DK143714B - Fremgangsmaade til hydrolyse af lactose under dannelse af glucose og galactose - Google Patents

Description

09) DANMARK (^|)

|p (12) FREMUEGGELSESSKRIFT (ni 143714B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5^51/75 (51) lnt.CI.3 C 12 P 19/14 (22) Indleveringsdag 3· dec. 1975 (24) Løbedag 5· dec. 1975 (41) Aim. tilgængelig 5· jun. 1976 (44) Fremlagt 28. sep. 1981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 4. dec. 1974, 529329, US

(71) Ansøger R. J. REYNOLDS TOBACCO COMPANY, Winston-Salem, US.

(72) Opfinder Margaret E. Long, US: Chin K. Lee, US.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Bout ard.

(54) Fremgangsmåde til hydrolyse af lactose under dannelse af glu»= cose og galactose.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til hydrolyse af lactose under dannelse af glucose og galactose, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man bringer lac-tosen i kontakt med en lactase produceret ved dyrkning, af organismen Bacillus coagulans NRRL B-8100 i et lactoseholdigt næringsmedium.

q Der har i de senere år været betydelig interesse for at ud- j. vikle metoder til reduktion af lactoseindholdet i mælk og “ produkter afledt af mælk. Denne interesse er blevet forøget r) ved nylige påvisninger af, at en stor procentdel af den men- £ neskelige befolkning lider af lactasemangel, hvilket enten er en nedarvet egenskab eller et resultat af "en ældningsproces.

t 2 143714 Sådanne lactasemangler fører til forstyrrelser i tarmkanalen, hvor fødens indhold af lactose er højt. Endvidere har man observeret en lignende lactoseintolerance hos visse husdyr.

Hydrolysen af lactose i mælk og produkter afledt af mælk under dannelse af glucose og galactose er et attraktivt mål, ikke bare fordi det ville løse lactoseintoleranceproblemet, men også fordi det ville forøge sødheden af produkterne og reducere de såkaldte sandagtige texturer i visse mælkeafledte produkter, forårsaget af lactosekrystallisation. Fagfolk har længe erkendt ønskeligheden af at fremkalde denne hydrolyse ved anvendelse af lactase. Til trods for det forhold, at lactase forekommer relativt udbredt i naturen og produceres af mange mikroorganismer, har anvendelsen af lactase ved kommerciel produktion af mælk og produkter afledt af mælk været meget begrænset. En af årsagerne til den begrænsede kommercielle anvendelse af lactase er, at mange af de almindelige lactaser, såsom lactaser afledt af gær, udviser en optimal enzymaktivitet ved temperaturer, der også fører til bakterievækst. Som følge heraf har der været en stigende interesse i at finde lactase med en høj grad af termostabilitet. En sådan termo-stabil lactase ville tillade udførelse af lactosehydrolysen under betingelser, som er ikke-favorable for væksten af visse bakterier, der hyppigt er til stede i mælk eller produkter afledt af mælk. En sådan lactase afledt af Streptomyces coelicolor er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.816.259.

Det er på dette tidspunkt ikke klart, hvorvidt lactase fra S. coelicolor kan anvendes uden risiko, fordi visse medlemmer af denne art har vist sig at producere antibiotika.

Produktionen af lactase af medlemmer af Bacillus-slægten er tidligere beskrevet. Således har P.J. Anema, Biochem. Biophys.

Acta, §2 (3), 495-502 (1964) beskrevet isolation af lactase fra B. subtilis. Lactase fra B. megaterium er beskrevet af S.R. Rohlfing og I.P. Crawford, J. Bacteriology 92 (4), 1258-9 (1966). Ingen af disse organismer kan imidlertid betragtes som varmetolerante, og den dannede lactase må i reglen anvendes ved temperaturer under 50° C for at bevare en nyttig 3 143714 enzymaktivitet i længere tid.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at angive en fremgangsmåde til hydrolyse af lactose under dannelse af glucose og galactose ved relativt høje temperaturer på op til 70^0, især mellem 45 og 65°C, og dette opnås ved, at man bringer lac-tosen i kontakt med en lactase, der er produceret ved dyrkning af en hidtil ukendt organisme af slægten Bacillus med særligt fordelagtige egenskaber. Således udviser den en optimal vækst ved en temperatur på mindst ca. 45^0. Organismen, der betegnes Bacillus coagulans NRRL B-8100 dyrkes i et næringsmedium indeholdende lactose, hvorefter den dannede lactase isoleres.

Den anvendte organisme til dette formål er isoleret fra en jordprøve. Dyrkning af organismen i et passende næringsmedium indeholdende lactose fører til dannelsen af den ønskede lactase intracellulært. Der er foretaget en karakteristik af kulturen, og den er identificeret som faldende inden for arten Bacillus coagulans i overensstemmelse med klassifikationen efter Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Edition. Denne organisme er deponeret i kultursamlingen i U.S.D.A. Northern Regional Research Laboratory under betegnelsen NRRL B-8100. De taxonomiske egenskaber af denne stamme er beskrevet i nedenstående tabel 1.

TABEL 1 A. Morphologiske karakteristika: 1. Vegetative stave: Mindre end 0,9 um i diameter, læng den varierende i reglen op til 5,0 - 6,0 μιη. Enkelte filamenter. Ingen kæder. Gram positiv, ensartet farvning. Bevægelig.

2. Sporangier: I reglen ikke opsvulmede, men enkelte opsvulmede bronchier kan findes.

3. Sporer: 0,9 x 1,2 - 1,5 pm, ellipsoidiske, subterminale Indtil terminale.

4 U37U

B. Dyrkningsmæssige karakteristika: 1. Gelatine-agar Ingen hydrolyse, stregkultur: 2. Agarkolonier: Uigennemsigtige, små, runde.

Ikke skelnelige.

3. Agarskråkulturer: Spredt til moderat vækst. Flad, glat, gennemsigtig.

4. Glucose-agar Væksten kraftigere end på nærings- skråkultur: agar. Glat, hvid.

5. Glucose-asparagin Ingen vækst i 24 timer, agarskråkultur: Moderat vækst efter 48 timer.

6. Sure proteose- God vækst, bedre end på nærings- pepton-agarskrå- agar.

kulturer: 7. Sojabønneagar- Moderat vækst, lidt stærkere end skråkulturer: på næringsagar.

8. Skråkultur på Spredt vækst efter 24 timer, agar til opbe- lige så god som næringsagar ved varing: 48 timer.

9. Kødsuppe: Ringe vækst efter 24 timer.

10. Natriumchlorid- Ingen vækst i 7 % natriumchlorid. kødsuppe: 11. Mælkeagar streg- Ingen hydrolyse, kultur: 12. Kartoffel: Spredt, tør, rynket.

C. Fysiologiske karakteristika: 1. Under anvendelse af pepton som nitrogehkilde producerede organismen syre, men ingen gasser ud fra glucose, lactose, arabinose, xylose, mannitol og maltose.

Neutral reaktion på saccharose og glycerol.

2. pH i glucosenæringsvæske er 5,0 eller mindre på 7 dage.

3. Ingen citratudnyttelse.

4. Tomatgærmælk løb sammen efter 24 timer ved 45° C, 5. Ingen produktion af nitriter fra nitrater.

6. Negativ Voges-Proskauer-test. pH i Voges-Proskauer-væsken var 4,2.

7· Positiv stivelseshydrolyse.

5 143714 8, Positiv katalasereaktion.

9. Ingen vaskst på nitratholdigt medium under anaerobe betingelser. Vækst på glucosenæringsvæske under anaerobe betingelser fører til pH under 5,2 i løbet af 7 dage.

10. Aerob, fakultativt anaerobt, 11. Minimumstemperatur for væksten er 25° C, Maksimumstemperaturen for vækst er 60° G. Optimalvækst ved 45 - 50° C.

Som angivet under de fysiologiske karakteristika i tabel 1 udviser den beskrevne Baeillus-organisme optimal vækst ved temperaturer på cirka 45 - 50° C og kan derfor opfattes som en varmetolerant organisme i sammenligning med andre Bacillus*· o arter, der udviser optimal vækst ved cirka 37 C. En varmetolerant Baeillus-organisme defineres her som en organisme, der udviser optimal vækst ved temperaturer på cirka 45° C og derover.

Opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående eksempel.

EKSEMPEL

pH-optimum for den af organismen producerede lactase bestemtes ved at analysere hele celler i nærvær af o-nitrophenyl-β-galactosid (ONPG) som substrat. Man gik frem i det væsentlige som beskrevet af J. Lederberg, J. Bacteriology 60, 381 (1950). Cellerne blev først behandlet med toluen, der anvendtes en phosphatpuffer, og analysetemperaturen var 37° C, Lactaseaktiviteten observeredes i intervallet pH cirka 4,5 - 8,0, med optimal aktivitet ved cirka pH 6,0.

Stabiliteten af lactasen produceret af B, coagulans vurderedes ved at anvende ONPG som substrat i en modificeret Leder-berg-fremgangsmåde. Til denne undersøgelse suspenderedes udvaskede celler i 0,05 M phospha tpuf fer ved pH 7,0 i nærvær 6 143714 af ONPG-substratet. Suspensionen holdtes ved 60° C i fire dage, idet prøver periodisk udtoges til bestemmelse af den tilbageværende lactaseaktivitet. Temperaturen ved denne stabilitetsprøve valgtes som tilnærmelsesvis de anvendte temperaturniveauer ved lavtemperatur-pasteurisering. Resultaterne af prøverne er vist i tabel 2.

TABEL 2

Tid (timer) Lactaseaktivitet som pot.

af oprindelig aktivitet 0 100 21 92 45 51 71 36 99 20

Lactasen produceret af Bacillus coagulans udviser nyttig enzymaktivitet op til 70° C. Optimal aktivitet synes at forekomme ved temperaturer på 60 - 65° C. Den specielle temperatur, der vælges til gennemførelse af lactosehydrolyse ved anvendelse af dette enzym, vil afhænge noget af det anvendte substratmedium. Generelt foretrækkes imidlertid temperaturer på 45 - 65° C.

Et typisk medium til dyrkning af Bacillus coagulans under produktion af lactase har følgende sammensætning:

Proteose-pepton.......................... 1,0 % Gærekstrakt................i............. 1,0 %

Kaliumdihydrogenphosphat ................. 0,8 %

Lactose (steriliseret separat) ........... 2,0 % pH....................................... 6,0

Kulturer inkuberes på en roterende ryster i 48 timer ved 45° C. Efter afslutning af inkubationsperioden tilsættes toluen

7 14371A

til væsken (0,5 % på volumeribasis), og blandingen omrøres i 30 minutter. Cellerne udvindes derpå ved flokkulering, som beskrevet i USA-patentskrift nr. 3*821.086, og det opnåede flokkulerede celleaggregat tørres ved 55° C. Lactase-aktiviteten af de tørrede aggregerede partikler er 38,5 enheder pr. gram, hvor en enhed defineres som den mængde enzym, der er nødvendig til dannelse af et mikromol dextrose pr. minut under prøvebetingelserne. Den anvendte prøvemetode er beskrevet af Weetall et al., Biotechnology and Bioengineering 16, 295 (1974).

Effektiviteten af den af Bacillus coagulans producerede lactase demonstreredes ved hydrolyse af lactose i en sød lagret valle. Organismen dyrkedes, og cellerne udvandtes som beskrevet ovenfor. De tørrede aggregerede partikler frasigtedes, og 5 g af 16-20 mesh portionen (0,017-0,024/um) hydratiseredes i en 50% lactoseopløsning pufret til pH 7,0 med en 0,05 phosphatpuf-fer. De hydratiserede partikler anbragtes derpå i en lille glaskolonne, der holdtes ved en temperatur på 60° C. Gennem denne pakkede kolonne ledtes kontinuerligt en vandig opløsning indeholdende 70 gram af et kommercielt tørret sødt vallepulver pr. liter, idet opløsningen pufredes med 0,05 M phosphat til pH 7,0. Opløsningen indeholdt cirka 5 vægtprocent lactose, beregnet på lactoseindholdet i den søde valle, og der tilsattes 100 mg/liter methyl-p-hydroxybenzoat som konserveringsmiddel. Strømningshastigheden gennem kolonnen holdtes på 375 ml/dag, og graden af lactosehydrolyse bestemtes dagligt ved rutineanalyse. Begyndelsesgraden for lactosehydrolysen viste sig at være 90 pct. Efter 3 ugers kontinuert drift var hydrolysegraden faldet til 80 pct.

Det er klart, at den fremstillede lactase kan anvendes enten til batchvis eller kontinuert behandling ved lactoseholdige substrater. Endvidere kan lactasen anvendes ved direkte anvendelse af cellerne, eller den kan anvendes i form af det cellefri enzym ved i sig selv kendte metoder.