JP3012356B2 - フルクトキナーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフルクトキナーゼを効率
よく製造する方法に関し、さらに詳細には、シュードモ
ナス属に属する細菌を使用して特性がすぐれたフルクト
キナーゼを効率よく製造する方法に係わる。

【０００２】

【従来の技術】フルクトースは生化学上、または生理的
に重要な物質である。たとえば食品分野において、フル
クトースは一般に多量のグルコースと共存しており、果
糖、あるいは転化糖として大量に消費されており、ま
た、農業分野においては果実の甘みの指標になり、製品
の品質の評価の項目とされている。また、健常人の血清
には通常0.０６mMのフルクトースが存在している。通
常、グルコースはフルクトースの５０〜１００倍量存在
している。しかして、このフルクトースは、人の健康状
態を把握−たとえば糖尿病のモニタリング−するための
重要な因子の１つとされている。従って、フルクトース
を正確に定量することが重要である。

【０００３】フルクトースは、従来は、たとえば、“Me
thods of Enzymatic Analysis 〔Second Edition〕, Ve
rlag Chemie Weinheim AcademicPress , Inc. , 1305-1
307”に記載されている方法で測定されている。しかし
てこの方法は下記の原理によるものである。すなわち、 （１）ＨＫ（ヘキソキナーゼ）の作用によって、Ｄ−フ
ルクトースとＡＴＰ（アデノシン三りん酸）とからＦ６
Ｐ（Ｄ−フルクトース６−りん酸）およびＡＤＰ（アデ
ノシン二りん酸）とが生成せしめられる。 （２）ＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）の作用
によって、前記（１）のＦ６ＰはＧ６Ｐ（Ｄ−グルコー
ス６りん酸）に変換せしめられる。 （３）Ｇ６ＰＤＨ（Ｄ−グルコース６−ホスホデヒドロ
ゲナーゼ）の作用により、前記（２）のＧ６ＰとＮＡＤ
Ｐ⁺ （ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸）
とからＤ−グルコノ−δ−６−りん酸（D-glucono-δ-l
actone 6-phospate）、ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドりん酸）およびＨ⁺ （水素
イオン）を生成せしめる。 （４）前記（３）のＮＡＰＤＨを、ＮＡＤＰＨの最大吸
収波長である３４０nmの吸光度によって、フルクトース
の量を求める。また、ヘキソキナーゼの１種としてフル
クトキナーゼが知られている。フルクトースをりん酸化
する酵素は、フルクトキナーゼまたはＤ−フルクトース
６−ホスホトランスフェラーゼ（Ｄ−fructose６−phos
photransferase) とも称され、酵素番号ＥＣ２．７．
１．４の酵素であり、Mg²⁺の存在下で、Ｄ−フルクトー
スおよびＡＴＰからＤ−フルクトース６−りん酸および
ＡＤＰを生成させる反応を触媒する酵素である。フルク
トキナーゼの生産菌としては(1)Streptomyces violacer
uber〔Sabater,B., Sebastian, J. & Asensio, C.(197
2)Biochem.Biophys.Acta, 284, 414-420〕, (2)Leucono
stoc mesenteroides〔Anderson, R.L. & Sapico, V.L.
(1975)Meth.Enzymol. 42, 39-43〕, (3)Streptococcus
faecalis 〔Moore, L.D.& O′Kane, D.J.(1963)J.Bacte
riol. 86, 766-772〕, (4)Aerobacter aerogenes 〔Kel
ker, N.E. & Hanson, T.E.(1970)J.Biol.Chem. 8, 2060
-2065〕, および(5)Echinococcus granulosus〔マメ；C
hen.M. & Whisteler, R.L.(1977)Adv.Carbohtdr.Chem.
& Biochem. 34, 285-343 〕などが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】たとえば血清中の、
フルクトースの定量にあたり、フルクトース検体には前
記したように一般に、フルクトースに比べ多量のグルコ
ースが共存している。従来の一般に入手し得るフルクト
キナーゼを使用した技術では検体中の基質としてフルク
トース以外にグルコースにも該酵素が作用し、かつ常に
フルクトースに比べて５０〜１００倍量存在するグルコ
ースによるブランクの高い測定になってしまい、大きな
誤差が生じるばかりかフルクトースの測定が困難な場合
も多かった。また前記の生産菌から得られたフルクトキ
ナーゼは性能が劣り、たとえば、Streptomycess violac
eruberからのフルクトキナーゼは安定性が悪く、０〜４
℃で２週間で完全に失活してしまい、また、Leuconosto
c mesenteriodes からのフルクトキナーゼはフルクトー
スに対する特異性が低く、フルクトースに対すると同様
にマンノースにも作用するなどにより、末だ実用に供さ
れているものは見当らない。もしも、フルクトースに対
する特異性が高く、他の糖類には実質的に作用せず、り
ん酸化の活性が高く、各種安定性のよいすぐれた特性を
有するフルクトキナーゼを見出し、これを容易に効率よ
く生産できれば、このようなフルクトキナーゼを使用す
ることでブランクのない、誤差を生じにくいフルクトー
ス測定系を組み立てることが可能となる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、フルクト
ースに対する基質特異性が高く、安定性に優れたフルク
トキナーゼを生産する微生物を見出すべく広く自然界か
らスクリーニングしたところ、熊本県熊本市の畑土壌よ
り分離したシュードモナス・エスピー・No. ９２１が目
的とする性質を有する酵素を生産していることを発見
し、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は、
シュードモナス属に属するフルクトキナーゼ生産菌を培
養して得られた培養物からフルクトキナーゼを採取する
ことを特徴とするフルクトキナーゼの製造法を提供する
ものである。本フルクトキナーゼ生産菌はシュードモナ
ス属に属するものであって、例えば、本発明者らが分離
したNo. ９２１菌株は本発明に最も有効に利用される菌
株の一例である。なお、本菌株の同定であたっては、同
定実験は「医学細菌同定の手引き（第２版）１９７
４」、“Microbiological Methods(第３巻）”に準じて
行い、ＤＮＡのＧＣmol％の測定はフェノール法で精製
したＤＮＡをヌクレアーゼＰ１で処理しＤＥＡＥカラム
を用いたＨＰＬＣで測定した。 キノンの分析は「新し
い分類学に伴走する細菌同定法」に準じてキノンを精製
しＨＰＬＣで分析した。生育温度テスト以外には、培養
は２８〜３０℃で行なった。 実験結果を“Bergey′sM
anual of Determinative Bacteriology（８版）、Berge
y′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.１（１
９８４）、同誌、Vol.２（１９８６）”などと対比して
同定を行った。なお、シュードモナス・エスピー・No.
９２１は微工研条寄第３３１０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３
３１０）として通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。

【０００６】シュードモナス・エスピー・No. ９２１の
菌学的性質を示す。すなわち、 １）生育の特徴 普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色〜淡黄土色を
呈する。可溶性色素は産生しない。 普通寒天平面培地 縁はなめらかで丸い平らな集落を形成する。灰白色〜淡
黄土色を呈する。可溶性色素は産生しない。 液体培地（ペプトン水） 生育は弱いが、一様に混濁する。リトマスミルク培地 変化しない。 ２）ＤＮＡのＧＣmol ％ ６4.５±1.０mol ％（ＤＥＡＥカラムを用いたＨＰＬＣ
分析） ３）主たるイソプレノイドキノン Ｑ₈ ４）形態の特徴 端の丸い、まっすぐかまたはやや曲がった桿状細菌で、
極毛で運動する。大きさは0.５×1.５〜2.０μｍで、芽
胞は形成しない。配列は単独、二連たまに短連鎖。 ５）生理・生化学的性状 グラム染色 − ＫＯＨ反応 ＋ 抗酸性染色 − カプセル形成 − ＯＦテスト（Hugh-Leifson) ０ ＯＦテスト（Ｎ源にNH₄H₂PO₄) ０ 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 ３７℃ − ３０℃ ＋ ２０℃ ＋ １０℃ ＮＴ 食塩耐性 ０％ ＋ 1.０％ （＋） 3.０％ − 生育pH 4.７ ＋ 9.０ ＋ １0.０ − ゲラチン分解 ＋ デンプン分解 ＋ カゼイン分解 −（生育しない） エスクリン分解 − セルロース分解 − チロシン分解 − Tween ８０の分解 − アルギニン分解 ＋ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 − レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（SSR) − ウレアーゼ産生（Chris.) − インドール産生 − 硫化水素産生（lead acetate paper) − アセトイン産生（K₂HPO₄) − アセトイン産生（NaCl) − ＭＲテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （No₂ ^- の検出） − （No₃ ^- の検出） ＋ シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − グルコースよりガスの産生 − 糖より酸の産生 アドニトール ＋ Ｌ（＋）−アラビノース ＋ セロビオース − ズルシトール − メソーエリスリトール − フルクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−グルコース ＋ グリセリン − イノシトール ＋ イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）−ラムノース ＋ Ｄ−リボース ＋ サリシン − Ｌ−ソルボース ＋ ソルビトール ＋ スターチ − サッカロース − トレハロース ＋ Ｄ−キシロース ＋

【０００７】シュードモナス・エスピー・No. ９２１の
同定について記載する。すなわち、 １）主性状 グラム陰性の桿状細菌で極毛で運動する。グルコースを
酸化的に分解し酸を産生する。オキシダーゼ非産生。カ
タラーゼ産生。ＤＮＡのＧＣmol ％は６4.５±1.０％。
主たるキノンはＱ₈ 。 ２）同定 No. ９２１は好気性のグラム陰性桿状細菌で運動性（極
毛）があることから、Pseudomonas 科のPseudomonas
属、Xanthomonas 属およびGluconobacter 属のいずれか
に属する。各属の鑑別表を記する。 No.921 Pseudomonas Xanthomonas Gluconobacter 色素産生 Ｗ Ｗ,Ｇ,Ｙ Ｙ Ｗ オキシダーゼ − ＋（−） − − カタラーゼ ＋ ＋ ＋ ＋ pH4.５での生育 − − − − キノン Ｑ₈ Ｑ_8,9,10 Ｑ₈ Ｑ₁₀ DNA のGCmol ％ 64.5 58〜70 63〜71 56〜64 Ｗ：白色、 Ｇ：灰色、 Ｙ：黄色 No. ９２１はpH4.５での生育性、色素産生性、キノン型
によりPseudomonas 属に属するものと同定した。ＤＮＡ
のＧＣmol ％が６４±５％の菌種を選んで諸性状を対比
したが、性状がよく一致する菌種の記載はなく種の確定
はできなかった。よってNo. ９２１を、Pseudomonas s
p. No. ９２１と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した。

【０００８】フルクトキナーゼを製造する方法について
説明する。すなわち、本発明においては、先ずシュード
モナス属に属するフルクトキナーゼ生産菌が適当な培地
で培養される。前記のフルクトキナーゼ生産菌の代表例
としては、前記のシュードモナス・エスピー・No. ９２
１が挙げられる。細菌の一般的性状として菌学上の性質
は自然にまたは人工的に変異し得るものである。従って
自然的にあるいは、通常行われる紫外線照射、放射線照
射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアジニンまたはエチルメタンスルホネー
トなどを用いる人工的変異手段により本菌株を変異させ
て得られる人工変異株は勿論、自然変異株も含めシュー
ドモナス属に属し、採取し得る量でフルクトキナーゼを
生産する能力を有する変異株または変種もすべて本発明
に使用することができる（これらを総括して本細菌と記
すこともある）。

【０００９】前記の培養は、細菌の培養に一般的に用い
られる条件によって行うことができる。培地としては、
本細菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに
必要に応じて無機塩などを含有させた栄養培地が使用さ
れる。本細菌が同化し得る炭素源としては、グルコー
ス、フルクトース、サッカロースおよびマンノースなど
が単独、または組み合わせて用いられる。本細菌が同化
し得る窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス
およびマルトエキスなどが単独、または組み合わせて用
いられる。その他、必要に応じて無機塩、金属塩などが
使用される。前記以外に本細菌が同化し得る炭素源、同
化し得る窒素源が使用できることは言うまでもない。培
養は通常、振とうまたは通気撹拌培養などの好気的条件
下で行うのがよく、工業的には深部通気撹拌培養が好ま
しい。培養温度はフルクトキナーゼ生産菌が発育し、本
酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は１５
〜３２℃、特に２８℃付近が好ましい。培養時間は培養
条件によって異なるが、本酵素が最高力価に達する時期
を見計らって適当な時間に培養を停止すればよく、通常
は１〜２日間程度である。発泡があるときにはシリコン
油などの消泡剤が適宜使用される。フルクトキナーゼ
は、一般にこの様にして得られた本細菌の主として菌体
内に含有されているので、得られた培養液から濾過また
は遠心分離等の常法によって集菌し、これらの菌体を超
音波処理、フレンチプレス処理、ガラスビーズ処理等の
機械的破壊手段やリゾチーム等の酵素的溶解等の種々の
方法を適宜単独、あるいは組み合わせて粗製のフルクト
キナーゼ含有液が得られる。

【００１０】次に、このフルクトキナーゼ含有液から公
知の蛋白質、酵素の精製手段を用いることにより精製さ
れたフルクトキナーゼを得ることができる。例えば粗製
のフルクトキナーゼ含有液に硫安を添加して硫安沈殿に
より本酵素を回収し、さらにその後必要に応じて分子
篩、各種クロマトグラフィー法を適宜組み合わせて精製
すればよい。こうして得られた精製酵素は、必要に応じ
てサッカロースおよびマンニトールなどの糖類、牛血清
アルブミンなどの蛋白質類等の安定化剤が添加され、凍
結乾燥によりフルクトキナーゼの粉体を得ることができ
る。

【００１１】このようにして得られたフルクトキナーゼ
（以下 本酵素 と記す）の性状は以下のとうりであ
る。すなわち、 （１）酵素作用 下記式に示すようにMg²⁺の存在下で、Ｄ−フルクトース
およびＡＴＰからＤ−フルクトース６−りん酸およびＡ
ＤＰを生成させる反応を触媒する。

【００１２】（２）基質特異性 フルクトース １００％ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン０ グルコース ０ ラクトース ０ ソルボース ０ サッカロース ０ ガラクトース ０ マルトース ０ キシロース ０ ソルビトール ０ マンノース 0.１^* ２−デオキシ−Ｄ−リボース ０ ２−デオキシ−Ｄ−グルコース ０^* ：マンノースには作用せずにマンノース中の不純物と
して存在した基質（未同定）との反応結果か、又は、マ
ンノースに対して相対活性0.１％を示した結果かは判定
し得なかったが、フルクトースの定量時において実質的
に影響を及ぼさないことが考察される。

【００１３】（３）分子量 75,000±8000 トーソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（0.７５×６０
cm）による値である。溶出液；0.２M NaCl含有0.１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH7.０）。標準蛋白としてオリエンタル酵
母社製の次のマーカーを使用した。 分子量 12,400 シトクロームＣ 32,000 アデニレイトキナーゼ 67,000 エノラーゼ 142,000 ラクテイトデヒドロゲナーゼ 290,000 グルタメイトデヒドロゲナーゼ

【００１４】（４）等電点 5.１２±0.５２ キャリアアンフォライト（pH3.５〜１０）を用いる焦点
電気泳動法により４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通
電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した。

【００１５】（５）Km値（ミハエリス定数） １００mM トリス塩酸緩衝液（pH8.０） ３０mM Ｄ−フルクトース（和光純薬社製） 0.２％ 牛血清アルブミン（シグマ社製） ５Ｕ／ml ジアホラーゼ（東洋醸造社製） ５Ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム山ノ内社製） ２０Ｕ／ml グルコース６−りん酸デヒドロゲナーゼ
（東洋醸造社製） １mM ＮＡＤＰ⁺ ５mM MgCl₂ および 0.025 ％ ニトロテトラゾリウムブルー（和光純薬社
製） を含む反応液中でＡＴＰの濃度を変化させて、ＡＴＰに
対するKm値を測定した結果では0.７１mMの値を示した。
一方、前記反応液中で３０mMフルクトースの代わりに１
０mM ＡＴＰを添加し、Ｄ−フルクトースの濃度を変化
させて、Ｄ−フルクトースに対するKm値を測定した結果
では1.０mMを示した。

【００１６】（６）熱安定性 本酵素液（1.０Ｕ／ml）を２０mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.０）で調製し、各温度で１５分間加熱処理後、その残
存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した。その
結果は図１に示されるとうりであって、酵素活性は４０
℃までは安定であった。

【００１７】（７）至適温度 １００mMトリス塩酸緩衝液（pH8.０）、３０mM Ｄ−フ
ルクトース、１０mMＡＴＰおよび５mM MgCl₂で調製した
反応液１mlに本酵素（１Ｕ／ml）１０μｌを添加し、３
０、３５、４０、４５、５０および５５℃のそれぞれの
温度で１５分間反応させた後、直ちにアミコンセントリ
フローＣＦ２５（アミコン社製）を用いて２℃で限外濾
過を行って濾液を得、この濾液中のＤ−フルクトース６
−りん酸を後記の反応液を用いて測定した。その結果
は、図２に示されるとうりであって、４５°において最
も活性が高かった。 反応液 １００mM トリス塩酸緩衝液（pH8.０） 0.２％ 牛血清アルブミン ５Ｕ／ml ジアホラーゼ ５Ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ ２０Ｕ／ml グルコース６−りん酸デヒドロゲナーゼ １mM ＮＡＤＰ⁺ および 0.０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー 前記の反応液１mlに濾液を0.０５ml添加し、３７℃で５
分間反応させた後に、0.１Ｎ塩酸を２ml添加して反応を
停止させ、５５０nmにおける吸光度を測定した。

【００１８】（８）pH安定性 本酵素液（1.０Ｕ／ml）を４０mMの酢酸緩衝液（pH5.０
〜6.０ 白抜三角で表示）、りん酸緩衝液（pH6.０〜8.
０ 白抜円で表示）およびトリス塩酸緩衝液（pH8.０〜
１0.０黒円で表示）の各緩衝液で調製し、４０℃で１５
分間加熱処理した後、その残存活性を後記の酵素活性測
定法に従って測定した。その結果は図３に示されるとう
りであって、pH6.５〜8.０の範囲で９５％以上の活性を
保持していた。

【００１９】（９）至適pH 酢酸緩衝液（pH，5.０，5.５，6.０ 白抜三角で表
示）、りん酸緩衝液（pH，6.０，6.５，7.０，7.５，8.
０ 白抜円で表示）およびトリス塩酸緩衝液（pH，8.
０，8.５，9.０，9.５ 黒円で表示）の各緩衝液で調製
した反応液に本酵素を添加し、３７℃で反応させた後、
0.１Ｎ塩酸２mlで反応を停止させ、５５０nmにおける吸
光度を測定した結果は図４に示されるとうりであって、
pH７付近で最も活性が高かった。

【００２０】（10) 金属イオンの活性に及ぼす影響 後記の酵素活性測定法のMgCl₂ の代わりに以下に示した
２価の金属の塩酸塩を添加して、酵素活性を測定した結
果、MnCl₂ がMgCl₂ の8.２％を示しただけで他の金属イ
オンは作用しなかった。 金属塩 相対活性 none ０％ MgCl₂ １００ BaCl₂ ０ CaCl₂ ０ MnCl₂ 8.２ ZnCl₂ ０ NiCl₂ ０ CuCl₂ ０ CoCl₂ ０

【００２１】（11) 水溶液中における保存安定性 0.０５％ NaN₃ 含有４０mMトリス塩酸緩衝液（pH8.０）
で本酵素液（５Ｕ／ml）を調製し、５℃における保存安
定性の検討を行った。その結果は図５に示されるとうり
であって３週間で９６％、６週間でも９１％の高い活性
を保持していた。

【００２２】（12) フルクトキナーゼの活性測定法 1.反応液組成 １００mM トリス塩酸緩衝液（pH8.０） ５mM MgCl₂ ３０mM Ｄ−フルクトース（和光純薬社製） １０mM ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製） 0.２％ 牛血清アルブミン（シグマ社製） １mM ＮＡＤＰ⁺ （オリエンタル酵母社製） ５Ｕ／ml ジアホラーゼ（東洋醸造社製） ５Ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム山ノ内社製） ２０Ｕ／ml グルコース６−りん酸デヒドロゲナーゼ
（東洋醸造社製） 0.０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー（和光純薬社
製） 2.活性測定法 前記の反応液１mlを小試験菅に入れ、３７℃で２分間イ
ンキュベイトした後に、適当に希釈した酵素液を0.０２
ml添加して反応を開始させる。正確に１０分間インキュ
ベイトした後に、0.１Ｎ塩酸2.０mlを添加して反応を停
止させ、Ａ_{550n m} を測定して吸光度Ａ₁ を求める。この
とき同時に酵素無添加のものをブランクとし吸光度Ａ₀
を求める。 3.計算式 Ｕ／ml＝ (A₁-A₀)／19.3 × 1／10 × 3.02 ／0.02 × Ｚ 式中、１9.３；分子吸光係数cm² ／μmol 、Ｚ；希釈倍
率

【００２３】

【実施例】次に、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これにより本発明を限定するものではない。 実施例１ 〔シュードモナス・エスピー・No. ９２１の培養〕ポリ
ペプトン１％、酵母エキス0.５％、カザミノ酸１％、マ
ルトエキス１％、マンノース１％、KH₂PO₄0.３％および
MgSO₄ ・７H₂O 0.０５％を含む液体培地（pH7.０）１０
０mlを、５００ml容三角フラスコ２０本に分注し、１２
０℃で２０分間加熱滅菌した後、これにシュードモナス
・エスピー・No. ９２１の菌体１白金耳を接種し、２８
℃で１２０r.p.m.の振とう培養器で４０時間培養し、酵
素活性0.１Ｕ／mlの培養物1.９Ｌを得た。

【００２４】実施例２ 〔酵素の分離精製〕実施例１で得られた培養液1.９Ｌを
遠心分離して集菌し、得られた菌体を２０mMトリス塩酸
緩衝液１Ｌ（pH8.０）で一回洗浄した。洗浄した菌体を
２０mMトリス塩酸緩衝液（pH8.０）に懸濁して５０mlに
調製し、クボタ社製の超音波破砕器（INSONATOR 201M)
を用いて１８０Ｗ、１０分間で破砕して破砕液を得た。
この破砕液から15,000r.p.m.、２０分間の遠心分離で４
２ml（酵素活性3.５Ｕ／ml）の上清を得た。この上清に
硫安１１ｇを溶解し、生じた沈殿物を遠心分離して除去
し、得られた上清に再び硫安８ｇを溶解し、生じた沈殿
物を遠心分離し、得られた沈殿物を２０mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.０）２０mlで溶解し、これを透析チューブを
用いて２０mMトリス塩酸緩衝液（pH8.０）２Ｌに対して
１晩透析し、２５mlの酵素液（酵素活性4.７Ｕ／ml）を
得た。得られた酵素液を２０mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）５０mlのカラムに通し、0.２Ｍ塩
化カリを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH8.０）１Ｌを
流し、次いで0.３Ｍ KClを含む２０mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.０）で溶出し、酵素液１００ml（酵素活性1.２Ｕ
／ml）を得た。得られた酵素液を２０mMトリス塩酸緩衝
液（pH6.５）５Ｌに対して一晩透析した。透析して得た
酵素液を２０mMトリス塩酸緩衝液（pH6.５）で緩衝化し
たブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）
５mlのカラムに通し、通過液１１０ml（酵素活性1.０Ｕ
／ml）を得た。この通過液中にはコンタミ酵素としての
ヘキソキナーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼが全く存在しなかった。この通過液をアミコン
セントリフローＣＦ２５（アミコン社製）を用いて濃縮
し、２ml（酵素活性５４Ｕ／ml）の酵素液を得た。

【００２５】実施例３ 本酵素を用いたＤ−フルクトースの定量 １００mM トリス塩酸緩衝液（pH8.０） ２Ｕ／ml フルクトキナーゼ（実施例２で得られた本酵
素） ５Ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ ２０Ｕ／ml グルコース６−りん酸デヒドロゲナーゼ ５mM ＡＴＰ １mM ＮＡＤＰ⁺ ５mM MgCl₂ 前記の反応液を調製し、これを小試験管に１mlづつ分注
し、３７℃で２分間インキュベイトした後に、１、２、
３、４、５mMにそれぞれ調製したＤ−フルクトース液を
それぞれ１０μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベ
イトした後に生成されたＮＡＤＰＨのＡ_340nm の吸光度
を測定した。このときＤ−フルクトース無添加のものを
ブランクとして測定し、このブランクを差し引いたΔＡ
_340nm の結果は図６に示されるとうりであって、原点を
通る直線を示しており、ほぼ理論量のＤ−フルクトース
６−りん酸が生成されていた。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、フルクトースに対する特
異性が高く、他の糖類には実質的に作用せず、りん酸化
の活性が高く、各種安定性のよいすぐれた特性を有する
フルクトキナーゼが容易に、効率よく得られる。また、
このようにして得られたフルクトキナーゼを使用するこ
とにより、多量な他の糖類の共存下でもフルクトースを
正確に、しかも容易に定量することが可能となり、本発
明の産業上の価値は極めて高い。

【００２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の熱安定性を示すグラフである。

【図２】本酵素の至適温度を示すグラフである。

【図３】本酵素のpH安定性を示すグラフである。

【図４】本酵素の至適pHを示すグラフである。

【図５】本酵素の水溶液中における保存安定性を示すグ
ラフである。

【図６】本酵素を用いてＤ−フルクトースを定量すると
きの検量線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シュードモナス属に属するフルクトキナ
   ーゼ生産菌を培養し、得られた培養物からフルクトキナ
   ーゼを採取することを特徴とするフルクトキナーゼの製
   造法。
2. 【請求項２】 シュードモナス属に属するフルクトキナ
   ーゼ生産菌が、シュードモナス・エスピー・No. ９２１
   （ＦＥＲＭ ＢＰ−３３１０）である請求項１記載の製
   造法。