SU764617A3 - Способ получени глюкозоизомеразы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

1

Изобретение относитс  к способам микробиологического получени  ферментов изомеризации глюкозы и может быть использовано в пищевой промышленности дл  конверсии глюкозы в фруктозу, в частности при производстве фруктозных сиропов из кукурузного крахмала.

Изомеразу глюкозы, примен емую дл  такой конверсии, получают из микроорганизмов , относ щихс  к различным родам, включа  Arthrobacter; Streptomyces, Bacillus и Actinophanes .

Наиболее близким к изобретению по технической сущности  вл етс  способ l, согласно которому в качестве продуцентов глюкозоизомеразы используют микpoopгaниз 1ы вида FTarobacterium devorans.

Недостатком известного способа  вл етс  невысокий уровень активности штаммов , продуцирующих фермент.

Целью изобретени   вл етс  повышение ферментативной активности.

Поставленна  цель достигаетс  . тем, что в качестве пpoдsщeнтa глюкозоизомеразы используют штамли F1avobacteгiurn аrborescens АТСС 4358

или Flayobactertun arborescens NRRL В-11622, илигТауоЬасТегГит aгbo: rescens NRRL В-11023.

Указанные культуры хран тс  в 5 Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 4356 и в Коллекции культур ARS Северной региональной исследовательской лаборатории Министерства земледели  ОНА в Паории, 10 штат Иллинойс, под NRRL В-11022 и NRRL В-11023.

Все три штамма продуцентов характеризуютс  сходными морфологическими/ культуральными и физиологичес15 ними -признаками.

Палочки размером 0,5x2,5 мкм, одиночные и в цепочках, неподвижные, грамположительные, на стандартных питательных средах образуют длинные, 20 волйистые нити.

На желатиновой среде колонии сначала нитевидные и ветвистые, затем центр становитс  желтоватым, а край - полупрозрачным и древовидным. 25 Желатиновый столбик разжижаетс ,

плавитс  с образованием желтого осадка.

На жидком бульоне рост бактерий в виде суспензии с желтым осадком, 30 без тонкой пленки. Молоко коагулирут без подкислени . На картофеле ост интенсивный в виде оранжевой лёнки. Нитраты не усваивают, нитриы не образуют. Аэробы или факульативные анаэробы.

Оптимальна  температура . В дополнение к указанному выше F. arbbrescens АТСС 4358 хар ктаризуетс  способностью к интенсивному синтезу фермента при культ ви ВваНИИ на питательной среде, содержащей ксилозу в качестве единственного углевода , на глюкозе или лактозе активность фермента низка . Штамм F, arborescens NRRL В-11022 про вл ет значительную изомеризующую активность при культивировании на питательной среде с лактозой и малую активность на среде с глюкозой, йтамм F. arborescens NRRL 6-11023 характеризуетс  высокой изомерйзующей активностью при культивировании на питательной среде, содержащей глюкозу или лактозу.

Описанные микроорганизмы можно выращивдть в различных средах, содержащих источники углерода/ азота и неорганические соли. Типична  среда состоит из гидролизованного животного протеина, кукурузного сока, экстракта пивных дрожжей, дигидрофосфата кали  и соответствующего углевода (ксилоза, глюкоза, мальтоза , сахароза и лактоза, гидролизаты ксилана, крахмала и целлюлозы). Начальный рН питательной среды должен равн тьс  приблизительно 7, ферментацию следует проводить в аэробных услови х при температуре приблизительно в подход щем ферментере ищ качалочной колбе. Максимальна  : активйость изомёразы достигаетс  через 48-72 ч.

АКТИВНОСТЬ глюкозоизомеразы определ ют путём инкубации при в течение 30 мин смеси, состо щей;из О,5 мл содержащего ферМёнт препарата и 1,5 мл раствора, содержащего декстрозу (1,0 М), трициновый буферный раствор (рН 8,01 М) и хлорид магйй  (0,03 м). По истечении инкубационного периода реакцию изомеризации Прекращают путем добавлени  0,5 мл 1,0 н.раствора сол ной кислоты. После центрифугировани  всплывающую прозрачную фракцию разбавл ют и определ ют продуцированную фруктозу. Активнрсть глюкозоизомеразы выражают 4 микроедйницах, одна микроединица ак1 ивности соответствует количеству фермента, необходимого дл  образовани  1 мкг фруктозы в 1 мин при приведенных выше услови х опыта.

Найдено,.что количество изомёразы/ продуцированное предложенными штаммамй при благдп рй тных у(гл6ви х культивировани , довольно значительно и гораздо больше, чем колйчество, образуемое другими известными ранее

пpoдs eнтaми изомёразы. Особенно интересным и неожиданным  вл етс  тот фakт, что максимальное продуцирование изомёразы штаммом NRRL В-11022 достигаетс  в тех случа х, когда в составе питательной среды примен ют лактозу. Например, в среде, содержащей 2% лактозы, ферментатийна  активность соЬтавила 2892 микроединиц из(1еразы на 1 мл (мкед/мл) ферментационного бульона. Следовательно, штаммы согласно изобретению характеризуютс  и отличаютс  от известных ранее микроорганизмов тем, что могут продуцировать значительные количества (500 мкед/мл бульона или более) активной глюкозоизомеразы при культивировании в питательной среде, содержащей лактозу в качестве единственного источника углеводов. Довольно значительное продуцирование фермента происходит при полном отсутствии углеводов в питательной среде. Это иллюстрируетс  данными, приведенными в табл. 1, полученными при культивировании при 3. штаммов F. arborescens в питательной среде, содержащей (%) 1 гидролизованного животного протеина, 1 кукурузного сока, 1 экстракта пивных дрожжей, 1 моногидрофосфата кали , 0,5 дигидрофосфата кали  и 2 углевода.

Глюкозризомераза, продуцированна  F. arborescens, про вл ет высокую активность в интервале рН 6-10 и в температурном интервале 45-90С. В табл. 2 показано вли ние рН, в табл. 3 - температуры на активность изомёразы, ассоциированной с цельными клетками, полученными путем кульТИвйррвани  NRRL В-11022 в содержаще лактозу Питательной среде при в течение 72 ч. Затем собранные Клетки были промыты один раз и повторно суспендированы в воде до первоначальной концентрации клеток в фер;мент ационном бульоне. Дл  определени  а.ктивности изомёразы примен лась рписаннг1  выше стандартна  мётбдйка определени  за тем исключением , что при исследовании вли нч  рН измен ли буферный раствор, а при исследовании вли ни  температуры измен ли температуру. Стабильност изомёразы оценивали путем выдерживани  промытых клеток в 0,05 М трициновом буфере, ), содержащем хлорид магни  (0,004 М) при разных температурах с последующим периодическим отбором проб дл  определени  активности фермента, результаты приведены в табл. 4. .

Из данных табл. 4 видно, что фермеНт cyщecтвej нp cтjaбилeн в течение по меньшей мере 2б6 Ч при рН 8 и температуре , как установлено путем исследовани  промытых клеток, содержащи: фермент. Препарат фермента из промытых, клеток характеризуетт с , кроме того, тем, что, сохран ет по меньшей мере 85% активности при нагревании в течение 20 ч до температуры при рН 8. Изомераза, продуцируема  F.. агЬо rescens, очень эффективна дл  конвер сии глюкозы в фруктозу, и дл  такой конверсии могут быть применены различные способы, уже описанные ранее Пример 1. В колбу Эрлеимейе ра емкостью 500 мл поместили 100 мл питательной среды следукндего состава , %; Гидролизованный животный протеин Кукурузный сок Дрожжевой экстракт К2НР04 КН2Р04 Лактоза Указанную среду инокулируют свеже приготовленным посевным материалом бактерий F. arborescens NRRL В-11022 и инкубируют на качалке при 30°С. По истечении 72 ч клетки собирают и промывают. Активность изсмеразы составила 2892 мкед/мл исходного бульона .

Продуцирование глюкрзоизомеразы микроорганизмами

Примечание. Врем  продуцировани  72 ч. F. arborescens Пример 2, Повтор ют опыт, описанный в примере 1, за тем исключением , что в питательной среде лактозу замен ют ксилозой и посевной маTeji Han гсггов т из F, arborescens АТСС 4358. Через 72 ч клетки собирают и промывают. Активность изомеразы составила 546 микроединиц на 1 мл бульона. Пример 3. Повтор ют опыт, описанный в примере 1, за тем исключением , что в питательной среде лактозу замен ют глюкозой и посевный материал получают из Г. arborescens NRRL В-11023. По,истечении 64 ч активность изомераэы составл ла 580 микроединиц на 1 Мл бульона. Пример 4V Культивируют F. arborescens NRRL В-11022 при в течение 70 ч в ферментере new Bruuswick емкортью 10 л с применением питательно среды, описанной в примере 1. Клетки собирают и иммобилизуют методом флрккул ции, описанным в патенте ( №3821086. Получают агрегат высушенных 5 локкулированных клетйк с активностью йэомеразы 75 микроёданиц; на 1 грамм. . 1р .. Т а б л и ц а 1

на активность изомераэы, F. arborescens NRRL

Активность глюкозоизорн меразы, мкед/мл

- PIPIS 598

1204

1782

2202

- трицин , 2624 3016

3456

3408

р I Р - натриева  соль 1, 4-пиперазиндиэтансульфоната .

Трицин - N- 2-окси-1,1-бис-(оксиметил )-этил -глицин.

Вли ние температуры на активность изомеразы,продуцируемой F. arborescens NRRL В-11022, при рН 8,0

Активность глюкоизо775

1717

. 2776

3500

4400

5104

5960

6592

7088

764617{

Таблица2 В-11022

Таблица 3 меразы, мкед/мл

Стабильность 1ло юразы, продудируемой F. arborescens NRRL В-11022|

Claims (1)

1. Патент США 3956066, кл. 195/31 F, опублик. 1976.