Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania enzymu izomerazy glikozowej, stosowanego w pro¬ cesie izomeryzacji glikozy do fruktozy.W'latach ubieglych sposób enzymatycznego prze¬ ksztalcania gUkozy do fruktozy cieszyl sie duzym zainteresowaniem w zwiazku z otrzymywaniem z maki kukurydzianej syropów, zawierajacych fruk¬ toze. Stosowana w tym procesie izomeraze gliko- zowa otrzymuje sie z drobnoustrojów, nalezacych do róznych rodzajów, takich jak Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus i Actinoplanes. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 956 066 podano, ze innym zródlem izomerazy gli¬ kozowej sa drobnoustroje gatunku Flavobacterium devorans.Sposobem wedlug wynalazku izomeraze glikozo- wa wytwarza sie w duzych ilosciach, stosujac szczep Flavobacterium arborescens ATCC 4358 oraz jego dwa mutanty, oznaczone jako NRRLtB-11022 i NRRL-B-11023. Enzym ten znajduje zastosowanie w procesie izomeryzacji glikozy.Chociaz drobnoustroje te- zostaly- zidentyfikowa¬ ne jako nalezace do gatunku Flavobacterium arbo- resces, to jednak nalezy zaznaczyc, ze do chwili obecnej istnieja pewne konrowersje we wlasciwym zakwalifikowaniu tych drobnoustrojów. Wedlug Bergey'a, 8 Wydanie Manual Determinative Bacte- riology, strony 362—363, gatunek Flayobacterium arborescens, zostal nieprawidlowo zakwalifikowany do rodzaju Flavobacterium. Nowa klasyfikacja. i zmiana nazewnictwa dla tych drobnoustrojów dotychczas nie zostaly ustalone. Dlatego, w wyna¬ lazku stosuje sie istniejace nazewnictwo; zdajac sobie sprawe z faktu, ze ewentualnie inna. nazwa i rodzajowa bedzie wprowadzana dla Flayobacterium arborescens. Nalezy nadmienic, ze Flavobacterium deyorans wedlug, opisu, patentowego Stanów Zjedr noczonyeh Ameryki nr 3,956 006 nie podlega zmia^ nie klasyfikacji i dlatego nalezy uznac za przed¬ lo stawioiela innego rodzaju* W sposobie wedlug wynalazku jako drobnoustroje stosuje sie Flayobacterium arborescens ATCC 4358 oraz dwa mutanty szczepów, wyizolowanych z niego. Drobnoustrój ATCC 4358 mozna otrzymac u z American Type Cultura Colleelion w Rockville, Meryland. Szczepy Flayobacterium- arborescens zdolne do wytwarzania, znacznych ilosci izomerazy/ glikozowej. zostaly zdeponowane w Kolekcji Szcze* pów. ARS USDA. Northern Regional Research La* 20 boratory in Peoria, Illinois i sa dostepne pod nu* merami hodowli NRRL.BKL 1022: oraz NRRLB-11028.Sposobem wedlug; wynalazku; drobnoustroje te hodujel sie na róznych podlozach, zawierajacych zródlo wegla, azotu i sole mineralne, Topowe. podv M loze zawiera hydrolizat. bialka zwierzecego, wyciag namokowy kukurydzy, ekstrakt z drozdzy browar¬ nianych, fosforan potasu, dwuzasadowy, fosforan potasu jednozasadowy i odpowiedni weglowodan.Sposród weglowodanów stosuje sie ksyloze/ glikoze, M maltoze, sacharoze i laktoze, jak równiez hydroli- 110 770 4110 770 3 zaty ksylenu, skrobi i celulozy; Podloze hodowlane na poczatku wykazuje pH o wartosci okolo 7, a fermentacje prowadzi sie w warunkach napo¬ wietrzania w odpowiednim fermentorze lub w kol¬ bie na wytrzasarce, w temperaturze okolo 30°C.Najwyzsza aktywnosc izomerazy uzyskuje sie okolo 48 do 72 godzin.Aktywnosc izomerazy, wytworzonej przez drob¬ noustroje, oznacza sie poddajac inkubacji w tempe¬ raturze 60°C, w ciagu 30 minut mieszanine, zawie¬ rajaca 0,5 mililitra preparatu enzymatycznego w objetosci mieszaniny 1,5 mililitra, zawierajacej dekstroze, bufor Tricine (pH=8) i chlorek magnezu w stezeniach koncowych, odpowiednio wynoszacych 1,0 M, 0,1 M, 0,03 M. Po zakonczonej inkubacji reakcje izomeryzacji przerywa sie przez dodanie 0,5 mililitra 1,0 M kwasu chlorowodorowego. Po odwirowaniu, klarowny roztwór rozciencza sie od¬ powiednio, a nastepnie oznacza zawartosc fruktozy wedlug metody, opisanej przez L. Messineo i E. Musarra, Int. J. Biochem., 3(18), 691—699 (1972).Aktywnosc izomerazy wyraza sie w mikrojednost¬ kach, przy czym jedna jednostke stanowi ta ilosc enzymu, która katalizuje utworzenie jednego mi- krograma fruktozy w ciagu minuty, w warunkach oznaczania podanych powyzej.Ilosc izomerazy, wytwarzanej przez szczepy spo¬ sobem wedlug wynalazku w odpowiednio dobra¬ nych warunkach, jest znacznie wieksza w porów¬ naniu z izomeraza, otrzymywana z drobnoustrojów wczesniej opisanych. Ilosc wytwarzanej izomerazy przez wybrane szczepy zalezy w znacznym stopniu od warunków hodowli. Znamienne i zaskakujace jest, ze najwyzsze stezenie izomerazy uzyskuje sie, gdy do podloza hodowlanego dodaje sie laktoze.Prowadzac na przyklad hodowle szczepu NRRL B-11022 na podlozu, zawierajacym 2Vo laktozy, uzy¬ skuje sie 2892 mikrojednostki izomerazy w mili- litrze plynu fermentacyjnego. Z tego wzgledu, dalsza charakterystyke szczepów wybranych i od¬ róznienie ich od szczepów, stosowanych we wczes¬ niej opisanych wynalazkach i zdolnych do wytwa¬ rzania widocznych ilosci izomerazy (np. 500 mikro- jetfndstek (mililitr brzeczki lub wiecej), przepro¬ wadza sie przez prowadzenie hodowli na podlozu, zawierajacym laktoze jako jedyne zródlo weglowo¬ danów. Ha podlozu, nie zawierajacym weglowoda¬ nów^ równiez wytwarzane sa znaczne ilosci enzy¬ mu. Obserwacje te przedstawione sa w tabeli 1, w oparciu o hodowle szczepu Flavobacterium arbo- rescens, prowadzona w temperaturze 30°C, na pod¬ lozu, zawierajacym l*k hydrolizatu bialka zwierze¬ cego (Bacto-Tryptone, otrzymany z firmy Difco, Detroit, Michigan), lf/o wyciagu namokowego ku¬ kurydzy, l*/i fosforanu potasowego dwuzasadowego, 0,5*/§ fosforanu potasowego jednozasadowego i 2*/o weglowodanów.Tabela 1 Wytwarzanie izomerazy przez Flavobacterium arborescens 1 Weglowo- 1 dan w podlozu | 1 Go¬ dzi¬ ny 2 Aktywnosc izomerazy w mikrojednostkach/ml ATCC 4358 3 NRRL B-11023 4 NRRL. 1 B-11023 5 j 10 15 20 25 45 55 1 l bez cukru Ksyloza Glikoza Laktoza Maltoza | Sacharoza 2 72 72 72 72 72 72 3 0 546 0 0 — — | 4 1042 892 89 2892 1314 1190 | 1 5 1480 ' 755 1123 1679 — — Izomeraza, wytwarzana przez Flavobacterium ar¬ borescens wykazuje aktywnosc w zakresie pH =6—10 w temperaturze okolo 45° do 90°C. Wyniki przed¬ stawione w tabeli 2, ilustruja wplyw pH i w ta¬ beli 3 wplyw temperatury na aktywnosc izomerazy, zawartej w nienaruszonych komórkach szczepu NRRL B-11022, otrzymanych w hodowli na pod¬ lozu, zawierajacym laktoze, w temperaturze 30°C w ciagu 72 godzin. Stabilnosc enzymu ilustruja wy¬ niki, przedstawione w tablicy 4. Wyniki, przedsta¬ wione w tabeli 2 i 3, odnosza sie do komórek od¬ dzielonych i jednokrotnie przemytych woda, które nastepnie zawieszono w wodzie w takiej objetosci, aby stezenie komórek bylo identyczne jak w plynie hodowlanym. Do oznaczen aktywnosci izomerazy stosowano procedure standardowa, opisana powy¬ zej, z wyjatkiem badan wplyw pH, gdzie stosowano rózne bufory i badan wplywu temperatury, gdzie zmieniano zakres temperatury. Badania stabilnosci, przedstawione w tablicy 4, prowadzono z uzyciem przemytych komórek w 0,05 M buforze Tricine (pH=8), zawierajacym chlorek magnezu (0,004 M), prowadzac inkubacje komórek w okreslonych prze¬ dzialach czasu w warunkach standardowych.Tabela 2 Wplyw pH na aktywnosc izomerazy z NRRL B-11022 Bufor PIPES* PIPES* PIPES* PIPES1 Tricine" Tricine* Tricine2 Tricine pH 6,0 6,5 7,0 7,5 7,5 8,0 8,5 , 9,0 Aktywnosc izome¬ razy w mikrojed¬ nostkach/ml 598 1204 1782 2202 2624 3016 3456 3408 *) PIPES jest sola jedno sodowa kwasu 1,4-pipe- razynodwuetanosulfonowego *) Tricine jest N-[2-hydroksy-l,l-bis(hydroksy- metylo)-etylo]glicyna Tabela 3 Wplyw temperatury na aktywnosc izomerazy z NRRL B-11022 przy wartosci pH=8,0 % Temperatura w °C . 1 45 50 55 60 65 | 70 Aktywnosc izomerazy w mi¬ krojednostkach/ml 2 755 1717 2776 3500 4400 5104 J110 770 c. d. tablicy 3 1 1 75 80 85 2 I Iii Tabela 4 Calkowity czas inku¬ bacji w go¬ dzinach 24 96 168 240 Aktywnosc izomerazy w mi- krojednostkach/ml Inkubacja w 60°C 2212 2276 2276 2262 Inkubacja | w 70°C j 2340 2244 2036 2092 Wyniki, przedstawione w tabeli 4, wykazaly, ze enzym jest trwaly w ciagu przynajmniej 200 go¬ dzin, w pH = 8 i temperaturze 60°C, przy oznacze¬ niu wykonanym z uzyciem komórek przemytych.Preparat enzymatyczny z przemytych komórek charakteryzuje sie ponadto tym, ze zachowuje przynajmniej 85% aktywnosci podczas ogrzewania w ciagu 200 godzin, w temperaturze 70°C przy wartosci pH=8,0.Sposób wedlug wynalazku ilustruja nastepujace przyklady.Przyklad I. 100 ml podloza hodowlanego umieszcza sie w kolbie Erlenmayera o pojemnosci 500 ml: Hydrolizat bialka zwierzecego Procenty Wyciag namokowy kukurydzy 1,0 Ekstrakt drozdzowy 1,0 K2HP04 1,0 KH2PO4 0,5 Laktoza 2,0 Powyzsze podloze szczepi sie swiezo przygoto¬ wanym inoculum Flavobacterium arborescens NRRL B-11022 i nastepnie wytrzasa sie w temperaturze 30°C na trzesawce obrotowej. Po uplywie 72 godzin komórki zbiera sie i przemywa. Uzyskuje sie ak¬ tywnosc izomerazy równa 2892 mikrojednostek w mililitrze brzeczki.Przyklad II. Stosujac metode, opisana w przykladzie I z wyjatkiem, ze do podloza hodowla- 10 11 35 nego dodaje sie zamiast ksylozy laktoze i przygo¬ towuje sie inocelum z hodowli Flavobacterium arborescens ATCC 4358. Po uplywie 72 godzin ko¬ mórki zbiera sie: zawartosc izomerazy po ozna¬ czeniu aktywnosci wynosi 546 mikorojednostek w mililitrze brzeczki.Przyklad III. Postepujac w sposób, opisany w przykladzie I, lecz uzywajac glikoze w podlozu hodowlanym zamiast laktozy, hodowle szczepi sie inoculum, otrzymanym z Flavobacterium arbo¬ rescens NRRL B-11023. Po uplywie 64 godzin ko¬ mórki zbiera sie i oznacza aktywnosc izomerazy, która wynosi 580 mikrojednostek w mililitrze brzeczki.Przyklad IV. Stosujac podloze hodowlane, opisane w przykladzie I, hodowle Flavobacterium arborescens NRRL B-11022 prowadzi sie w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 70 godzin w fermentatorze New Brunswick o pojemnosci 10 1. Komórki zbiera sie i poddaje immobilizacji przez flokulacje, który to sposób jest opisany w opisie patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki nr 3 821 086. Uzyskuje sie suche, klaczkowate agregaty komórek wykazu¬ jacych aktywnosc izomerazy 75 mikrojednostek na gram.Zastrzezenia patentowe Sposób wytwarzania enzymu izomerazy glikozo- wej, znamienny tym, ze hodowle drobnoustroju, nalezacego do gatunku Flavobacterium arborescens ATCC 4358, prowadzi sie na podlozu hodowlanym w warunkach, umozliwiajacych wytwarzanie tego enzymu przez dobnoustrój. 2. Sposób wytwarzania enzymu izomerazy gliko- zowej, znamienny tym, ze hodowle drobnoustroju, nalezacego do gatunku Flavobacterium arborescens NRRL B-11022, prowadzi sie na podlozu hodowla¬ nym w warunkach, umozliwiajacych wytwarzanie tego enzymu przez drobnoustrój. 3. Sposób wytwarzania enzymu izomerazy gliko- zowej, znamienny tym, ze hodowle drobnoustroju, nalezacego do gatunku Flavobacterium arborescens NRRL B-11023, prowadzi sie na podlozu hodowla¬ nym w warunkach, umozliwiajacych wytwarzanie tego enzymu przez drobnoustrój. PL PL PL PL PL PL PL PL