DK143947B - Glucose-isomeriserende enzym og fremgangsmaade til fremstilling heraf samt fremgangsmaade til omdannelse af glucose til fructose - Google Patents

Description

(19) DANMARK

/φ ^ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (1)) 1^3947 Β

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 4647/77 (51) C 12 H 9/92 (22) Indleveringsdag 19· okt. 1977 C 12 P 19/02 (24) Løbedag 19· okt. 1977 C 07 H 3/02 (41) Aim. tilgængelig 21. apr. 1978 (44) Fremlagt 2. nov. 1981 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 20. okt. 1 976j 734222, US

(71) Ansøger R. J. REYNOLDS TOBACCO COMPANY, Winston-Salem, US.

(72) Opfinder Chin Kee Lee, US.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Glucose-isomeriserende enzym og fremgangsmåde til fremstilling heraf samt fremgangsmåde til om= dannelse af glucose til fructose.

Opfindelsen angår et glucose-isomeriserende enzym og en fremgangsmåde til fremstilling af dette enzym samt en fremgangsmåde til omdannelse af glucose til fructose under anvendelse af enzymet.

Der har i de senere år været betydelig interesse for den enzyma-Uj tiske omdannelse af glucose til fructose, især i forbindelse med > fremstillingen af fructoseholdige sirupper ud fra majsstivelse, ft Den glucose-isomerase, som anvendes til denne omdannelse, kan op-

J

70 ct Γ” * □ 1*3947 2 nås udfra mikroorganismer tilhørende forskellige slægter, herunder Arthrobacter, Streptomyces, Bacillus og Actinoplanes. En anden kilde til glucose-isomerase er fornylig blevet angivet i US patentskrift nr. 3956066, som beskriver fremstillingen af glucose-isomerase ved hjælp af mikroorganismer bl. a. tilhørende arten Flavo-bacterium devorans.

Den foreliggende opfindelse bygger på den erkendelse, at stammer af arten Flavobacterium arborescens er i stand til at producere glucose-isomerase i betydelige mængder. Dette enzym er eminent egnet til anvendelse ved en glucose-isomeriseringsproces.

Det glucose-isomeriserende enzym ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det udøver nyttig aktivitet ved en temperatur på 45-90°C og en pH-værdi på 6-10, og at det er opnået ud fra en mikroorganisme tilhørende arten Flavobacterium arborescens.

Selv om de her omhandlede organismer identificeres som tilhørende arten Flavobacterium arborescens, må det bemærkes, at der for øjeblikket er nogen uoverensstemmelse med hensyn til den rigtige klassificering af disse organismer. Side 362-363 i den 8. udgave af Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology angiver, at arten F. arborescens er urigtigt klassificeret som tilhørende slægten Flavobacterium. En ny klassificering og revideret nomenklatur er endnu ikke blevet etableret for disse organismer. Derfor anvendes den eksisterende nomenklatur i denne beskrivelse, underforstået at en anden slægtsbetegnelse i sidste ende vil blive vedtaget ved omklassificering af Flavobacterium arborescens. Det må også bemærkes, at Flavobacterium devorans, som er omtalt i US patentskrift nr. 3956066,ikke påregnes omklassificeret og således i virkeligheden tilhører en anden slægt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det glucose-isomeriserende enzym er ejendommelig ved, at en mikroorganisme tilhørende arten Flavobacterium arborescens dyrkes i et næringsmedium under aerobe betingelser, hvorpå enzymet udvindes.

De foretrukne organismer til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse er mutantstammer isoleret fra kulturen ATCC 4358, som kan fås fra the American Type Culture Collection. De foretrukne stammer af F. arborescens, som er i stand til at producere 3 143947 betydelige mængder glucose-isomerase, er blevet deponeret i den permanente ARS kultursamling ved the USDA Northern Regional Research Laboratory i Peoria, Illinois og er tilgængelige som kulturerne NRRL B-11022 og NRRL B-11023.

De heri omhandlede mikroorganismer kan dyrkes i en lang række medier indeholdende kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte. Et typisk medium inkluderer hydrolyseret dyreprotein, majsstøbevand, ølgærekstrakt, kaliumdihydrogenphosphat, kaliummonohydrogenphosphat og et egnet carbonhydrat. Carbonhydrater, som kan anvendes, inkluderer xylose, glucose, maltose, saccarose og lactose så vel som hydrolysater af xylan, stivelse og cellulose. Dyrkningsmediets begyndelse s-pH- værdi er omkring 7, og gæringen gennemføres aerobt ved omkring 30°C i en egnet fermentor eller rystekolbe. Den maksimale isomerase-aktivitet opnås almindeligvis i løbet af fra omkring 48 til omkring 72 timer.

Den af mikroorganismerne producerede isomerase-aktivitet prøves ved inkubering ved 60°C i 30 minutter af en blanding indeholdende 0,5 ml af det enzymholdige præparat og 1,5 ml af en opløsning indeholdende tilstrækkelig dextrose, "Triein-puffer" (pH 8) og magnesiumchlorid til at give slutkoncentrationer på henholdsvis 1,0M, 0,1M og 0,03M.

Ved enden af inkuberingsperioden afsluttes isomeriseringsreaktionen ved tilsætning af 0,5 ml 1,0N saltsyre. Efter centrifugering fortyndes den klare overvæske passende, og den producerede fructose bestemmes ved den procedure, som er beskrevet af L. Messineo and E. Musarra i Int. J. Biochem. 3(18), 691-699 (1972). Isomerase-ak-tiviteten udtrykkes i mikroenheder, hvor en mikroenhed aktivitet defineres som den mængde enzym, der vil producere et ^ug fructose pr. minut under de ovenfor beskrevne prøvningsbetingelser.

Den mængde isomerase, som produceres af de foretrukne stammer under gunstige dyrkningsbetingelser, har vist sig at være betydelig og væsentlig større end med andre isomerase-producerende mikroorganismer, som er angivet i den kendte teknik. De foretrukne stammers isomerase-produktion varierer betydeligt med anvendte dyrkningsbetingelser. Et særligt overraskende og uventet resultat, er, at den maksimale isomerase-produktion har vist sig at ske, når lactose anvendes i dyrkningsmediet. F.eks. gav dyrkning af NRRL B-11022 i et medium indeholdende 2% lactose 2892 mikroenheder isomerase pr. ml gæringsvæske. Således adskiller de foretrukne stammer sig U3947 4 yderligere fra de hidtil kendte organismer ved den karakteristiske egenskab, at de er i stand til at producere væsentlige mængder (d.v.s. 500/U enh. eller mere pr. ml gæringsvæske) isomerase-akti-vitet, når de dyrkes i et næringsmedium indeholdende lactose som den eneste carbonhydratkilde. Meget væsentlig enzymproduktion sker også, når der ikke sættes carbonhydrater til mediet. Dette påvises ved de i tabel 1 anførte data, baseret på dyrkning ved 30°C af stammer af F. arborescens i et medium indeholdende 1% hydrolyseret dyreprotein ("Bacto-Tryptone" opnået fra Difco Laboratories i Detroit, Michigan, U.S.A.), 1% majsstøbevand, 1% gærekstrakt, 1% ka-liummonohydrogenphosphat, 0,5% kaliumdihydrogenphosphat og 2% car-bonhydrat, hvor det er anført.

Tabel 1

Isomerase-produktion af F.arborescens

Carbonhydrat Isomerase-aktivitet i ^enh/ml 1 medium Timer ATCC 4558 NRRL B-11022 NRRL B-11025

Intet 72 0 1042 1480

Xylose 72 546 892 775

Glucose 72 0 89 1125

Lactose 72 0 2892 1679

Maltose 72 - 1314

Saccharose 72 - 1190 1

Den af F. arborescens producerede isomerase udviser nyttig aktivitet i pH-området fra omkring 6 til omkring 10 ved en temperatur på fra omkring 45 til 90°C. Tabel 2 viser virkningen af pH-vær-dien, og tabel 3 viser virkningen af temperaturen på isomerase-aktiviteten af hele celler opnået ved dyrkning af NRRL B-11022 i et lactoseholdigt næringsmedium ved 30°C i 72 timer. Enzymets stabilitet er angivet ved data i tabel 4. Til opnåelse af de i tabel 2 og 3 anførte data blev indhøstede celler vasket en gang og gensuspenderet i vand til den oprindelige koncentration af cellerne i gæringsvæsken. Den ovenfor beskrevne standard prøvningsprocedure anvendtes til måling af isomerase-aktivitet, undtagen at pufferen blev varieret ved pH-undersøgelsen, og temperaturen blev varieret ved forsøgene med temperaturens virkning. Den i tabel 4 sammenfattede stabilitetsundersøgelse involverede inkubering af vaskede 14 3 9 A 7 5 celler i 0,05M "TRIdNE" puffer (pH 8) indeholdende magnesium-chlorid (0,004M) og prøvning af de inkuberede celler ved de angivne intervaller under anvendelse af standard prøvningsproceduren.

Tabel 2

Virkning af pH på isomerase fra NRRL B-11022

Puffer pH Isomerase-aktlvltet i yu enh./ml PIPES1 6,0 598 PIPES1 6,5 1204 PIPES1 7,0 1782 PIPES1 7,5 2202 TRICINE2 7,5 2624 TRICINE2 8,0 3016 TRICINE2 8,5 5456 TRICINE2 9,0 3408 Ί PIPES er mononatrium-1,4-piperazindiethansulfonsyre.

2TRICINE er N-[2-hydroxy-l,l-bis(hydroxymethyl)ethyl]-glycin.

Tabel 3

Virkning af temperatur på isomerase fra NRRL B-11022 ved pH 8,0_

Temperatur i °C Isomerase-aktivitet i μ enh./ml 45 775 50 1717 55 2776 60 3500 65 4400 70 5104 75 5960 80 6592 85 7088 143947

Tabel 4 6

Stabilitet af isomerase fra NRRL B-11022 ved udvalgte temperaturer_

Total incubations- Isomerase-aktivitet i u erih./ml.

tid i timer_ 60°C incubation 70°C inculpation 24 2212 2340 96 2276 2244 168 2276 2036

Det fremgår klart af dataene i tabel 4, at enzymet er i hovedsagen stabilt i mindst 200 timer ved pH 8 og 60°C som bestemt ved prøvning af vaskede celler indeholdende enzymet. Enzympræparatet bestående af vaskede celler er yderligere karakteriseret ved at bevare mindst 85% af dets aktivitet, når det opvarmes i 200 timer ved 70°C ved pH 8.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til omdannelse af glucose til fructose er ejendommelig ved, at en glucoseholdig opløsning bringes i kontakt med et glucose isomeriserende enzym ifølge krav 1-4, eller fremstillet ifølge krav 5 eller 6, ved en temperatur på fra omkring 45 til omkring 90°C indenfor et pH-område på fra omkring 6 til omkring 10, og at der udvindes fructoseholdig væske.

Isomerase produceret af F. arborescens er meget effektiv til omdannelse af glucose til fructose, og forskellige procedurer, som allerede er beskrevet i den kendte teknik, kan anvendes til sådanne omdannelser. F.eks. kan de hele celler anvendes direkte i en charge-process, hvorved enzympræparatet består af cellemateriale af mikroorganismen, eller cellerne kan immobiliseres i et fast lag til kontinuert arbejde. Alternativt kan anvendes en cellefri ekstrakt, hvori isomerasen er frigjort fra cellerne ved kendte metoder og anvendes som opløseligt enzym i et charge-system eller immobiliseret til anvendelse ved en kontinuert process. Metoder til anvendelse af enzymer i sådanne former er som sagt velkendte, f.eks. fra en oversigt af W.R. Vieth and K. Venkatasubramanian publiceret i CHEMTECH 2» 677-684 (1973) og 4, 47-55, 309-320 og 434-444 (1974).

7 143947

Uanset formen, hvori isomerasen anvendes til glucose-isomerisering, skal reaktionen udføres ved en temperatur mellem 45 og 90°C, og fortrinsvis mellem 60 og 75°C. Den glucoseholdige opløsnings pH-værdi skal holdes mellem ca. 6 og 10, og fortrinsvis mellem 6,5 og 8,0, for at holde dannelsen af nedbrydningsprodukter minimal ved de forhøjede temperaturer. Enzymet er effektivt med relativt rene glucoseopløsninger såvel som med stivelsehydrolysater fremstillet ved syre- og/eller enzymbehandling. Glucosekoncentrationer på 30-60 vægt-9é foretrækkes til omdannelsestrinnet. Enzymaktiviteten forhøjes ved tilsætning af små mængder magnesiumioner til den glucoseholdige opløsning. Den fructoseholdige opløsning, som opnås fra isomeriseringen, kan renses ved anvendelse af konventionelle metoder, såsom behandling med aktivkul og ionbytterharpikser.

De følgende eksemper tjener til nærmere at belyse udøvelsen af og fordelene ved opfindelsen.

Eksempel 1 I en 500 ml Erlenmeyer-kolbe anbragtes 100 ml næringsmedium indeholdende følgende:

Procent

Hydrolyseret dyreprotein 1,0

Majsstøbevand 1,0 Gærekstrakt 1,0 k2hpo4 1,0 KH2P04 0,5

Lactose 2,0

Dette medium blev podet med frisk fremstillet podemateriale fra F. arborescens NRRL B-11022, og det podede medium blev omrørt ved 30°C under anvendelse af et roterende rysteapparat. Efter 72 timer blev cellerne indhøstet og vasket. En prøvning viste tilstedeværelsen af isomerase-aktivitet svarende til 2892 ja enh/ml hel væske.

8 M3947

Eksempel 2

Isomeriseringen af glucose til fructose udførtes ved tilsætning af 10 g vaskede hele celler, opnået ved proceduren i eks. 1, til 500 ml af en 50 vægt/vol.-% glucosesirup, som var 0,01M med hensyn til magnesiumchlorid. Siruppens pH-værdi blev indstillet til 8,0 ved hjælp af natriumhydroxid, og siruppen hlev incu-beret ved 60°C under svag omrøring. Efter 20 timer blev siruppen analyseret for fructose, og det fandtes, at 45% af glucosen ved blevet omdannet til fructose.

Eksempel 5

Proceduren fra eks. 1 blev gentaget, undtagen at der anvendtes xylose i næringsmediet i stedet for lactose, og at podematerialet var fremstillet ud fra F. arborescens ATCC 4358. Efter 72 timer blev cellerne indhøstet, og en prøvning viste tilstedeværelsen af isomerase-aktivitet svarende til 546 yu enh./ml hel væske.

Eksempel 4

Proceduren fra eks. 1 blev gentaget, undtagen at der anvendtes glucose i stedet for lactose i næringsmediet, og at podematerialet var opnået ud fra F. arborescens NRRL B-11023. Efter 64 timer blev de indhøstede celler prøvet og fandtes at have isomerase-aktivitet svarende til 580pi enh./ml hel væske.

Eksempel 5

Enzymatisk omdannelse af glucose til fructose frembragtes ved indførelse af 9 g våde celler opnået ved proceduren i eks. 4, i 500 ml af en 50 vægt/vol.-% glucoseopløsning, som var 0,005M med hensyn til magnesiumchlorid. Siruppens pH-værdi blev indstillet til 8,0 ved hjælp af natriumhydroxid, og opløsningen blev incuberet ved 60°C under svag omrøring. Analyse af opløsningen efter 27 timer viste et fructoseindhold på 38%.

Eksempel 6 F.arborescens NRRL B-11022 blev dyrket ved 30°C i 70 timer i en 9 143947 10 liters New Brunswick fermentor under anvendelse af det i eks.

1 beskrevne næringsmedium. Cellerne blev indhøstet og immobili-seret ved den i US patentskrift nr. 3821086 beskrevne flokkule-ringsprocedure til opnåelse af et tørt flokkuleret celleaggregat, som udviste isomerase-aktivitet svarende til 75 enh./ml.

En glaskolonne på 2,5 cm i diameter indeholdende 5 g af det tørrede aggregat anvendtes til kontinuert glucose-isomeriseri.ng. Kolonnen holdtes ved 60°C, og en 50 vægt/vol.-9é glucoseopløs-ning, som var 0,005M med hensyn til magnesiumchlorid og indstillet til en pH-værdi på 8,0-8,4 sendtes igennem kolonnen med en strømningshastighed på 26 ml pr. time. Afløbet fra kolonnen blev analyseret for fructose, og omdannelsesgraden af glucose til fructose fandtes at være omkring 4596.