CH630116A5

CH630116A5 - Procede de preparation d'un enzyme d'isomerisation du glucose.

Info

Publication number: CH630116A5
Application number: CH1274177A
Authority: CH
Inventors: Chin Kee Lee
Original assignee: Reynolds Tobacco Co R
Priority date: 1976-10-20
Filing date: 1977-10-19
Publication date: 1982-05-28
Also published as: FI58939B; LU78355A1; BG33589A3; DK143947C; AR218040A1; ZA775921B; US4061539A; IL53095A; CH635128A5; GR70082B; GB1551897A; FR2368538B1; BE859830A; JPS5352684A; DE2746939A1; SU764617A3; TR19534A; FR2368538A1; RO73285A; PL110770B1

Description

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un enzyme que l'on peut utiliser dans l'isomérisation du glucose en fructose, ainsi que l'utilisation dudit enzyme pour ladite isomérisa-tion.

Au cours des dernières années, s'est développé un intérêt considérable pour la transformation enzymatique du glucose en fructose, en particulier en ce qui concerne la production de sirops contenant du fructose à partir d'amidon de maïs. La glucose-isomérase que l'on utilise pour cette transformation peut être obtenue à partir de microorganismes appartenant à divers genres, comprenant les genres Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus et Actinoplanes. Une autre source de glucose-isomérase a récemment été décrite dans le brevet des EUA N° 3956066 qui décrit la production de glucose-isomérase par des membres de l'espèce Flavobacterium dévorons.

La présente invention est issue de la découverte que certaines souches de l'espèce Flavobacterium arborescens peuvent produire de la glucose-isomérase en quantités significatives. Le procédé de préparation selon l'invention est défini à la revendication 1. L'enzyme obtenu selon ce procédé convient parfaitement pour l'utilisation à l'isomérisation du glucose. L'utilisation selon l'invention est définie à la revendication 5.

Bien que les organismes décrits ici soient identifiés comme des membres de l'espèce Flavobacterium arborescens, on notera qu'il y a à l'heure actuelle une certaine controverse quant à la classification appropriée de ces organismes. Les pages 362-363 de la 8e édition du «Manuel of Determinative Bacteriology» de Bergey indiquent que l'espèce Flavobacterium arborescens est classée de façon impropre comme un membre de l'espèce Flavobacterium. A l'heure actuelle, une nouvelle classification et une nomenclature révisée n'ont pas encore été établies pour ces organismes. On utilise donc ici la nomenclature existante en sachant qu'une autre désignation du genre sera finalement adoptée dans la reclassification de Flavobacterium arborescens. On notera également que Flavobacterium devorans auquel on se réfère dans le brevet des EUA N° 3956066 n'est pas sujet à une reclassification et appartient donc en fait à un genre différent.

Les organismes préférés que l'on utilise avec la présente invention sont des souches mutantes isolées de la culture déjà connue ATCC 4358 qui est disponible à l'American Type Culture Collection. Les souches préférées de Flavobacterium arborescens pouvant produire des quantités significatives de glucose-isomérase ont été déposées à la collection de cultures permanente de Northern Regional Research Laboratory, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, et sont disponibles depuis le 7 octobre 1976 sous le nom de cultures NRRL B-l 1 022 et NRRL B-l 1 023.

Les micro-organismes décrits ici peuvent être cultivés dans divers milieux contenant des sources de carbone, d'azote et des sels minéraux. Un milieu type comprend de la protéine animale hydroly-sée, de la liqueur de macération de maïs, un extrait de levure de brasserie, du phosphate monopotassique, du phosphate dipotassique et un glucide approprié. Les glucides que l'on peut utiliser comprennent le xylose, le glucose, le maltose, le saccharose et le lactose ainsi que les hydrolysats de xylanne, d'amidon et de cellulose. Le pH initial du milieu de culture est environ 7 et l'on effectue la fermentation par voie aérobie à environ 30e C dans un fermenteur ou une fiole agitée appropriée. On atteint une activité maximale d'isomérase généralement en environ 48 à 72 h.

On titre l'activité d'isomérase produite par les micro-organismes en faisant incuber à 60°C pendant 30 min un mélange contenant 0,5 ml de préparation contenant l'enzyme et 1,5 ml d'une solution contenant suffisamment de dextrose, de tampon Tricine (pH 8) et de chlorure de magnésium pour obtenir respectivement des concentrations finales 1,0M, 0,1M et 0,03M. A la fin de la période d'incubation, on arrête la réaction d'isomérisation par addition de 0,5 ml d'acide chlorhydrique 1,0N. Après centrifugation, on dilue de façon appropriée la fraction surnageante limpide et on détermine le fructose produit par le mode opératoire de L. Messineo et E.

Musarra décrit dans «Int. J.Biochem.», 3 (18), 691-699 (1972). L'activité d'isomérase est exprimée en micro-unités, une micro-unité d'activité étant définie comme la quantité d'enzyme qui produira 1 (ig de fructose par minute dans les conditions d'analyse décrites précédemment.

On a trouvé que la quantité d'isomérase produite par les souches préférées dans des conditions de culture favorables est très substantielle et significativement supérieure aux quantités obtenues avec d'autres micro-organismes producteurs d'isomérase décrits dans la technique antérieure. La production d'isomérase par les souches préférées varie considérablement selon les conditions de culture utilisées. Un résultat particulièrement surprenant et inattendu est que la production maximale d'isomérase se produit quand on utilise du lactose dans le milieu de culture. Par exemple, la culture de NRRL B-l 1022 dans un milieu contenant 2% de lactose donne 2892 microunités d'isomérase par millilitre de bouillon de fermentation. Ainsi, les souches préférées se caractérisent et se distinguent en outre des organismes de la technique antérieure par le fait qu'elles peuvent produire des quantités substantielles (c'est-à-dire 500 micro-unités par millilitre de bouillon ou plus) d'activité d'isomérase quand on les cultive dans un milieu nutritif contenant du lactose comme seule source de glucide. Une production d'enzyme très substantielle se produit également quand on n'ajoute pas de glucide au milieu. Cela est démontré par les résultats indiqués dans le tableau 1, obtenus en cultivant à 30°C des souches de Flavobacterium arborescens dans un milieu contenant 1 % de protéine animale hydrolysée (Bacto-Tryptone obtenu chez Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), 1 % de liqueur de macération de maïs, 1 % d'extrait de levure, 1 % de phosphate dipotassique, 0,5% de phosphate monopotassique et 2% de glucide quand il est indiqué.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

630116

Tableau 1

Production d'isomérase par F. arborescens

Tableau 4

Stabilité de l'isomérase de NRRL B-11022 à des températures choisies

Glucide dans le milieu

Heures

Activité d'isomérase (micro-unités/ml)

ATCC 4358

NRRL B-11022

NRRL B-l 1023

Aucun

72

0

1042

1480

Xylose

72

546

892

775

Glucose

72

0

89

1123

Lactose

72

0

2892

1679

Maltose

72

—

1314

—.

Saccharose

72

—

1190

—

L'isomérase produite par Flavobacterium arborescens présente une activité utilisable dans un intervalle de pH de 6 à 10 et à une température de 45 à 90° C. Le tableau 2 montre l'effet du pH et le tableau 3 montre l'effet de la température sur l'activité d'isomérase associée à des cellules entières obtenues en cultivant NRRL B-l 1 022 dans un milieu nutritif contenant du lactose, à 30°C pendant 72 h. La stabilité de l'enzyme est indiquée par les résultats du tableau 4. Pour obtenir les résultats des tableaux 2 et 3, on lave une fois avec de l'eau les cellules récoltées et on les remet en suspension dans de l'eau à la cencentration initiale des cellules dans le bouillon de fermentation. On utilise le mode opératoire d'analyse normalisé décrit précédemment pour mesurer l'activité d'isomérase, sauf que l'on fait varier le tampon dans l'étude du pH et que l'on fait varier la température dans les expériences sur l'effet de la température. Les études de stabilité résumées dans le tableau 4 comprennent l'incubation des cellules lavées dans un tampon Tricine 0,05M (pH 8) contenant du chlorure de magnésium (0,004M) et l'analyse des cellules incubées aux intervalles indiqués en utilisant le mode opératoire normalisé d'analyse.

Tableau 2

Effet du pH sur l'isomérase de NRRL B-11022

Tampon

PH

Activité de l'isomérase (micro-unités/ml)

Pipes1

6,0

598

Pipes1

6,5

1204

Pipes1

7,0

1782

Pipes1

7,5

2202

Tricine2

7,5

2624

Tricine2

8,0

3016

Tricine2

8,5

3456

Tricine2

9,0

3408

1 Pipes est l'acide 1,4-pipérazinediéthanesulfonique monosodique.

2 Tricine est la N-[2-hydroxy-l,l-bis(hydroxyméthyl)éthyl]glycine.

Tableau 3

Effet de la température sur l'isomérase de NRRL B-11022 à pH 8,0

Température (°C)

Activité de l'isomérase (micro-unités/ml)

45

775

50

1717

55

2776

60

3500

65

4400

70

5104

75

5960

80

6592

85

7088

Durée totale d'incubation (h)

Activité de l'isomérase (micro-unités/ml)

Incubation à 60°C

Incubation à 70° C

24

2212

2340

96

2276

2244

168

2276

2036

240

2262

2092

On voit d'après les résultats du tableau 4 que l'enzyme est 15 essentiellement stable pendant au moins 200 h à pH 8 et à 60° C, comme déterminé en analysant les cellules lavées contenant l'enzyme. La préparation enzymatique de cellules lavées est en outre caractérisée comme conservant au moins 85% de son activité quand on la chauffe pendant 200 h à 70°C et à pH 8.

20 L'isomérase produite par Flaviobacterium arborescens est très efficace pour transformer le glucose en fructose et l'on peut utiliser pour de telles transformations divers modes opératoires déjà décrits dans la technique antérieure. Par exemple, on peut utiliser les cellules entières directement dans une opération discontinue dans laquelle la 25 préparation enzymatique comprend le matériau cellulaire provenant du micro-organisme, ou bien les cellules peuvent être immobilisées dans un lit fixe pour une opération continue. Selon une autre variante, on peut utiliser un extrait débarrassé des cellules dans lequel l'isomérase est libérée des cellules par des procédés connus et 30 utilisée sous forme d'enzyme soluble dans un système discontinu ou est immobilisée pour l'utilisation dans un procédé continu. Des procédés d'utilisation des enzymes sous de telles formes sont bien connus, comme indiqué par exemple dans W.R.Vieth et K. Venkatasubramanian, «Chemtech.», 3, 677-684 (1973) et 4,47-55, 35 309-320 et 434-444 (1974).

Indépendamment de la forme sous laquelle on utilise l'isomérase pour l'isomérisation du glucose, la réaction doit être effectuée à une température comprise entre 45 et 90° C et de préférence entre 70 et 75° C. Le pH de la solution contenant du glucose doit être maintenu 40 entre 6 et 10, et de préférence entre environ 6,5 et 8,0, pour minimiser la formation de produits de dégradation à des températures élevées. L'enzyme est efficace avec des solutions de glucose relativement pur ainsi qu'avec des hydrolysats d'amidon préparés par un traitement acide et/ou enzymatique. On préfère pour l'étape de transformation 45 des concentrations en glucose de 30 à 60% en poids. L'activité de l'enzyme est améliorée par addition de petites quantités d'ions magnésium à la solution contenant le glucose. La solution contenant le fructose obtenue par l'isomérisation peut être raffinée en utilisant des procédés classiques, comme un traitement par du charbon activé 50 et des résines échangeuses d'ions.

Les exemples suivants illustreront mieux l'utilisation et les avantages de l'invention.

Exemple:

55

Dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml, on place 100 ml du milieu nutritif contenant les ingrédients suivants:

%

Protéine animale hydrolysée 1,0

M Liqueur de macération de maïs 1,0

Extrait de levure 1,0

K2HP04 1,0

KH2P04 0,5

Lactose 2,0

65 On inocule le milieu précédent avec un inoculum fraîchement préparé de Flavobacterium arborescens NRRL B-l 1 022 et on agite le milieu inoculé à 30°C en utilisant un agitateur rotatif. Au bout de 72 h, on recueille les cellules et on les lave. Une analyse révèle la présence

630116

4

d'une activité d'isomérase équivalant à 2892 micro-unités/ml de bouillon entier.

Exemple 2:

On effectue l'isomérisation du glucose en fructose en ajoutant 10 g de cellules entières lavées obtenues par le mode opératoire de l'exemple 1, à 500 ml d'un sirop de glucose à 50% (poids/volume) qui est 0,01 M en chlorure de magnésium. On ajuste le pH du sirop à 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium et on fait incuber le sirop à 60°C en agitant doucement. Au bout de 20 h, on analyse la teneur en fructose du sirop et on trouve que 45% du glucose ont été transformés en fructose.

Exemple 3:

On répète le mode opératoire de l'exemple 1, sauf que l'on utilise du xylose dans le milieu nutritif à la place du lactose et qu'on prépare l'inoculum à partir de Flavobacterium arborescens ATCC 4358. Au bout de 72 h, on récolte les cellules et une analyse indique la présence d'une activité d'isomérase équivalant à 546 micro-unités/ml de bouillon entier.

Exemple 4:

On répète le mode opératoire de l'exemple 1, sauf que l'on remplace le lactose par du glucose dans le milieu nutritif et que l'on obtient l'inoculum à partir de Flavobacterium arborescens NRRL B-l 1 023. Au bout de 64 h, on analyse les cellules recueillies et on trouve qu'elles ont une activité d'isomérase équivalant à 580 microunités/ml de bouillon entier.

Exemple 5:

s On effectue la transformation enzymatique du glucose en fructose en introduisant 9 g de cellules humides obtenues par le mode opératoire de l'exemple 4 dans 500 ml d'une solution de glucose à 50% (poids/volume) qui est 0,005M en chlorure de magnésium. On ajuste le pH du sirop à 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium et on fait io incuber la solution à 60°C en agitant doucement. L'analyse de la solution après 27 h révèle une teneur en fructose de 38%.

Exemple 6:

On cultive Flavobacterium arborescens NRRL B-l 1 022 à 30°C 15 pendant 70 h dans un fermenteur New Brunswick de 101, en utilisant le milieu nutritif décrit dans l'exemple 1. On recueille les cellules et on les immobilise dans le mode opératoire de floculation décrit dans le brevet des EUA N° 3821086, ce qui donne un agrégat de cellules floculées et séchées présentant 75 micro-unités d'activité d'isomérase 20 par gramme. On utilise pour l'isomérisation continue du glucose une colonne de verre de 2,5 cm de diamètre contenant 5 g de l'agrégat séché. On maintient la colonne à 60° C et on fait passer dans la colonne à un débit de 26 ml/h une solution de glucose à 50% (poids/volume) qui est 0,005M en chlorure de magnésium et dont le 25 pH a été ajusté à 8,0-8,4. On analyse la teneur en fructose de l'effluent de la colonne et on trouve que le degré de transformation du glucose en fructose est environ 45%.

Claims

630 116

1. Procédé de préparation d'un enzyme d'isomérisation du glucose, présentant une activité utilisable à une température de 45 à 90°C et à un pH de 6 à 10, caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme appartenant à l'espèce Flavobacterium arborescens dans un milieu nutritif, dans des conditions permettant la production dudit enzyme par ledit micro-organisme, et on recueille ledit enzyme.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est Flavobacterium arborescens ATCC 4358.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est Flavobacterium arborescens NRRL B-l 1 022.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est Flavobacterium arborescens NRRL B-l 1 023.

5. Utilisation de l'enzyme obtenu par le procédé selon la revendication 1 pour transformer du glucose en fructose, caractérisée en ce qu'on met une solution contenant du glucose en contact avec ledit enzyme.

6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'on opère à une température de 45 à 90°C dans un intervalle de pH de 6 à 10.

7. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'enzyme mis enjeu consiste en un extrait exempt de cellules du micro-organisme.

8. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'enzyme mis enjeu consiste en matériau cellulaire obtenu à partir dudit micro-organisme.

9. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisée en ce que l'enzyme mis enjeu a été obtenu à partir de Flavobacterium arborescens ATCC 4358, NRRL B-l 1 022 ou NRRL B-l 1 023.