替わりに蒸留水を用い、対照試験は６０℃、１０分間加熱した酵素を用いた。
酵素活性は以下の式（１）から求めた数値を、ＯＮＰ検量線式（２）に代入しＯＮＰ濃度を算出した。
測定値＝本試験−対照試験・・・（１）
検量線式：ｙ＝０．００２３ｘ＋０．００１０６・・・（２）
酵素活性の単位（Ｕｎｉｔ）は、１分間あたりに基質を１μｍｏｌ変換する酵素量とした。
Ｆ１〜Ｆ５株の産生する酵素の活性を図１に示す。
Ｆ１〜Ｆ５株のいずれの菌体においても、乳糖分解活性は菌体内に存在していることが認められた。さらに、活性は反応条件５℃において十分検出することが可能であった。

（最適ｐＨの検討）
表２に示すＹＰＬ液体培地を用いて、Ｆ１〜Ｆ５株を５℃、１３５ｒｐｍ、振盪培養条件下で定常期まで培養した。菌体湿重量の５倍の５ｍＭリン酸緩衝液を加えて懸濁し、この懸濁液を出力９、６０％照射で超音波破砕を行った。超音波照射による熱失活を防ぐため、３０秒ごとに５分間の氷冷を行う操作を１０回繰り返した。破砕後、４℃、１２，０００×ｇ、２０分間遠心分離を行い、上澄み液を酵素液とした。

２０ｍＭのＯＮＰＧを含むブリトン＆ロビンソン緩衝液を種々のｐＨ（ｐＨ５〜１０）に調製しこれを反応液とした。前述と同様な方法で、Ｆ１〜Ｆ５株の無細胞抽出液について酵素活性を測定した。反応温度は５℃で実施した。
その結果を図２に示す。Ｆ１〜Ｆ５株由来乳糖分解酵素は、反応液ｐＨが８．０〜８．５で最大活性を示した。またｐＨ７．０付近においても、活性は５０％以上残存していた。

（最適温度の検討）
表１に示す基本液体培地で定常期に達したＦ１〜Ｆ５株の菌体１ｍｌを、ネジ口エッペンチューブを用いて遠心分離(15,000rpm、10分、4℃)し、集菌した。次にガラスビーズによる破砕(4,600rpm、30秒、氷中2分、7回)を行い、遠心分離(15,000rpm、10分)により得られた上清を酵素液とした。
２０ｍＭのＯＮＰＧを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液を調製し反応液とした。
前述の方法で０〜５０℃までの反応液温度で酵素活性を測定した。
その結果を図３に示す。最大活性を示す温度は１０℃であり、比活性はＦ１株、Ｆ２株、Ｆ３株、Ｆ４株、Ｆ５株はそれぞれ０．１９５、０．２２１、０．１８５、０．２０８、０．１６１（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）であった。
また、０〜３０℃においても高い活性を検出することができた為、温度特性が異なる複数の酵素タンパク質による可能性が考えられた。そのため活性染色によるアイソザイムの検出を試みた。

（アイソザイムの検出）
Ｆ１〜Ｆ５株由来の酵素液を１０，０００ｃｕｔ−ｏｆｆの遠心式限外濾過膜を使用して、１０Ｕｎｉｔ／１０μｌに濃縮した。７．５％のポリアクリルアミドゲルを調製し、未変性状態で１０Ｕｎｉｔの酵素量を泳動した後に、２５０μＭのＸ−Ｇａｌを含む５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて、５℃および３０℃で１０時間程度反応させて活性を検出した。
５℃において、Ｆ１〜３株およびＦ５株で、移動度の低い位置に明確な活性を検出することができた。Ｆ４株においては、活性染色による活性バンドの検出はできなかった。
３０℃において、Ｆ１株〜Ｆ３株およびＦ５株で、移動度の低い位置および移動度の高い位置に活性が認められた。Ｆ４株においては、活性染色による活性バンドの検出はできなかった。Ｆ２株は、移動度の低い位置のみに活性が認められた。
単離したＦ１〜５株由来の酵素は、活性染色における泳動パターンが類似しているものの、温度特性には違いが認められ、いずれも低温で高い乳糖分解酵素活性を有する新規な乳糖分解酵素活性であることが明らかになった。
アイソザイムの存在が認められなかったＦ２株を独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２９、平成１５年７月１５日）。

（Ｆ２株由来の乳糖分解酵素の精製）
Ｆ２株由来の酵素の精製を行い、酵素化学的諸性質を検討した。

（実験材料）
精製は、ホワットマン社製「Cellulose DE-52」、東ソー製「TOYOPEARL Butyl- 650S」および同「TOYOPEARL HW-75F」を使用した。その他の試薬は、和光純薬工業の特級を使用した。

（実験器具）
冷却遠心機はトミー精工社製「RX-200」を使用した。超音波破砕機はBranson社製（米国）「Ultrasonics sonifier450」を使用した。精製には、アトー社製「ペリスタポンプ SJ-1211」、カラムは「LonpakKc-811」、フラクションコレクターはアドバンテック社製「SF-2100を」使用した。振盪培養機は、タイテック社製「BR-3000L」を使用した。

（Ｆ２株の大量培養）
Ｆ２株をＹＰＬ培地１００ｍｌを使用し、１３５ｒｐｍ、５℃でＯＤ_660nm２０．０まで培養した前培養液を直接ＹＰＬ１．０Ｌに加え、１２０ｒｐｍ、９６時間培養した。培養液を１２，０００×ｇ、４℃で遠心分離した後、沈澱物を０．９％ＮａＣｌ溶液で懸濁した。これを２回繰り返して菌体を洗浄した後、−２０℃に保存した。
培養９６時間後の、ＯＤ_660nm２８．０の培養液１Ｌから集菌を行い、湿重量約８０ｇの菌体を得ることができた。得られた菌体は−２０℃に保存した。

（菌体破砕）
−２０℃で保存した菌体を穏やかに溶かし、これに菌体湿重量に対し５倍の５ｍＭリン酸緩衝液を加えて懸濁した。この懸濁液を出力９、６０％照射で超音波破砕を行った。超音波照射による熱失活を防ぐため、３０秒ごとに５分間の氷冷を行う操作を１５回繰り返した。破砕後、４℃、１２，０００×ｇ、２０分間遠心分離を行い、上澄み液を酵素液とした。

（硫安沈澱法）
酵素液に、４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、３０分間放置した。その後４℃、１２，０００×ｇ、２０分間遠心分離を行い、得られた沈澱を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で適当量に懸濁した。
湿重量６８．１ｇの菌体から、比活性０．０５１１（Ｕ／ｍｇ）の酵素液３５７．５ｍｌを得ることができた。これを試料として４０％飽和硫安沈澱を行い、得られた沈澱物を５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１５０ｍｌに溶解した。この結果、比活性０．４２７（Ｕ／ｍｇ）の硫安画分１５０ｍｌを得た。

（陰イオン交換クロマトグラフィー）
DEAE Cellulose DE52を用いて、硫安画分の精製を行った。すなわち、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したDEAE Cellulose DE52カラム（２．５×１４ｃｍ、８３ｃｍ³）に硫安画分を添加した。２１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸緩衝液を使用し、カラム体積の２倍量の緩衝液で洗浄した後、２１０ｍＭと３９０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いたリニアグラジエント溶出を行い、流速３ｍｌ／ｍｉｎで５ｍｌずつ分取した。
酵素活性の検出されたフラクションＮｏ．３０からＮｏ．４０を回収し、比活性２．０６（Ｕ／ｍｇ）の酵素液４７．５ｍｌを得た。

（疎水性クロマトグラフィー）
フラクションＮｏ．３０〜Ｎｏ．４０に、１Ｍとなるように硫安を加え、これを試料とした。１Ｍの硫安を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したButyl Toyopearl 650Sに試料を加え、カラム体積の２倍量の緩衝液で担体を洗浄した。４５０ｍＭと３５０ｍＭの硫安を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いたリニアグラジエント溶出を行い、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで５ｍｌずつ分取した。
酵素活性の検出されたフラクションＮｏ．２６〜Ｎｏ．２８を回収し、比活性２１．６Ｕ／ｍｇの酵素液１２．５ｍｌを得た。

（ゲルろ過クロマトグラフィー）
フラクションＮｏ．２６〜Ｎｏ．２８を、１０，０００ｃｕｔ−ｏｆｆの遠心式限外濾過膜で濃縮し、これを試料とした。３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したTOYOPEARL HW-75F（２．５×１１１．０ｃｍ、５４４．６ｃｍ³）に試料を添加し、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで５ｍｌずつ分取した。
酵素活性の検出されたフラクションＮｏ．８７〜Ｎｏ．９０を回収し、比活性３３．３Ｕ／ｍｇの酵素液１９．０ｍｌを得た。

（SDS-PAGEによる酵素の純度検定）
フラクションＮｏ．８７〜Ｎｏ．９０の酵素の純度検定は、SDS-PAGEをレムリの方法に準じて７．５％ゲルを用いて行った。ゲルの染色は0.25%「Coomassie Brilliantblue R250」を用いた。
精製により得られた酵素はSDS-PAGE上で一本のバンドとして現れ、電気泳動的に単一であった。Ｆ２株由来乳糖分解酵素は、精製度６２５倍、５．８０％の回収率で精製することができた。
以上の手順により、フラクションＮｏ．８７〜Ｎｏ．９０を精製Ｆ２株由来乳糖分解酵素（以下Ｆ２酵素という）として得た。

（Ｆ２酵素の諸性質の評価）
（材料）
Ｎ末端アミノ酸配列に用いたＰＶＤＦ膜はアプライドバイオシステムズ社の「Pro Blott」を用いた。分子量推定には、バイオラッドラボラトリーズ社製「ハイレンジマーカー」およびアマシャムファルマシア社製「LMW Gel Filtration Calibration Kit」を使用した。遺伝子のクローニングにはタカラバイオ社製「DNA ligation kit ver.2」を使用した。その他試薬は、特記しない限り和光純薬工業の特級を使用した。

（器具）
Ｎ−末端ブロッティング用泳動槽は、日本エイドー社製のセミドライ型泳動槽を使用した。Ｎ末端アミノ酸配列分析にはアプライドバイオシステムズ社製の「Procisse49X-HTプロテインシーケンサー」を使用した。遺伝子配列の決定には、アマシャムファルマシア社製の「Long-Read Tower DNAシークエンサー」を使用した。

（分子量の測定）
Ｆ２酵素の純度検定は、SDS-PAGEをLaemmliの方法に準じて７．５％ゲルを用いてゲルの染色は0.25% 「Coomassie Brilliantblue R250」を用いた。SDS-PAGEによって算出した乳糖分解酵素のサブユニットの分子量は１３９±１０ｋＤａであった。

（酵素活性に対するｐＨの影響）
１０倍に濃縮したＦ２酵素４μｌを、ｐＨ５〜１０に調製した３６μｌのブリトン＆ロビンソン緩衝液に希釈し、４℃、６時間放置した。その後、残存活性を測定した。その結果を図４に示す。Ｆ２酵素は１０℃において、ｐＨ８．０で最大活性を示した。またｐＨ７．０における残存活性は８０％以上であった。

（酵素のｐＨ安定性）
Ｆ２酵素の安定性について検討した。その結果を図５に示す。Ｆ２酵素は、ｐＨ７．０〜１０．０の広い範囲で安定していることがわかる。

（酵素活性への温度の影響）
Ｆ２酵素を使用し、ホウ酸緩衝液を用いて酵素活性測定を行った。その結果を図６に示す。Ｆ２酵素は、反応温度が１０℃で最大活性を示した。さらに０℃における残存活性は８８％で、十分な活性を保持していた。

（酵素の熱安定性）
Ｆ２酵素を３０〜５０℃で０〜１２０分処理した後、残存活性を測定した。その結果を図７に示す。Ｆ２酵素は、４５℃、１０分で完全に失活することが認められた。また。５０℃においては５分以内の処理で活性の消失が認められた．

（ＯＮＰＧに対する親和性）
１００〜１，０００μＭの間で基質濃度を変えたラインウィーバーバークプロットよりＫｍを算出し、Ｆ２酵素のＯＮＰＧ基質に対する親和性を調べた。その結果を図８に示す。Ｆ２酵素のＯＮＰＧに対する親和性（Ｋｍ）は１０℃において２．８ｍＭであった。

（乳糖に対する親和性）
２５０〜５，０００μＭの間で基質濃度を変えたラインウィーバーバークプロットよりＫｍを算出し、Ｆ２酵素の乳糖に対する親和性を調べた。その結果を図９に示す。活性測定は、乳糖の加水分解により遊離するグルコースを定量することにより算出した。乳糖に対する親和性（Ｋｍ）は５０ｍＭであった。

（金属イオンの影響）
金属イオンをそれぞれ１ｍＭとなるよう反応液を調製し，Ｆ２酵素の活性に対する金属イオンの影響を調べた。
その結果を表３に示す。Ｆ２酵素おいて、Ｎａ⁺、Ｍｇ²⁺、Ｌｉ²⁺、Ｋ⁺による阻害は認められなかった。一方、Ｃａ²⁺、Ｃｕ²⁺では５０％程度、Ｍｎ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｏ²⁺ではそれ以上の阻害が認められた。Ｚｎ²⁺においては、９９％の活性が消失した。

（Ｎ末端アミノ酸配列）
フラクションＮｏ．２６〜２８を試料としてSDS-PAGEを行い、次にセミドライブロッティング泳動槽を用いてPVDF膜へ転写（100V、25mA、3時間）を行った。転写を行ったPVDF膜をCBB染色した後、脱色液に浸し、バンドが確認できる迄脱色した。脱色したPVDF膜を超純水で洗浄し乾燥させた。検出されたバンドをProcisse49X-HTプロテインシーケンサーを用いて分析した。
Ｆ２酵素のＮ末端アミノ酸配列はMTPADVSYITDQGPGSGLRV（配列番号１）であった。

（部分アミノ酸配列）
決定したＮ末端アミノ酸配列およびArthrobacter sp. C2-2およびA. psychrolactophilus B7株と相同性の高いアミノ酸配列からプライマーを作成し、反応条件94℃1min、57℃1min、72℃1min、30サイクルでPCRを行った。ポリエチレングリコール沈澱により増幅断片を精製した後に、「Takara ligation Kit」を使用してEscherichia coliへ形質転換を行った。得られた部分遺伝子を使用し、DNAシークエンサーを用いて塩基配列の決定を行った。
Ｆ２酵素の部分構造遺伝子の塩基配列から３３８アミノ酸残基を決定した（配列番号２）。

（Ｆ２酵素による生乳中の乳糖分解）
（材料）
グルコースの定量には和光純薬工業社製グルコースＢ−テストキットを使用した。薄層クロマトグラフィーにはフナコシ株式会社製「フナセルＳＦ」微結晶セルロース薄層プレートを使用した。その他試薬は、特記しない限り和光純薬工業の特級を使用した。

（器具）
分光光度計はベックマン株式会社製「DU-70 Spectrophotometer」を使用した。ｐＨメーターは堀場製作所製「カスタニー ACTpHメーター」を使用した。酵素活性測定の恒温槽は旭テクノグラス株式会社製「THERMO REGULATOR CTR1100」を使用した。遠心式限外濾過膜は日本ミリポア社製「ウルトラフリーＣ３」を使用した。

（生乳中の乳糖濃度測定）
試料として用いる生乳中の乳糖濃度は、レイン・エイノン法で定量した。すなわち、６．９２％硫酸銅溶液を、力価が１±０．００５となるように調製した後、硫酸銅溶液５ｍｌにアルカリ性酒石酸ナトリウム溶液（３４．６％酒石酸ナトリウム、１０％水酸化ナトリウム）５ｍｌを加え、蒸留水１０ｍｌを加えた。牛乳５ｇを１００ｍｌの蒸留水に希釈し、これを試験溶液として使用した。硫酸銅溶液をフラスコで強く加熱した後、１％メチレンブール溶液数滴を滴下して、試験溶液で滴定を行った。滴定に要した試験溶液の液量から、レイン・エイノン乳糖定量法を使用して乳糖量を算出した。
定量分析の結果、試料として使用する生乳中の乳糖濃度は４．２％の無水乳糖を含有していた。

（精製酵素の調製）
Ｆ２株の無細胞抽出液より、精製度４９１倍、比活性２１．６(Unit/mg)の部分精製酵素液を得た。得られた部分精製酵素液は、遠心式限外濾過膜により３(Unit/ml)まで濃縮し、これを試料に添加する酵素とした。

（生乳の酵素処理）
生乳１ｍｌに対し、１Ｕｎｉｔの部分精製酵素を添加し、十分に混合した。１０℃の低温下で酵素処理を実施し、反応停止は、１０％（ｖ／ｖ）トリクロロ酢酸溶液となるように試料を調製し、５，０００×ｇ、１０分の遠心分離後、上清を回収した。得られた上清を試料として、グルコース濃度、および薄槽クロマトグラフィーにより糖の検出を行った。

（薄層クロマトグラフィーによる還元糖の検出）
２−プロパノール／水（１７：３、ｖ／ｖ）を調製し、これを展開溶媒とした。薄層板に酵素処理を行った生乳試料１．０μｌをスポットし、展開した。展開後、５％飽和硝酸銀溶液を含むアセトン溶液、０．５Ｍ水酸化ナトリウム−エタノール溶液、５％チオ硫酸ナトリウム溶液の順で薄層板に噴霧し、酵素反応により遊離する還元糖を検出した。

（生乳中のグルコース濃度の定量）
酵素反応によって乳糖から遊離するグルコース濃度を、グルコース−Ｂ−テストキットを用いて定量した。
乳糖は、酵素を添加後、２４時間で約８０％が分解された。反応９６時間後、乳中の乳糖濃度は９０％以上が分解され、乳中の乳糖は十分に減少した（図１０）。

本発明の乳糖分解酵素を使用することにより、栄養価、鮮度、食味などの良好な低乳糖牛乳を製造することが可能となり、また、品質の良好なガラクト−スやグルコースを製造することが可能となる。

Ｆ１〜Ｆ５株の産生する乳糖分解酵素の活性を示す図である。 Ｆ１〜Ｆ５株由来の乳糖分解酵素の活性に与えるｐＨの影響を示す図である。 Ｆ１〜Ｆ５株由来の乳糖分解酵素の活性に与える温度の影響を示す図である。 Ｆ２酵素の酵素活性に対するｐＨの影響を示す。 Ｆ２酵素のｐＨ安定性を示す図である。 Ｆ２酵素の活性に与える温度の影響を示す図である。 Ｆ２酵素の熱安定性を示す図である。 Ｆ２酵素のＯＮＰＧに対する親和性を示す図である。 Ｆ２酵素の乳糖に対する親和性を示す図である。 Ｆ２酵素による生乳中の乳糖分解の経時変化を示す図である。

Claims (16)

1. 下記（１）〜（３）の理化学的性質
   （１）分子量が１３９±１０ｋＤａ、
   （２）ｐＨ８．５において、５〜１５℃の範囲で最大活性を示す、
   （３）４５℃、１０分間の熱処理で、活性が最大活性の１０％以下に低下する、
   を有する乳糖分解酵素。
2. １０℃における、乳糖に対するミハエリス定数（Ｋｍ）が５０ｍＭである請求項１に記載の乳糖分解酵素。
3. １ｍＭの、Ｎａ⁺、Ｍｇ²⁺、Ｌｉ⁺およびＫ⁺から選ばれる金属イオンの存在下では活性が実質的に低下せず、１ｍＭのＺｎ²⁺の存在下で、活性が最大活性の５％以下に低下する請求項１に記載の乳糖分解酵素。
4. １０℃において、ｐＨ７．０〜８．５の範囲で最大活性を示す請求項１に記載の乳糖分解酵素。
5. １０℃において、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）に対するミハエリス定数（Ｋｍ）が２．８ｍＭである請求項１に記載の乳糖分解酵素。
6. Ｎ末端のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列で表される請求項１に記載の乳糖分解酵素。
7. Ｎ末端のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表される請求項１に記載の乳糖分解酵素。
8. 請求項１に記載の乳糖分解酵素を産生する微生物。
9. 微生物は、土壌細菌である請求項８に記載の微生物。
10. 微生物は、アルスロバクターサイクロラクトフィラス（Arthrobacter psychrolactophilus）である請求項８に記載の微生物。
11. 微生物は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４２９である請求項８に記載の微生物。
12. 請求項１に記載の乳糖分解酵素またはこれを産生する微生物を含有する乳製品。
13. 請求項１に記載の乳糖分解酵素を産生する微生物を培養し、培養物から採取することを特徴とする乳糖分解酵素の製造方法。
14. 生乳および／または乳清を、請求項１に記載の乳糖分解酵素の存在下、５〜１５℃の温度で酵素処理することからなる乳製品の製造方法。
15. 酵素処理の後、４５℃で、少なくとも１０分間、熱処理することからなる請求項１４に記載の製造方法。
16. 乳製品は、低乳糖乳、チーズ、乳清、乳糖溶液、乳酒または発酵乳である請求項１４に記載の製造方法。

Images