JPH0556798A - α−アミラーゼ測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 フルクトースを末端に含むマルトオリゴ糖を
基質に用いたα−アミラーゼ測定方法であって、フルク
トースに基質特異性の高い新規フルクトースキナーゼＴ
を作用させることからなる。 【目的】 臨床検査の分野に有用な高精度のα−アミラ
ーゼの測定方法を提供すること。 【効果】 試料中のグルコースの影響を受けず、また波
長３４０ｎｍを選択することにより試料中のビリルビン
やヘモグロビンの影響を受けることもないので精度の高
いものである。また吸光度の上昇反応を採用することに
より、測定範囲を広くとることができる。さらに、無機
リンの添加が不要であるため、α−アミラーゼ活性化剤
であるカルシウムイオンを添加しても沈殿ができないの
で自動分析装置へも適応できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は主として臨床検査の分野
で利用される生体試料に含まれるα−アミラーゼの新規
な測定方法に関する。

【０００２】

【従来技術】従来より臨床検査での生体試料である血
清、血漿、尿などに含まれるα−アミラーゼの測定は、
膵疾患や耳下腺炎などの検査マーカーとして知られてい
る。α−アミラーゼの測定方法には種々のものがある
が、古くはSomogyらによる澱粉を基質に用いた方法があ
った。しかし、この方法は測定精度が悪いため、現在は
色原体としてｐ−ニトロフェノールを結合させたマルト
オリゴ糖誘導体を基質として用いた方法がよく使用され
ている。これによると、反応速度論的な分析が可能であ
り、自動分析装置へも適用できる利点がある。しかし、
ｐ−ニトロフェノールの測定波長である４００ｎｍ付近
は試料中のビリルビンやヘモグロビンの吸収とも重なる
ため、これらが測定に影響するという問題点がある。

【０００３】最近、マルトオリゴ糖の末端をフルクトー
スで修飾した基質を用いた方法が報告されている（特開
昭６３−１２９９９７号公報、特開平２−１７７９００
号公報）。前者はα−アミラーゼの作用後、αーグルコ
シダーゼを作用させ、生じたフラクトースにマンニトー
ル脱水素酵素の存在下でＮＡＤＨをＮＡＤに変化させる
方法である。この方法は試料中の内因性のグルコースの
影響を受けることがなく、また更に波長３４０ｎｍで測
定するために試料中のビリルビンやヘモグロビンの影響
を受けることもないが、吸光度の減少を測定するために
測定範囲が狭いという問題点がある。後者は、生じたフ
ルクトースをシュークロースホスフォリラーゼ以下酵素
共役反応によりＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変化す
るのを測定する方法である。この方法は前者の問題が改
善できたと言われているが、当該反応には無機リンを成
分として加えているためにα−アミラーゼの活性化剤で
あるカルシウムイオン（Ｃａ⁺⁺）を添加するとリン酸カ
ルシウムが形成されるが、これは不溶性のため測定に影
響を与えるという問題点がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように臨床検査
においてα−アミラーゼを測定するための従来の方法に
は種々の問題が残っている。そのため膵疾患などを正し
く診断する上での障害ともなっている。本発明の目的は
このような問題点を改良したα−アミラーゼの測定方法
を提供することであり、かくして臨床検査を迅速しかつ
正確に行うことが可能となる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、α−アミラーゼの測定にフルクトースを末端に
含むマルトオリゴ糖を基質として用いる方法について鋭
意研究を重ねた結果、試料と当該基質との反応によって
生じたフルクトースに、本願出願人が見出した新規なフ
ルクトキナーゼＴを作用させることにより、従来の問題
点が解決できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００６】即ち、本発明は、式（Ｉ）

【化４】 （式中、Ａは式(II)

【化５】 または式(III)

【化６】 で表される基を、ｎは４〜１５の整数を、Ｒ₁ 〜Ｒ₄ は
それぞれ水素原子、低級アルキル基、または−（ＣＨ₂)
_m ＣＯＯＭ（ｍは０、１または２、Ｍは水素原子または
アルカリ金属を示す）を、Ｘ₁ 〜Ｘ₄ はそれぞれＯまた
はＳを、Ｚ₁ およびＺ₂ はそれぞれ水素原子またはリン
酸基を表わす）で表される少なくとも一種のマルトオリ
ゴ糖と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触させて生
じたフルクトースにフルクトキナーゼＴを作用させ、生
じた成分を測定することを特徴とするα−アミラーゼ測
定方法である。

【０００７】本発明において式（Ｉ）で表されるマルト
オリゴ糖は基質として使用されるものである。式（Ｉ）
において、Ｒ₁ 〜Ｒ₄ で表される低級アルキル基は直鎖
状または分岐状のいずれでもよく、その好ましい炭素数
は１〜４である。また、Ｍで表されるアルカリ金属とし
てナトリウム、カリウムなどが例示される。

【０００８】式（Ｉ）において、非還元末端であるＡ部
分は、未置換グルコースでもよいし、またグルコースの
４位および／または６位が置換されたものでもよい（即
ち、前記式（II) で表される基）、さらにはグルコース
の４位と６位とが一緒になってアルキレン橋を形成して
いるものでもよい（即ち、前記式（III)で表される
基）。

【０００９】このように、一般式（Ｉ）において、Ａ部
分は無修飾（未置換）および修飾（置換）されたグルコ
ースのいずれをも包含するものであるが、本発明におい
ては、修飾グルコースであることが好ましい。けだし、
マルトオリゴ糖からなる基質において、非還元末端がグ
ルコース自体であると、α−アミラーゼ活性測定時に使
用する共役酵素であるグルコシダーゼが一部の非還元末
端のグルコースを切断し、α−アミラーゼ活性測定に誤
差を与えてしまう危険性があるのであるからである。も
ちろん、無修飾（未置換）のものであっても好適に本発
明に使用しえるものであることはいうまでもない。

【００１０】修飾された非還元末端としては、前記式
（II) および式（III)において、下記に示すような基が
好適なものとして例示される。 (a)式（II) に関して： 基１： Ｘ₁ ＝Ｏ Ｘ₂ ＝Ｏ Ｒ₁ ＝ＣＨ₃ Ｒ₂
＝ＣＨ₃ 基２： Ｘ₁ ＝Ｏ Ｘ₂ ＝Ｏ Ｒ₁ ＝ＣＨ₃ Ｒ₂
＝Ｈ 基３： Ｘ₁ ＝Ｏ Ｘ₂ ＝Ｓ Ｒ₁ ＝Ｈ Ｒ₂ ＝Ｃ
₂ Ｈ₅ 基４： Ｘ₁ ＝Ｓ Ｘ₂ ＝Ｓ Ｒ₁ ＝ＣＨ₃ Ｒ₂
＝ＣＨ₃ 基５： Ｘ₁ ＝Ｓ Ｘ₂ ＝Ｏ Ｒ₁ ＝ＣＨ₃ Ｒ₂
＝Ｈ 基６： Ｘ₁ ＝Ｓ Ｘ₂ ＝Ｓ Ｒ₁ ＝Ｈ Ｒ₂ ＝Ｃ
Ｈ₃ 基７： Ｘ₁ ＝Ｏ Ｘ₂ ＝Ｏ Ｒ₁ ＝ＣＯＯＨ Ｒ₂
＝ＣＨ₃

【００１１】(b) 式（III)に関して： 基８ ：Ｘ₃ ＝Ｏ Ｘ₄ ＝Ｏ Ｒ₃ ＝ＣＨ₃ Ｒ₄
＝Ｈ 基９ ：Ｘ₃ ＝Ｏ Ｘ₄ ＝Ｓ Ｒ₃ ＝Ｈ Ｒ₄ ＝Ｃ
Ｈ₃ 基１０：Ｘ₃ ＝Ｓ Ｘ₄ ＝Ｏ Ｒ₃ ＝Ｈ Ｒ₄ ＝Ｃ
₂ Ｈ₅

【００１２】また、一般式（Ｉ）においてｎとしては、
具体的には５、８、１０、１６などが好適なものとして
あげられ、それぞれマルトペンタオース（Ｇ₅) マルト
オクタノース（Ｇ₈)、マルトデカオース（Ｇ₁₀) 、マル
トヘキサデカオース（Ｇ₁₆)を形成する。なお、上記に
おいてＧはグルコースを意味する。これらのうち、特に
Ｇ₅ 〜Ｇ₈ は水溶性に優れるうえに２種のアイソエンザ
イムの作用を均等に受ける可能性が高いため、基質とし
て特に好ましい。

【００１３】上記式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖
は、たとえば特開昭６３−１２９９９７号公報に記載の
方法により製造することができる。本発明は上記式
（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖を基質とし、α−アミ
ラーゼの作用後にグルコアミラーゼ、α−グルコシダー
ゼを作用させ、そこで生じたフルクトースに本願出願人
が見出した新規フルクトキナーゼＴを作用させ、α−ア
ミラーゼを測定するものである。

【００１４】本発明に用いるフルクトキナーゼＴは新規
物質であり、シュードモナス族菌No. ９２１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３１０）により産生される酵素である（特願
平３−１２２９５２号明細書）。本酵素の理学的特性を
以下に簡単に示す。

【００１５】（１）作用 本酵素は下記の反応を触媒する。 （２）分子量 75,000±8,000 （トーソー社製TSK ゲルG3,000SW(0.75
×60cm) による。)

【００１６】（３）等電点 5.12±0.52（キャリアアンフォライト(pH3.5〜10.0) を
用いた。) （４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 （pH7.0 付近（りん酸緩衝液）pH6.5 〜8.0 の範囲で95
% 以上の安定を有する。) （５）熱安定性 20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 、40℃、15分間の加熱に
対して安定。

【００１７】（６）その他 基質特異性；フルクトース（100%) 、グスコース(0) 、
ソルボース(0) 、ガラクトース(0) 、キシロース(0) 、
ラクトース(0) 、サッカロース(0) 、マルトース(0) 、
ソルビトール(0) 、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
（０）、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（０）

【００１８】フルクトキナーゼＴの活性測定法 １．反応液組成 100mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 5mM MgCl₂ 30mM Ｄ−フルクトース（和光純薬社製） 10mM ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製） 0.2% 牛血清アルブミン( シグマ社製) 1mM NADP⁺ ( オリエンタル酵母社製) 5U/ml ジアホラーゼ( 東洋醸造社製) 5U/ml ホスホグルコースイソメラーゼ( ベーリンガー
マンハイム山之内社製) 20U/ml グルコース6-りん酸デヒドロゲナーゼ( 東洋
醸造社製) 0.025% ニトロテトラゾリウムブルー( 和光純薬社
製）

【００１９】２．活性測定法 前記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で２分間
インキュベイトした後に、適当に希釈した酵素液を０．
０２ｍｌ添加して反応を開始させる。正確に１０分間イ
ンキュベイトした後に、０．１Ｎ塩酸２．０ｍｌを添加
して反応を停止させ、Ａ５５０ｎｍを測定して吸光度Ａ
₁ を求める。このとき同時に酵素無添加のものをプラン
クとして吸光度Ａ₀ を求める。

【００２０】３．計算式 Ｕ／ｍｌ＝（Ａ₁-Ａ₀)/19.3 × 1/10 × 3.02/0.02 ×Ｚ 式中、１９．３；分子吸光係数ｃｍ²/μｍｏｌ、Ｚ；希釈倍率

【００２１】本発明者らが分離したNo. ９２１菌株は、
フルクトキナーゼＴの製造に最も有効に利用される菌株
の一例である。

【００２２】なお、本菌株の同定にあたっては、同定実
験は「医学細菌同定の手引き（第２版）１９７４」、
“Microbiological Methods(第３巻）”に準じて行い、
ＤＮＡのＧＣ mol％の測定はフェノール法で精製したＤ
ＮＡをヌクレアーゼＰ１で処理しＤＥＡＥカラムを用い
たＨＰＬＣで測定した。キノンの分析は「新しい分類学
に伴走する細菌同定法」に準じてキノンを精製しＨＰＬ
Ｃで分析した。生育温度テスト以外には、培養は２８〜
３０℃で行った。実験結果を“Bergey's Manualof Dete
rminative Bacteriology （８版）、Bergey's Manual o
f Systematic Bacteriology Vol.1（１９８４）、同
誌、Vol.２（１９８６）”などと対比して同定を行っ
た。

【００２３】なお、シュードモナス・エスピー・No. ９
２１は微工研条寄第３３１０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３
１０）として通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。

【００２４】シュードモナス・エスピー・No. ９２１の
菌学的性質を示す。すなわち、 １）成育の特徴 普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色〜淡黄土色を
呈する。可溶性色素は産生しない。 普通寒天平面培地 縁はなめらかで丸い平らな集落を形成する。灰白色〜淡
黄土色を呈する。可溶性色素は産生しない。 液体培地（ペプトン水） 生育は弱いが、一様に混濁する。 リトマスミルク培地 変化しない。

【００２５】２）ＤＮＡのＧＣ mol％ ６４．５±１．０ mol％（ＤＥＡＥカラムを用いたＨＰ
ＬＣ分析） ３）主たるイソプレノイドキノン Ｑ₈ ４）形態の特徴 端の丸い、まっすぐかまたはやや曲がった桿状細菌で、
極毛で運動する。大きさは０．５×１．５〜２．０μｍ
で、芽胞は形成しない。配列は単独、二連たまに短連
鎖。

【００２６】５）生理・生化学的性状 グラム染色 − ＫＯＨ反応 ＋ 抗酸性染色 − カプセル形成 − ＯＦテスト（Hugh-Leifson) ０ ＯＦテスト（Ｎ源にNH₄H₂PO₄) ０ 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 ３７℃ − ３０℃ ＋ ２０℃ ＋ １０℃ ＮＴ 食塩耐性 ０％ ＋ １．０％ （＋） ３．０％ − 生育pH ４．７ ＋ ９．０ ＋ １０．０ − ゲラチン分解 ＋ デンプン分解 ＋ カゼイン分解 −
（生育しない） エスクリン分解 − セルロース分解 − チロシン分解 − Tween ８０の分解 − アルギニン分解 ＋ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 − レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（SSR) − ウレアーゼ産生（Chris.) − インドール産生 − 硫化水素産生（lead acetate paper) − アセトイン産生（K₂HPO₄) − アセトイン産生（NaCl) − ＭＲテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （No₂ ^- の検出） − （No₃ ^- の検出） ＋

【００２７】シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 −

【００２８】クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 −

【００２９】グルコースよりガスの産生
− 糖より酸の産生 アドニトール ＋ Ｌ（＋）−アラビノース ＋ セロピオース − ズルシトール − メソ−エリスリトール − フルクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−グルコース ＋ グリセリン − イノシトール ＋ イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）−ラムノース ＋ Ｄ−リボース ＋ サリシン − Ｌ−ソルボース ＋ ソルビトール ＋ スターチ − サッカロース − トレハロース ＋ Ｄ−キシロース ＋

【００３０】シュードモナス・エスピー・No. ９２１の
同定について記載する。すなわち、 １）主性状 グラム陰性の桿状細菌で極毛で運動する。グルコースを
酸化的に分解し酸を産生する。オキシダーゼ非産生。カ
タラーゼ産生。ＤＮＡのＧＣ mol％は６４．５±１．０
％。主たるキノンはＱ₈ 。

【００３１】２）同定 No. ９２１は好気性のグラム陰性桿状細菌で運動性（極
毛）があることから、Pseudomonas 科のPseudomonas
属、Xanthomonas 属およびGluconobacter 属のいずれか
に属する。各属の鑑別表を記する。

【００３２】 No. 921 Pseudomonas Xanthomonas Gluconobacter 色素産生 Ｗ Ｗ，Ｇ，Ｙ Ｙ Ｗ オキシダーゼ − ＋（−） − − カタラーゼ ＋ ＋ ＋ ＋ pH4.5 での生育 − − − − キノン Ｑ₈ Ｑ_8,9,10 Ｑ₈ Ｑ₁₀ DNA のGCmol ％ 64.5 58〜70 63〜71 56〜64 Ｗ：白色、 Ｇ：灰色、 Ｙ：黄色

【００３３】No. ９２１はｐＨ４．５での生育性、色素
産生性、キノン型により Pseudomonas属に属するものと
同定した。ＤＮＡのＧＣ mol％が６４±５％の菌種を選
んで諸性状を対比したが、性状がよく一致する菌種の記
載はなく種の確定はできなかった。よってNo. ９２１
を、 Pseudomonas sp. No.９２１と命名し、工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した。

【００３４】上記フルクトキナーゼＴを製造する方法に
ついて説明する。先ずシュードモナス属に属するフルク
トキナーゼＴ生産菌が適当な培地で培養される。

【００３５】前記のフルクトキナーゼＴ生産菌の代表例
としては、前記のシュードモナス・エスピー・No. ９２
１が挙げられる。細菌の一般的性状として菌学上の性質
は自然にまたは人工的に変異し得るものである。従って
自然的にあるいは、通常行われる紫外線照射、放射線照
射または変異誘導剤、たとえばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアジニンまたはエチルメタンスルホネ
ートなどを用いる人工的変異手段により本菌株を変異さ
せて得られる人工変異株は勿論、自然変異株も含めシュ
ードモナス属に属し、採取し得る量でフルクトキナーゼ
Ｔを生産する能力を有する変異株または変種はすべて本
発明に使用することができる（これらを総括して本細菌
と記すこともある）。

【００３６】前記の培養は、細菌の培養に一般的に用い
られる条件によって行うことができる。培地としては、
本細菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに
必要に応じて無機塩などを含有させた栄養培地が使用さ
れる。

【００３７】本細菌が同化し得る炭素源としては、グル
コース、フルクトース、サッカロースおよびマンノース
などが単独、または組み合わせて用いられる。本細菌が
同化し得る窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵母エ
キスおよびマルトエキスなどが単独、または組み合わせ
て用いられる。その他、必要に応じて無機塩、金属塩な
どが使用される。前記以外に本細菌が同化し得る炭素
源、同化し得る窒素源が使用できることは言うまでもな
い。

【００３８】培養は通常、振とうまたは通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気
攪拌培養が好ましい。培養温度はフルクトキナーゼＴ生
産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得
るが、通常は１５〜３２℃、特に２８℃付近が好まし
い。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最
高力価に達する時期を見計らって適当な時間に培養を停
止すればよく、通常は１〜２日間程度である。発泡があ
るときにはシリコン油などの消泡剤が適宜使用される。

【００３９】フルクトキナーゼＴは、一般にこの様にし
て得られた本細菌の主として菌体内に含有されているの
で、得られた培養液から濾過または遠心分離等の常法に
よって集菌し、これらの菌体を超音波処理、フレンチプ
レス処理、ガラスビーズ処理等の機械的破壊手段やリゾ
チーム等の酵素的溶解等の種々の方法を適宜単独、ある
いは組み合わせて粗製のフルクトキナーゼＴ含有液が得
られる。次に、このフルクトキナーゼＴ含有液から公知
の蛋白質、酵素の精製手段を用いることにより精製され
たフルクトキナーゼＴを得ることができる。たとえば粗
製のフルクトキナーゼＴ含有液に硫安を添加して硫安沈
殿により本酵素を回収し、さらにその後必要に応じて分
子篩、各種クロマトグラフィー法を適宜組み合わせて精
製すればよい。こうして得られた精製酵素は、必要に応
じてサッカロースおよびマンニトールなどの糖類、牛血
清アルブミンなどの蛋白質類等の安定化剤が添加され、
凍結乾燥によりフルクトキナーゼＴの粉体を得ることが
できる。

【００４０】本発明において生成したフルクトースにフ
ルクトースキナーゼＴを作用させた後、公知の反応系を
組み合わせることができる。それには、例えば次のよう
な反応系がある。

【００４１】この反応ではＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を波
長３４０ｎｍでの吸光度の上昇として測定することがで
きる。上述の反応系を組み合わせた場合、反応速度論的
な分析を吸光度の上昇反応でアミラーゼを測定すること
ができ、しかも無機リンを添加する必要がない。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４３】実施例１ まず次のような２種類の試薬を調製する。 第１試薬 HEPES 緩衝液 100mM （ｐＨ７．２） Cacl₂ 2mM Nacl 20mM NAD 5mM ATP-2Na 10mM グルコアミラーゼ 200U/ml α−グルコシダーゼ 30U/ml フルクトキナーゼＴ 20U/ml Phoshoglconate Isomerase 5U/ml Glucose-6-phosphote Dehydrogmase 5U/ml

【００４４】 第２試薬 HEPES 緩衝液 100mM （ｐＨ７．２） IPG₇F 5mM （注）HEPES ＝N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-etha
nesulfonic acid IPG₇F ＝イソプロピリデン・マルトヘプタオシル・フル
クシド

【００４５】これらの試薬を用いて本発明の方法による
α−アミラーゼの反応性を調べた。それには、まず第１
試薬２０ｍｌに検体としてアミラーゼが約３００単位／
リットルの標準血清を５０μｌ加えて３７℃で５分間予
備加温した。そのあと第２試薬０．５ｍｌを加えて混和
し、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結
果は第１図のようになり、本発明の方法は反応が直線的
に進行することが判った。

【００４６】実施例２ 実施例１と同様な操作で検体に精製アミラーゼ（１００
単位・ｌ）の希釈系列を用いて長３４０ｎｍでの１分間
当たりの吸光度変化量（ΔＡＢＳ／min)を測定した。そ
の結果は第２図のようになり、本発明の方法では検量線
が原点を通る直線となることが判った。

【００４７】実施例３ 本発明方法と従来法である合成基質Ｂ−Ｇ₇ −ＰＮＰ法
（市販品キット「ＡＭＹ試薬・Ｃ」国際試薬製造）とを
比較した。それには検体としてヒト血清を１０例用い、
本発明方法は実施例１と同様な操作で波長３４０ｎｍで
の１分間当たりの吸光度変化量を測定し、これを標準液
を用いて作成した検量線よりα−アミラーゼの活性値に
換算した。またＢ−Ｇ₇ −ＰＮＰ法はキットの添付文書
に示された方法に従った。

【００４８】その結果は表１に示す通りであり、相関係
数γ＝０．９８９７で両者はよく相関することが判っ
た。

【００４９】

【表１】

【００５０】参考例１ 〔シュードモナス・エスビー・No.921の培養]ポリペプ
トン１％、酵母エキス０．５％、カザミノ酸１％、マル
トエキス１％、マンノース１％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．３％
およびＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５％を含む液体培
地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを、５００ｍｌ容三角フラ
スコ２０本に分注し、１２０℃で２０分間加熱減菌した
後、これにシュードモナス・エスビー・No.921の菌体１
白金耳を接種し、２８℃で１２０ｒ．ｐ．ｍ．の振とう
培養器で４０時間培養し、酵素活性０．１Ｕ／ｍｌの培
養物１．９Ｌを得た。

【００５１】参考例２ 〔酵素の分離精製〕参考例１で得られた培養液１．９Ｌ
を遠心分離して集菌し、得られた菌体を２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液１Ｌ（ｐＨ８．０）で一回洗浄した。洗浄し
た菌体を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸
濁して５０ｍｌに調製し、クボタ社製の超音波破砕器(I
NSONATOR 201M)を用いて１８０Ｗ、１０分間で破砕して
破砕液を得た。この破砕液から１５，０００ｒ．ｐ．
ｍ．、２０分間の遠心分離で４２ｍｌ（酵素活性３．５
Ｕ／ｍｌ）の上清を得た。この上清に硫安１１ｇを溶解
し、生じた沈殿物を遠心分離して除去し、得られた上清
に再び硫安８ｇを溶解し、生じた沈殿物を遠心分離し、
得られた沈殿物を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍｌで溶解し、これを透析チューブを用いて２
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２リットルに対
して１晩透析し、２５ｍｌの酵素液（酵素活性４．７Ｕ
／ｍｌ）を得た。得られた酵素液を２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）５０ｍｌのカラム
に通し、０．２Ｍ塩化カリを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）１Ｌを流し、次いで０．３Ｍ KCl
を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出
し、酵素液１００ｍｌ（酵素活性１．２Ｕ／ｍｌ）を得
た。得られた酵素液を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
６．５）５リットルに対して一晩透析した。透析して得
た酵素液を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で
緩衝化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製）５ｍｌのカラムに通し、通過液１１０ｍｌ（酵
素活性１．０Ｕ／ｍｌ）を得た。この通過液中にはコン
タミ酵素としてのヘキソキナーゼ、ＮＡＤＨオキシダー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼが全く存在しなかった。この
通過液をアミコンセントリフローＣＦ２５（アミコン社
製）を用いて濃縮し、２ｍｌ（酵素活性５４Ｕ／ｍｌ）
の酵素液を得た。

【００５２】

【発明の効果】本発明は新規な酵素であるフラクトキナ
ーゼＴを用いたものアルラーゼの測定方法であり、当該
酵素を公知の反応系を組み合わせることにより、α−ア
ミラーゼの測定を正確に精度よく実施することができ
る。

【００５３】即ち、本発明の方法においては、試料中の
グルコースの影響を受けず、また波長３４０ｎｍを選択
することにより試料中のビリルビンやヘモグロビンの影
響を受けることもない。さらに吸光度の上昇反応を採用
することにより、測定範囲を広くとることができる。

【００５４】また、本発明方法は無機リンの添加が不要
であるため、α−アミラーゼの活性化剤であるカルシウ
ムイオンを添加しても沈殿ができるトラブルもなく臨床
検査における自動分析装置へも適応できる。このよう
に、本発明は臨床検査の分野に有用な方法として提供で
きる効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法の反応性を示したグラフである。

【図２】本発明の方法の検量線を示したグラフである。

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【手続補正書】

【提出日】平成３年１０月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５２】

【発明の効果】本発明は新規な酵素であるフラクトキナ
ーゼＴを用いたα−アミラーゼの測定方法であり、当該
酵素を公知の反応系を組み合わせることにより、α−ア
ミラーゼの測定を正確に精度よく実施することができ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 【化１】 （式中、Ａは式 【化２】 または式 【化３】 で表される基を、ｎは４〜１５の整数を、Ｒ₁ 〜Ｒ₄ は
   それぞれ水素原子、低級アルキル基、または−（ＣＨ₂)
   _m ＣＯＯＭ（ｍは０、１または２、Ｍは水素原子または
   アルカリ金属を示す）を、Ｘ₁ 〜Ｘ₄ はそれぞれＯまた
   はＳを、Ｚ₁ およびＺ₂ はそれぞれ水素原子またはリン
   酸基を表わす）で表される少なくとも一種のマルトオリ
   ゴ糖と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触させて生
   じたフルクトースにフルクトキナーゼＴを作用させ、生
   じた成分を測定することを特徴とするα−アミラーゼ測
   定方法。